CN111044493A - 一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法。本发明属于免疫学检测领域。本发明是要解决现有的用于生物检测的纳米材料对生物体有光损伤和检测背景信号干扰高的技术问题。该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫和吸收垫组成；其中结合垫是负载有结合抗体的下转换α‑NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α‑NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针。本发明的测流试纸条，其检测线性范围也较宽，具有很强的适用性。对待测样品的体积要求少，检测所需时间短，能够实现床边检测，因此灵活性较强；不需要专业的人员进行操作，可用于医疗检测中。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测领域。具体涉及对血清标记物进行检测的侧流试纸条及其制备和使用方法。
背景技术
近年来，随着移动医疗和家庭医疗的不断发展，研究者们不断寻求新型的发光材料作为光学探针，以获取更高灵敏度和稳定性的测试方法。如今，人们已经可以对血清中的各种疾病标记物进行检测，包括心梗标记物(CTNI和MYO)；细菌病毒感染标记物(CRP、SAA和PCT)；糖尿病标记物(糖化血红蛋白)；术前感染性疾病标记物(HIV、梅毒、乙肝和丙肝)等。其中，基于纳米金颗粒的检测方法发展较快，已经在孕检和感染检测等领域得到了快速的应用。但基于纳米金颗粒的检测方法存在明显的缺点：灵敏度低，属于半定量检测。荧光微球和量子点的使用提高了检测方法的灵敏度，并实现了定量化检测，但测试过程中荧光背景信号高，限制了其在低浓度待测物检测中的应用。稀土发光纳米晶材料，具有较大的反stoke发光位移，发射光谱窄，可实现多指标多重检测；无光漂白性，发光稳定性好，可多次重复检测。而稀土掺杂纳米晶具有不同荧光寿命的近红外区生物相容性，CaF2作为壳层材料，与核的晶格失配低，光学透明性的光谱范围广，在水环境中具有很高的稳定性。因为它的成分(钙离子和氟离子)是骨和牙齿的共同组成部分，这可以提高产生的核心/外壳纳米晶的生物相容性。稀土下转换发光是指稀土离子吸收一个高能光子后辐射一个或多个低能光子的发光现象。下转换稀土纳米颗粒常应用于生物方面，例如多分子免疫检测、生物成像等。
发明内容
本发明是要解决现有的用于生物检测的纳米材料对生物体有光损伤和检测背景信号干扰高的技术问题，而提供一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法。
本发明中的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫和吸收垫组成；
其中检测垫是由硝化纤维膜及平行画在硝化纤维膜上的检测线和控制线组成；检测线是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；控制线是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；
结合垫是负载有结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针；其中α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4是以CaF2/NaLnF4为壳、以α-NaLnF4：Nd,Yb为核的核壳结构纳米晶，α-NaLnF4：Nd,Yb是用Yb和Nd掺杂的α-NaLnF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd的掺杂摩尔百分数为10％～90％；Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素；
检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板的中部，在检测垫的检测线一侧，结合垫与检测垫搭接，样品垫与结合垫搭接；在检测垫的控制线一侧，吸收垫与检测垫搭接，结合垫、样品垫和吸收垫也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板上。
制备上述的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的方法，按以下步骤进行：
一、制备核α-NaLnF4：Nd,Yb，其中Ln＝Y、Gd或Lu，所述α-NaLnF4：Nd,Yb中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％：
a、按照α-NaLnF4：Nd,Yb的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取核稀土氧化物、氧化镱、氧化钕和三氟乙酸钠；所述核稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥；
b、将核稀土氧化物、氧化镱和氧化钕溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至80～100℃，并在该温度下保持50min～70min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
c、将三氟乙酸钠和步骤b得到的RE(TFA)3混合于容器中，然后加入油酸(OA)，油氨(OM)和十八烯(ODE)，加热至100～130℃，并在该温度下保持20min～40min，以除去其中的水和氧气，再加热至300～320℃，并在该温度下保持30min～50min，然后在氩气气氛下冷却至室温；
d、将步骤c得到的液体转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到α-NaLnF4:Yb,Nd，将α-NaLnF4:Yb,Nd分散在正己烷中，得到α-NaLnF4:Yb,Nd分散液；
二、制备核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4，其中Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素：
e、将氧化钙或壳稀土氧化物溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90～100℃下加热50min～70min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；所述壳稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥；
f、待容器底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaLnF4:Yb,Nd分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，并在该温度下保持30min～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到300～320℃，并在该温度下保持60min～90min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到核壳结构α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4，将核壳结构α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散在正己烷中，得到α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散液；
三、组装稀土下转换发光探针：
h、将α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散液和硝基四氟硼酸铵(NOBF4)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液混合振荡，得到混合液，然后向混合液中加入正己烷和甲苯，静置5min～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液；
i、向步骤h得到的α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液中加入聚丙烯酸(PAA)，加热到80～100℃，并在该温度下保持30min～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向步骤i得到的PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入碳二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液，在温度为37℃的条件下反应4h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液；
l、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2h～4h，干燥，得到样品垫；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、步骤三(k)得到的结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液、步骤三(l)得到的结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液，将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡2h～4h，然后在45～50℃的条件下干燥，得到结合垫；
o、用1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1mm～1.2mm的画线，得到检测线；再用1mg/mL～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线的宽度是1mm～1.2mm的画线，得到控制线，得到检测垫；
p、将检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板的中部，在检测垫的检测线一侧，将结合垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上，并使结合垫与检测垫搭接，样品垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使样品垫与结合垫搭接；在检测垫的控制线一侧，将吸收垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使吸收垫与检测垫搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
进一步限定，步骤一(b)中所述核稀土氧化物、氧化镱与氧化钕的总的物质的量与三氟乙酸(TFA)水溶液的体积的比为0.5mmol：(8～12)mL。
进一步限定，步骤一(c)中所述RE(TFA)3的物质的量与OA的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与OM的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与ODE的体积比为0.5mmol：(12～15)mL。
进一步限定，步骤一(d)中所述α-NaLnF4：Nd,Yb分散液中α-NaLnF4：Nd,Yb的浓度为0.05mmol/mL～0.1mmol/mL。
进一步限定，步骤一(d)中所述离心分离是在转速为6000rpm～8000rpm的条件下离心5min～10min。
进一步限定，步骤二(e)中所述氧化钙的物质的量与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(5～10)mL；所述壳稀土氧化物与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(20～30)mL。
进一步限定，步骤二(f)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与OA的体积的比为1mmol：(10～30)mL；α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与ODE的体积的比为1mmol：(10～30)mL。
进一步限定，步骤二(g)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4的浓度为0.05mmol/mL。
进一步限定，步骤二(g)中所述离心分离是在转速为6000rpm～8000rpm的条件下离心5min～10min。
进一步限定，步骤三(h)中所述NOBF4的DMF溶液的浓度为1mg/mL～2mg/mL。
进一步限定，步骤三(h)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散液中的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4物质的量与NOBF4的质量比为1mmol：(50～100)mg。
进一步限定，步骤三(h)中所述混合液、正己烷与甲苯的体积比为1：(1～1.1)：(1～1.1)。
进一步限定，步骤三(i)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4的DMF分散液中的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4与PAA的摩尔比为1：(50～60)。
进一步限定，步骤三(j)中所述PAA包覆的纳米晶的水分散液中PAA包覆的纳米晶与EDC的摩尔比为1：(120～130)；PAA包覆的纳米晶的水分散液中PAA包覆的纳米晶与NHS的摩尔比为1：(25～35)。
进一步限定，步骤三(k)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)。
进一步限定，步骤三(k)中所述结合抗体的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液中结合抗体的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶的浓度为2mg/mL～3mg/mL。
进一步限定，步骤三(l)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60。
进一步限定，步骤三(l)中所述结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液中结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶的浓度为2mg/mL～3mg/mL。
进一步限定，步骤三中所述离心分离是在转速为10000rpm的条件下离心10min。
进一步限定，步骤四(m)中所述混合溶液中，S9表面活性剂的质量浓度为0.4％～0.6％，酪蛋白的质量浓度为0.05％～0.06％，PVP-K30的质量浓度为0.3％～0.4％，Tween-20的质量浓度为0.05％～0.06％。
进一步限定，步骤四(m)中所述Tris缓冲液是浓度为20mmol/L、pH＝8.0的缓冲液。
进一步限定，步骤四(n)中所述探针溶液中，蔗糖的质量浓度为1％～1.2％，结合抗体的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液的体积浓度为10％～50％，结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的体积浓度为10％～30％。
本发明的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法是：
将血清样品用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50μL～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10min～20min，然后通过800nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在980nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测得的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度；其中所述血清样品与Tris缓冲溶液的体积的比为(2～3)：1。
本发明通过Yb和Nd的稀土元素掺杂，合成了NaLnF4:Yb,Nd(六角相)纳米晶，固定激发波段为980nm，利用Nd→Yb的能量传递方式，在选择Yb和Nd的掺杂浓度范围内，在800nm激发下Yb位于980nm的发射强度达到应用要求，然后通过在纳米晶表面包覆一层CaF2壳层，避免了由于稀土纳米晶存在表面缺陷及外界环境中的分子对稀土纳米晶的下转换发光产生不同程度的淬灭作用的影响，得到高亮度发光的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4稀土下转换发光纳米晶，获得了良好的发光效果。
本发明的近红外激发和发射的下转换发光材料α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4表面含有大量油酸配体，利用PAA所含有的多个羧基，将油酸修饰的纳米晶由油溶性转变成水溶性，然后通过EDC/NHS对纳米晶表面裸露的羧基进行活化处理，使羧基与抗体的氨基基团进行共价连接，从而使抗体或鼠IgG连接到纳米晶上，得到了结合抗体的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4纳米晶探针。与相应的血清标记物抗体进行组装得到发光探针，实现了血清标记物(肌红蛋白、肌钙蛋白、降钙素原、糖化血红蛋白、HIV、乙肝和丙肝等)检测方法的激发和发射光谱均位于近红外区域。
利用抗体结合的下转换纳米晶探针和鼠IgG结合的下转换纳米晶探针组装成双抗体夹心侧流试纸条，该试纸条的吸收垫通过虹吸作用促进样品的流速，使试剂能够跨过膜运输，在实际血清标记物检测时，需将一定量的血清样品滴加到样品垫上，经过一定时间孵化后，使用800nm的激光对检测垫上的检测线部分进行照射，同时使用检测器对样品的发光进行检测。本发明的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4系列的纳米晶的激发和发射光谱调制到近红外区域，将其与相应的血清标记物抗体进行交联组装后，得到激发和发射光谱均位于近红外区的发光探针，减小了对蛋白质等生物分子的热损伤；同时消除了各种生物分子和水分子对检测结果的干扰，实现了检测体系的零背景信号干扰，通过与侧流试纸条技术联用，实现了对多种血清标记物(肌红蛋白、肌钙蛋白、降钙素原、糖化血红蛋白、HIV、乙肝和丙肝等)的高灵敏实时检测。
以本发明的近红外激发和发射的下转换发光材料制备的测流试纸条，其检测线性范围是0.05ng/mL～50ng/mL，检测限为0.02ng/mL，线性范围也较宽，具有很强的适用性。对待测样品的体积要求少，检测所需时间短，能够实现床边检测，因此灵活性较强；不需要专业的人员进行操作，可用于医疗检测中。
附图说明
图1是本发明的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的结构示意图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板1、检测垫2、结合垫3、样品垫4和吸收垫5组成；
其中检测垫2是由硝化纤维膜2-1及平行画在硝化纤维膜上的检测线2-2和控制线2-3组成；检测线2-2是用浓度为2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1mm，滴加体积量是1μL/cm；控制线2-3是用浓度为2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1mm，滴加体积量是1μL/cm；
结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针；其中α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2是以CaF2为壳、以α-NaYF4:10％Yb,30％Nd为核的核壳结构纳米晶，α-NaYF4:10％Yb,30％Nd是用Yb和Nd掺杂的α-NaYF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％，Nd的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaYF4:10％Yb,30％Nd；
检测垫2粘贴在聚氯乙烯支撑背板1的中部，在检测垫2的检测线2-2一侧，结合垫3与检测垫2搭接，样品垫4与结合垫3搭接；在检测垫2的控制线2-3一侧，吸收垫5与检测垫2搭接，结合垫3、样品垫4和吸收垫5也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上。
制备上述基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的方法按以下步骤进行：
一、制备核α-NaYF4:Yb,Nd，其中α-NaYF4:Yb,Nd中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaYF4:10％Yb,30％Nd：
a、按照α-NaYF4:10％Yb,30％Nd的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取0.0677g的Y2O3、0.0197g的Yb2O3、0.0505g的Nd2O3和2mmol的三氟乙酸钠；
b、将Y2O3、Yb2O3和Nd2O3溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至90℃，并在该温度下保持60min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
c、将2mmol的三氟乙酸钠和步骤b得到的RE(TFA)3混合于烧瓶中，然后加入8mL的油酸(OA)，12mL的油氨(OM)和12mL的十八烯(ODE)，加热至120℃，并在该温度下保持30min，以除去其中的水和氧气，再加热至300℃，并在该温度下保持30min，然后在氩气气氛下冷却至室温；
d、将步骤c得到的液体转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再在转速为6000rpm的条件下离心5min，离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作3次，得到α-NaYF4:10％Yb,30％Nd，将α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散在10mL的正己烷中，得到α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散液；所述α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散液中α-NaYF4:10％Yb,30％Nd的摩尔数为0.5mmol；
二、制备核壳结构α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2：
e、将2mmol的氧化钙溶于10mL的体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90℃下加热60min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸钙的前驱体(Ca(TFA)2)；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散液、7mL的OA和7mL的ODE，在氩气保护下加热到120℃，并在该温度下保持30min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到310℃，并在该温度下保持60min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再在转速为6000rpm的条件下离心5min，离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作3次，得到核壳结构α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2，将核壳结构α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2分散在10mL的正己烷中，得到α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2分散液；
三、组装稀土下转换发光探针：
h、将2mL的α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2分散液和5mL浓度为1mg/mL的NOBF4的DMF溶液混合振荡，得到混合液，然后向混合液中加入7mL的正己烷和7mL的甲苯，静置5min后，再在转速为10000rpm的条件下离心10min，离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在5mL的DMF中，得到α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2的DMF分散液；
i、向步骤h得到的α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2的DMF分散液中加入300mg的PAA，加热到90℃，并在该温度下保持50min，然后加入10mL丙酮，静置后在转速为10000rpm的条件下离心10min，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向步骤i得到的PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入1mL浓度为1mol/L的EDC溶液和0.25mL浓度为1mol/L的NHS溶液，在温度为37℃的条件下反应4h，然后在转速为10000rpm的条件下离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入PCT抗体溶液，所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与PCT抗体的摩尔比为1：60，在温度为37℃的条件下反应6h，然后在转速为10000rpm的条件下离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到结合PCT抗体的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针的水分散液；
l、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在温度为37℃的条件下反应6h，然后在转速为10000rpm的条件下离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以浓度为20mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液为溶剂，以质量浓度为0.5％的S9表面活性剂、质量浓度为0.05％的酪蛋白、质量浓度为0.3％的PVP-K30、质量浓度为0.05％的Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡3h，干燥，得到样品垫；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以质量浓度为1％的蔗糖、体积浓度为30％的步骤三(k)得到的结合PCT抗体的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针的水分散液、体积浓度为20％的步骤三(l)得到的结合鼠IgG的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液，将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡2h，然后在45℃的条件下干燥，得到结合垫3；
o、用浓度为2mg/mL的PCT抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm在硝化纤维膜2-1上画出宽度为1mm的画线，得到检测线2-2；再用浓度为2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm在硝化纤维膜2-1上画出平行于检测线2-2的宽度为1mm的画线，得到控制线2-3，得到检测垫2；
p、将检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板的中部，在检测垫的检测线一侧，将结合垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上，并使结合垫与检测垫搭接，样品垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使样品垫与结合垫搭接；在检测垫的控制线一侧，将吸收垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板上并使吸收垫与检测垫搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
上述基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法具体步骤如下：
将血清样品用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取100μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置15min，然后通过800nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在980nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测得的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度；其中所述血清样品与Tris缓冲溶液的体积的比为7：3。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：
Ⅰ、产品部分不同的是：结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针。
Ⅱ、制备方法部分不同的是：
一、制备核α-NaGdF4:Yb,Nd，其中α-NaGdF4:Yb,Nd中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd：
a、按照α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取0.0181g的Gd2O3、0.0197g的Yb2O3、0.0505g的Nd2O3和2mmol的三氟乙酸钠；
b、将Gd2O3、Yb2O3和Nd2O3溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至90℃，并在该温度下保持60min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：
Ⅰ、产品部分不同的是：结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd@CaF2纳米晶探针。
Ⅱ、制备方法部分不同的是：
一、制备核α-NaLuF4:Yb,Nd，其中α-NaLuF4:Yb,Nd中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd：
a、按照α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取0.0199g的Lu2O3、0.0197g的Yb2O3、0.0505g的Nd2O3和2mmol的三氟乙酸钠；
b、将Lu2O3、Yb2O3和Nd2O3溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至90℃，并在该温度下保持60min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：
Ⅰ、产品部分不同的是：结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@NaYF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@NaYF4纳米晶探针。
Ⅱ、制备方法部分不同的是：
二、制备核壳结构α-NaYF4:10％Yb,30％Nd@NaYF4：
e、将0.5mmol氧化钇溶于10mL的体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90℃下加热60min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散液、7mL的OA和7mL的ODE，在氩气保护下加热到140℃，并在该温度下保持40min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到320℃，并在该温度下保持60min，停止反应；
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：
Ⅰ产品部分不同的是：结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd@NaGdF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd@NaGdF4纳米晶探针。
Ⅱ、制备方法部分不同的是：
一、制备核α-NaGdF4:Yb,Nd，其中α-NaGdF4:Yb,Nd中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd：
a、按照α-NaGdF4:10％Yb,30％Nd的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取0.0181g的Gd2O3、0.0197g的Yb2O3、0.0505g的Nd2O3和2mmol的三氟乙酸钠；
b、将Gd2O3、Yb2O3和Nd2O3溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至90℃，并在该温度下保持60min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
二、制备核壳结构α-NaGdF4:30％Yb,10％Nd@NaGdF4：
e、将0.5mmol氧化钆溶于10mL的体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90℃下加热60min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaYF4:10％Yb,30％Nd分散液、7mL的OA和7mL的ODE，在氩气保护下加热到140℃，并在该温度下保持40min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到320℃，并在该温度下保持60min，停止反应；
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：
Ⅰ产品部分不同的是：结合垫3是负载有结合PCT抗体的下转换α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd@NaLuF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd@NaLuF4纳米晶探针。
Ⅱ、制备方法部分不同的是：
一、制备核α-NaLuF4:Yb,Nd，其中α-NaLuF4:Yb,Nd中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为30％，记为α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd：
a、按照α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取0.0199g的Lu2O3、0.0197g的Yb2O3、0.0505g的Nd2O3和2mmol的三氟乙酸钠；
b、将Lu2O3、Yb2O3和Nd2O3溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至90℃，并在该温度下保持60min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
二、制备核壳结构α-NaLuF4:30％Yb,10％Nd@NaLuF4：
e、将0.5mmol氧化镥溶于10mL的体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90℃下加热60min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaLuF4:10％Yb,30％Nd分散液、7mL的OA和7mL的ODE，在氩气保护下加热到140℃，并在该温度下保持40min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到320℃，并在该温度下保持60min，停止反应；
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
Claims (10)
1.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条，其特征在于该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板(1)、检测垫(2)、结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)组成；
其中检测垫(2)是由硝化纤维膜(2-1)及平行画在硝化纤维膜(2-1)上的检测线(2-2)和控制线(2-3)组成；检测线(2-2)是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；控制线(2-3)是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；
结合垫(3)是负载有结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针；其中α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4是以CaF2/NaLnF4为壳、以α-NaLnF4：Nd,Yb为核的核壳结构纳米晶，α-NaLnF4：Nd,Yb是用Yb和Nd掺杂的α-NaLnF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd的掺杂摩尔百分数为10％～90％；Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素；
检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-3)一侧，吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上。
2.如权利要求1所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：
一、制备核α-NaLnF4：Nd,Yb，其中Ln＝Y、Gd或Lu，所述α-NaLnF4：Nd,Yb中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％：
a、按照α-NaLnF4：Nd,Yb的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取核稀土氧化物、氧化镱、氧化钕和三氟乙酸钠；所述核稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥；
b、将核稀土氧化物、氧化镱和氧化钕溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至80～100℃，并在该温度下保持50min～70min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)；
c、将三氟乙酸钠和步骤b得到的RE(TFA)3混合于容器中，然后加入油酸(OA)，油氨(OM)和十八烯(ODE)，加热至100～130℃，并在该温度下保持20min～40min，以除去其中的水和氧气，再加热至300～320℃，并在该温度下保持30min～50min，然后在氩气气氛下冷却至室温；
d、将步骤c得到的液体转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到α-NaLnF4:Yb,Nd，将α-NaLnF4:Yb,Nd分散在正己烷中，得到α-NaLnF4:Yb,Nd分散液；
二、制备核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4，其中Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素：
e、将氧化钙或壳稀土氧化物溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90～100℃下加热50min～70min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；所述壳稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥；
f、待容器底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaLnF4:Yb,Nd分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，并在该温度下保持30min～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到300～320℃，并在该温度下保持60min～90min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4，将核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散在正己烷中，得到α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散液；
三、组装稀土下转换发光探针：
h、将α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散液和硝基四氟硼酸铵(NOBF4)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液混合振荡，得到混合液，然后向混合液中加入正己烷和甲苯，静置5min～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液；
i、向步骤h得到的α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液中加入聚丙烯酸(PAA)，加热到80～100℃，并在该温度下保持30min～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向步骤i得到的PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入碳二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液，在温度为37℃的条件下反应4h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液；
l、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2h～4h，干燥，得到样品垫(4)；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、步骤三(k)得到的结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液、步骤三(l)得到的结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液，将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡2h～4h，然后在45～50℃的条件下干燥，得到结合垫(3)；
o、用1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜(2-1)上画出宽度为1mm～1.2mm的画线，得到检测线(2-2)；再用1mg/mL～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜(2-1)上画出平行于检测线(2-2)的宽度为1mm～1.2mm的画线，得到控制线(2-3)，得到检测垫(2)；
p、将检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，将结合垫(3)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上，并使结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-3)一侧，将吸收垫(5)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
3.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤一(b)中所述核稀土氧化物、氧化镱与氧化钕的总的物质的量与三氟乙酸(TFA)水溶液的体积的比为0.5mmol：(8～12)mL。
4.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤一(c)中所述RE(TFA)3的物质的量与OA的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与OM的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与ODE的体积比为0.5mmol：(12～15)mL。
5.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤二(e)中所述氧化钙的物质的量与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(5～10)mL；所述壳稀土氧化物与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(20～30)mL。
6.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤二(f)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与OA的体积的比为1mmol：(10～30)mL；α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与ODE的体积的比为1mmol：(10～30)mL。
7.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(h)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散液中的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4物质的量与NOBF4的质量比为1mmol：(50～100)mg。
8.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(k)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)。
9.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(l)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60。
10.如权利要求1所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法，其特征在于，该使用方法具体步骤如下：
将血清样品用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50μL～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10min～20min，然后通过800nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在980nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测得的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度；其中所述血清样品与Tris缓冲溶液的体积的比为(2～3)：1。
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