CN111308103A - 心肺五联检测试剂盒及其稀土纳米荧光检测卡和检测方法 - Google Patents

心肺五联检测试剂盒及其稀土纳米荧光检测卡和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种心肺五联检测试剂盒及其稀土纳米荧光检测卡和检测方法，能够准确定量检测人血液中cTnI/CKMB/Myo/D‑Dimer/NT‑proBNP的含量，利用稀土纳米荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，荧光微球为稀土氟化物近红外二区发光纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可帮助医生在早期准确地诊断心肺功能。

Description

心肺五联检测试剂盒及其稀土纳米荧光检测卡和检测方法
技术领域
本发明涉及一种心肺五联检测试剂盒及其稀土纳米荧光检测卡和检测方法。
背景技术
肌钙蛋白(Troponin)由肌钙蛋白I、T、C三亚基构成，它们和原肌球蛋白一起通过调节Ca2+对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持6-10天，提供了较长的检测期。心肌肌钙蛋白I(cTnI)具有高度的心肌特异性和灵敏度，所以已成为目前较理想的心肌梗死标志物。
肌红蛋白(Myoglobin，Myo)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质。胸痛发作后最快2小时即可出现升高；严重的充血性心力衰竭和心脏外科手术病人，由于存在心肌损伤，所以也会升高。肌红蛋白是诊断急性心肌梗塞的敏感指标，所以肌红蛋白成为目前心肌梗死标志物之一。
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)有四种同工酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)，其中MB型主要存在于心肌细胞中。心肌梗死时，肌酸激酶在发病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常，其中肌酸激酶同工酶CK-MB诊断特异性较高，所以其成为目前心肌梗死标志物之一。
D-二聚体(D-Dimer)是交联纤维蛋白经纤溶酶水解后的一种特异性性降解产物，对于诊断和治疗纤溶系统疾病(DIC，各种血栓)及与纤溶系统有关疾病，以及溶栓治疗监测，有着重要的意义。纤维蛋白降解产物D的水品升高，表明体内存在着频繁的纤维蛋白降解过程。因此，纤维D二聚体是深静脉血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。
BNP隶属于钠尿肽家族，是一种肽类激素，具有利尿、利钠、抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统、舒张血管和降低血压等作用，并参与人体水盐平衡的调节。而NT-proBNP则是BNP形成过程中所产生的无生物活性的氨基酸片段。正常人体内NT-proBNP水平极低，当因容量负荷引起心室压力的改变以及室壁张力的增加时，就会刺激BNP分泌，因此血液中BNP/NT-proBNP浓度的升高能很好地反映心室结构和功能的改变，心脏有无损伤及损伤程度。大量基础和临床研究表明，BNP/NT-proBNP是心功能紊乱最敏感和最特异的指标，是诊断心力衰竭的一个具有划时代意义的客观标志物，与美国纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级比较，能更真实反映心功能的变化，有利于在早期阶段或病变轻微阶段发现心衰，区分无症状或者症状轻微的心衰患者(NYHAI级和II级)与非心衰患者。对于慢性心衰患者的危险分层及预后评估，心衰治疗效果的监测等也有很好指导意义
cTnI、CK-MB、Myo是诊断急性心肌梗死(acute my℃ardial infarction，AMI)的早期较佳的高特异性指标，而NT-proBNP、cTnI是诊断急性冠脉综合征(acute coronarysyndromes，ACS)的有效指标且与ACS的病变严重程度有一定的相关性。cTnI、NT-proBNP对慢性心力衰竭(CHF)的诊断具有较高特异性，同时，NT-proBNP、cTnI、D-Dimer在对肺栓塞(PE)诊断具有较高的临床诊断意义，因此，本发明五项指标的联合检测则更有助于早期准确地诊断心肺功能，根据有临床指导意义。
现有技术中心脏标志物仅针对单一的指标还有心肌三项cTnI、CK-MB、Myo指标进行检测，心肺五项联合检测较少，另外检测方法主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、胶体金法等。其中胶体金法具有操作简单快速的优点，但灵敏度低且定量不准确；免疫比浊法较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的；免疫荧光法是将cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。
然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，而常用的荧光标记物光谱范围大多在可见光区(400～750nm),使用可见区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低检测的灵敏度。而近红外荧光材料的发射波长范围在650～1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此使用近红外发光的材料来标记抗体会使得荧光试纸条背景荧光低，检测信噪比高，提高检测灵敏度的特点。
另外稀土纳米材料是一种广泛使用的生物标记物，与传统标记物相比，稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物近红外二区发光纳米粒子作为标记物，发光寿命长，发射波长为808nm，可降低试纸条背景荧光同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性。
因此开发一种具有检测范围宽、灵敏度高、能够快速测定血液中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量、检测准确度高的稀土纳米荧光检测卡及采用该检测卡的心肺五联检测试剂盒和检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足和缺陷，提供一种稀土纳米荧光检测卡及采用该检测卡的心肺五联检测试剂盒和检测方法。
实现本发明目的的技术方案是：稀土纳米荧光检测卡，包括卡壳和设置在卡壳内的检测试纸条；所述检测试纸条包括底衬以及沿衬底的长度方向顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫、包被膜和吸水纸；所述样品垫喷涂有微球线；所述微球线为稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体；所述包被膜包括硝酸纤维素膜以及沿长度方向依次平行间隔设置于硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线分别包被cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2和羊抗兔抗体，其中第一检测线靠近样品垫，质控线远离样品垫。
所述样品垫上喷涂的稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体的含量均为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
所述稀土纳米荧光微球为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，
其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为钕(Nd3+)；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；
所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在800～1000nm的激发光源作用下发射出波长范围在1000～1100nm的荧光。
所述硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线的间隔距离为2～4mm。
所述硝酸纤维素膜上的cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2单克隆抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
所述检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤①，合成NaGdxLu1-y-xF4:yNd(钕掺杂氟化钆镥)：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入x份Gd的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，y份钕的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，1-x-y份的Lu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～70％，y的范围为0～30％；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入物质的量之比为1～2：1.6～3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；
步骤②，制备NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4(核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠纳米微球)：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4：0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球；
步骤③，稀土纳米荧光微球的活化：超声波处理荧光微球1～2min后，取荧光微球以12000～14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；
步骤④，制备稀土纳米荧光微球标记cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体：将步骤③活化后的荧光微球超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤⑤制备样品垫：用样品垫处理液在衬底靠近样品垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，在样品垫靠近包被膜的一侧将稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体用微球解离液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述样品垫处理液为含0.5％NaCl、0.5％S17、0.1％BSA、1mg/ml抗RBC抗体的20mM、pH8.0的Tris-HCl；所述微球解离液为含0.5％BSA、25％蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液；
步骤⑥制备包被膜：分别用包被缓冲液将cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线按照间隔2～4mm的方式平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤⑦，在底衬上沿长度方向顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到检测试纸条。
所述卡壳包括卡扣连接的塑料下壳和塑料上壳；所述检测试纸条固定在塑料下壳上，检测试纸条的表面通过塑料上壳压紧；所述塑料上壳上对应样品垫和包被膜的位置分别设有加样孔和观察窗。
本发明还提供心肺五联检测试剂盒，包括稀土纳米荧光检测卡和含有定标曲线的ID卡；所述稀土纳米荧光检测卡采用上述稀土纳米荧光检测卡；所述含有标准曲线的ID卡通过检测试纸条测定梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取稀土纳米荧光检测卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。
上述心肺五联检测试剂盒定量检测cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的方法，包括以下步骤：
步骤一，将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；
步骤二，开启稀土纳米荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应ID卡；
步骤三，精确吸取100μL待测血液加入到检测卡加样孔中；
步骤四，将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。
上述心肺五联检测试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，检测人血清、血浆和全血样本中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量。含cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的血液样本稀释液滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至样品垫，与时间分辨荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1结合，形成微球抗体-抗原复合物，层析至硝酸纤维素膜上检测区，反应复合物被检测线包被的cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2抗体捕获，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，兔IgG与固定在质控线羊抗兔结合。用光源对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米荧光微球发出荧光，信号的强弱与样本中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量成正比，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：本发明的心肺五联检测试剂盒能够准确定量检测人血液中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量，利用稀土纳米荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，荧光微球为稀土氟化物近红外二区发光纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可帮助医生在早期准确地诊断心肺功能。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明的稀土纳米荧光检测卡的结构示意图。
图2为本发明的检测试纸条的结构示意图。
图3为发明的心肺五联检测试剂盒以cTnI质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图4为发明的心肺五联检测试剂盒CKMB质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图5为发明的心肺五联检测试剂盒Myo质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图6为发明的心肺五联检测试剂盒D-Dimer质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图7为发明的心肺五联检测试剂盒NT-proBNP质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制的标准曲线图。
图8为本发明的心肺五联检测试剂盒与罗氏电化学发光法检测NT-proBNP试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
图9为本发明的心肺五联检测试剂盒与贝克曼化学发光法检测cTnI试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
图10为本发明的心肺五联检测试剂盒与贝克曼化学发光法检测Myo试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
图11为本发明的心肺五联检测试剂盒与贝克曼化学发光法检测CKMB试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
图12为本发明的心肺五联检测试剂盒与西门子免疫比浊法检测D-二聚体试剂盒对同一样本的检测结果对比曲线图。
附图中的标号为：
卡壳1、加样孔11、观察窗12；
检测试纸条2、底衬21、样品垫22、包被膜23、吸水纸24。
具体实施方式
(实施例1)
见图1和图2，本实施例的心肺五联检测试剂盒，包括稀土纳米荧光检测卡和含有定标曲线的ID卡。
稀土纳米荧光检测卡包括卡壳1和设置在卡壳1内的检测试纸条2。检测试纸条2包括底衬21以及沿衬底的长度方向顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫22、包被膜23和吸水纸24；样品垫22是加样区，用于吸取待测血液检测样本。样品垫22上喷涂有微球线；微球线为稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体(含量均为100μg抗体/200μl荧光微球)。稀土纳米荧光微球为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为60nm，其组成为：NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为钕(Nd3+)；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在1064nm的荧光。
包被膜23包括硝酸纤维素膜以及沿长度方向依次平行间隔设置于硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线。第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线的间隔距离为2～4mm。第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线分别包被cTnI 2/CKMB2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2和羊抗兔抗体，其中第一检测线靠近样品垫22，质控线远离样品垫22。cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2单克隆抗体包被浓度为1mg/ml、用量为1μl包被液量/cm膜，羊抗兔IgG抗体包被浓度为1mg/ml、用量为1μl包被液量/cm膜。
检测试纸条2的制备方法，包括以下步骤：
步骤①，合成NaGdxLu1-y-xF4:yNd(钕掺杂氟化钆镥)：在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5mL油酸和12.5mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1.6mmol醋酸钆，1.6mmol醋酸镥和0.02mmol醋酸钕，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1mmol NaOH和1.6mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中。；
步骤②，制备NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4(核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠纳米微球)：在100mL三口圆底烧瓶中，加入3mL油酸和7mL1-十八烯，加入0.4mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1mmol NaOH和1.6mmol氟化铵甲醇混合溶液，4mL NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至290℃，反应1小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球。NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针中x摩尔百分数优选为40％，y优选为5％。所述材料尺寸约为60nm，且形貌均一，发光性能好。纳米探针激发波长为808nm，发射波长为1064nm。
步骤③，稀土纳米荧光微球的活化：超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
步骤④，制备稀土纳米荧光微球标记cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP1单克隆抗体：将步骤③活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体及兔IgG抗体，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0 Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％(w/w)Nacl、0.5％(w/w)BSA、0.1％(w/w)Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。
步骤⑤制备样品垫22：用样品垫处理液(含0.5％NaCl、0.5％S17、0.1％BSA、1mg/ml抗RBC抗体的20mM、pH8.0的Tris-HCl)在衬底21靠近样品垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为4μl液量/cm样品垫，在样品垫靠近包被膜一侧将稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体用微球稀释液(含0.5％(w/w)BSA、25％(w/w)蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液)稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
步骤⑥制备包被膜23：分别用包被缓冲液(含2.5％(w/w)蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)将cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔4mm，在湿度<30％，温度37℃烘箱中晾干10小时，封袋，备用
步骤⑦，在底衬21(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫22(尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜23(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸24(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的检测试纸条2。
卡壳1包括卡扣连接的塑料下壳和塑料上壳；检测试纸条2固定在塑料下壳上，检测试纸条2的表面通过塑料上壳压紧。塑料上壳上对应样品垫22和包被膜23的位置分别设有加样孔11和观察窗12。
含有标准曲线的ID卡通过检测试纸条2测定梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取稀土纳米荧光检测卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。同批次试剂盒中的含有标准曲线的ID卡的标准曲线相同。
本实施例的心肺五联检测试剂盒定量检测cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的方法，包括以下步骤：
步骤一，将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；
步骤二，开启稀土纳米荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应ID卡；
步骤三，精确吸取100μL待测血液加入到检测卡加样孔中；
步骤四，将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。
本实施例的心肺五联检测试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，检测人血清、血浆和全血样本中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量。含cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的血液样本稀释液滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至样品垫，与时间分辨荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1结合，形成微球抗体-抗原复合物，层析至硝酸纤维素膜上检测区，反应复合物被检测线包被的cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2抗体捕获，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，兔IgG与固定在质控线羊抗兔结合。用光源(808nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米荧光微球发出荧光(1064nm)，信号的强弱与样本中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的含量成正比，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
本实施例的心肺五联检测试剂盒的标准曲线的绘制过程为：在制备好的稀土纳米荧光试纸卡加入不同浓度cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP抗原质控品(每个浓度设三个重复，均由cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP抗原用20％小牛血清稀释得到)，加样层析10min后，通过激发光(808nm)/发射光(1064nm)的稀土纳米荧光免疫分析仪读取C、T线荧光信号及C/T值，实验结果及分析见表1：
Figure BDA0002416078460000101
Figure BDA0002416078460000111
以cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1，标准曲线如图3至图7所示。其中cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP R值分别为0.9979、0.9939、0.9933、0.9966、0.9958，通过该标线对样品中所含cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP浓度进行浓度定量测定。
本实施例的心肺五联检测试剂盒的稀土纳米荧光试纸卡性能测试包括：
(1)最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值M与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(M+2SD)，cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP结果分别为0.07ng/mL、0.67ng/mL、1.8ng/mL、0.07mg/L、9.21pg/mL，分别符合灵敏度标准0.1ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、0.1mg/L、10pg/mL。
(2)线性范围：分别取cTnI 0.1～30ng/mL、CKMB1～60ng/mL、Myo 5～400ng/mL、D-Dimer 0.1～10mg/L、NT-proBNP15～15000pg/mL之间七个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值于理论浓度进行线性分析，得到cTnI线性方程y＝0.9774x+0.2923，r＝0.9982；CKMB线性方程y＝0.9802x+0.2478，r＝0.9981；Myo线性方程y＝0.9925x+2.7953，r＝0.9984；D-Dimer线性方程y＝1.0059x+0.0255,r＝0.9984；NT-proBNP线性方程y＝0.9558x+1.3976，r＝0.9993；表明本发明的心肺五联检测试剂盒在线性范围内相关性很好。
(3)精密度：取三批本实施例的试剂盒，分别检测重复性质控品三批批内CV，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，其中cTnI 0.3ng/ml三批批内CV分别为3.66％、10.09％、10.23％，批间CV为8.95％，10ng/mL三批批内CV分别为7.05％、7.59％、8.98％，批间CV为7.69％；CKMB 5ng/mL三批批内CV分别为8.31％、7.81％、5.82％，批间CV为7.22％，30ng/mL三批批内CV分别为8.38％、8.74％、9.35％，批间CV为8.55％；Myo 50ng/mL三批批内CV分别为8.23％、7.85％、7.75％，批间CV为7.90％，300ng/mL三批批内CV分别为6.86％、7.27％、7.25％，批间CV为7.08％；D-Dimer 0.6mg/L三批批内CV分别为5.03％、6.66％、9.03％，批间CV为6.86％，5mg/L三批批内CV分别为8.41％、7.05％、8.09％，批间CV为7.62％；NT-proBNP 300pg/mL三批批内CV分别为7.46％、8.78％、6.50％，批间CV为7.46％，5000pg/mL三批批内CV分别为5.85％、9.52％、8.98％，批间CV为8.10％；均在10％以内。
(4)准确度：选择基础样本的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入不同浓度的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率＝(分析样品浓度-基础样品浓度)/加入浓度×100％。cTnI回收样本20ng/mL的回收率为105.60％，5ng/mL的回收率为96.07％，平均回收率为100.83％；CKMB回收样本50ng/mL的回收率为103.33％，20ng/mL的回收率为89.47％，平均回收率为96.40％；Myo回收样本400ng/mL的回收率为98.71％，150ng/mL的回收率为101.47％，平均回收率为100.09％；D-Dimer回收样本8mg/L的回收率为92.58％，2.5mg/L的回收率为110.00％，平均回收率为101.29％；NT-proBNP回收样本10000pg/mL的回收率为103.02％，800pg/mL的回收率为98.96％，平均回收率为100.99％。偏差在10％以内。
本实施例的心肺五联检测试剂盒的临床样本检测如下：
采集医院检测cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP血液样本各100份，用本发明的试剂盒分别和罗氏电化学发光法检测NT-proBNP试剂盒、贝克曼化学发光法检测cTnI、Myo、CKMB试剂盒和西门子免疫比浊法检测D-二聚体试剂盒进行检测比较。本发明试剂盒中，取血液样本80μl加入到检测卡加样孔中，层析10min后通过稀土纳米荧光免疫分析仪读取浓度，同一样本分别采用对比系统罗氏电化学发光法检测NT-proBNP试剂盒、贝克曼化学发光法检测cTnI、Myo、CKMB试剂盒和西门子免疫比浊法检测D-二聚体试剂盒进行浓度检测。对检测结果进行线性分析，如图8至图12所示，其相关性很好，cTnI r＝0.9861,Myo r＝0.9833,CKMB r＝0.9869,NT-proBNPr＝0.9864，D-Dimer r＝0.9850，P>0.05，平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：包括卡壳(1)和设置在卡壳(1)内的检测试纸条(2)；所述检测试纸条(2)包括底衬(21)以及沿底衬的长度方向顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫(22)、包被膜(23)和吸水纸(24)；所述样品垫(22)喷涂有微球线；所述微球线为稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体；所述包被膜(23)包括硝酸纤维素膜以及沿长度方向依次平行间隔设置于硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线分别包被cTnI 2/CKMB2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2和羊抗兔抗体，其中第一检测线靠近样品垫(22)，质控线远离样品垫(22)。
2.根据权利要求1所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述样品垫(22)上喷涂的稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体的含量均为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
3.根据权利要求2所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述稀土纳米荧光微球为核壳结构钕掺杂氟化钆镥包覆氟化钇钠，粒径为40nm～60nm，其组成为：
NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4，
其中，NaGdxLu1-xF4为基质，掺杂离子为Nd3+；冒号“:”表示为钕掺杂；x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～90％，y的范围为1％～10％；
所述稀土纳米荧光微球在基态下稳定，在800～1000nm的激发光源作用下发射出波长范围在1000～1100nm的荧光。
4.根据权利要求3所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜(23)上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线的间隔距离为2～4mm。
5.根据权利要求4所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜(23)上的cTnI 2/CKMB 2/Myo 2/D-Dimer 2/NT-proBNP 2单克隆抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
6.根据权利要求5所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述检测试纸条(2)的制备方法，包括以下步骤：
步骤①，合成NaGdxLu1-y-xF4:yNd：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入x份Gd的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，y份钕的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，1-x-y份的Lu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x和y为稀土离子掺杂摩尔百分数，x的范围为20％～70％，y的范围为0～30％；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入物质的量之比为1～2：1.6～3.4的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；
步骤②，制备NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaGdxLu1-y-xF4:yNd纳米探针环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4：0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将探针转移至水相，再在探针表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaGdxLu1-y-xF4:yNd@NaYF4稀土纳米荧光微球；
步骤③，稀土纳米荧光微球的活化：超声波处理荧光微球1～2min后，取荧光微球以12000～14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；
步骤④，制备稀土纳米荧光微球标记cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体：将步骤③活化后的荧光微球超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤⑤制备样品垫(22)：用样品垫处理液在衬底(21)靠近样品垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，在样品垫(22)靠近包被膜(23)的一侧将稀土纳米荧光微球标记的cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和兔IgG抗体用微球解离液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述样品垫处理液为含0.5％NaCl、0.5％S17、0.1％BSA、1mg/ml抗RBC抗体的20mM、pH8.0的Tris-HCl；所述微球解离液为含0.5％BSA、25％蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液；
步骤⑥制备包被膜(23)：分别用包被缓冲液将cTnI 1/CKMB 1/Myo 1/D-Dimer 1/NT-proBNP 1单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线按照间隔2～4mm的方式平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤⑦，在底衬(21)上沿长度方向顺次相互搭接地粘贴样品垫(22)、包被膜(23)和吸水纸(24)得到试纸板，切割得到检测试纸条(2)。
7.根据权利要求1所述的稀土纳米荧光检测卡，其特征在于：所述卡壳(1)包括卡扣连接的塑料下壳和塑料上壳；所述检测试纸条(2)固定在塑料下壳上，检测试纸条(2)的表面通过塑料上壳压紧；所述塑料上壳上对应样品垫(22)和包被膜(23)的位置分别设有加样孔(11)和观察窗(12)。
8.心肺五联检测试剂盒，其特征在于：包括稀土纳米荧光检测卡和含有定标曲线的ID卡；所述稀土纳米荧光检测卡采用权利要求1-7之一所述的稀土纳米荧光检测卡；所述含有标准曲线的ID卡通过检测试纸条(2)测定梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中获得。
9.利用权利要求8所述的心肺五联检测试剂盒定量检测cTnI/CKMB/Myo/D-Dimer/NT-proBNP的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；
步骤二，开启稀土纳米荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应ID卡；
步骤三，精确吸取100μL待测血液加入到检测卡加样孔中；
步骤四，将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。
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