CN112067824A - 一种bnp检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种BNP检测试剂盒，由试纸卡、冻干枪头和样品处理液组成；其中样品处理液包括标准品稀释液和层析液；其中冻干枪头内含有微球标记的抗BNP单克隆抗体；试纸卡包括由下向上依次设置的PVC底板、检测试纸和面卡；其中面卡上设置加样孔和观察窗；检测试纸包括吸水垫、NC膜、样品垫依次粘贴于PVC底板上；NC膜划有检测线和质控线，其中检测线为抗BNP单克隆抗体，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。本发明能够同时大幅度优化敏感度和检测性能而且检测耗时短。

Description

一种BNP检测试剂盒
技术领域
本发明涉及属于疫病诊断技术领域，具体而言，涉及一种BNP检测试剂盒。
背景技术
B型脑钠肽医学上称为“B型利钠肽”，是由心房和心室内的心肌细胞在受到刺激时，分泌的一种氨基酸物质。可以通过抽血化验，检测其含量数值。B型利钠肽具有扩张血管，促进肾脏排出多余水分、盐分以及抑制神经过度兴奋作用。B型利钠肽通常在心房颤动、心力衰竭的患者中水平明显升高。目前主要用于呼吸困难的病因鉴别、急性心力衰竭和慢性心力衰竭的鉴别诊断，心力衰竭严重程度的评估以及心力衰竭治疗以后的疗效评价。B型利钠肽是目前临床工作中，使用最常见的心衰生物标志物之一。
目前，市场上针对B型脑钠肽的检测主要有荧光定量PCR方法，暂没有其他授权批准的方法。但是荧光定量PCR方法时间长且过程复杂，为了能进一步快速检测B型脑钠肽抗原，为克服现有技术的不足，提出一种一种BNP检测试剂盒，同时大幅度优化敏感度和检测性能而且耗时短是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明正是基于上述技术问题至少之一，本发明提出一种BNP检测试剂盒，同时大幅度优化敏感度和检测性能而且检测耗时短。
有鉴于此，本发明提出了一种BNP检测试剂盒由试纸卡、冻干枪头和样品处理液组成；其中样品处理液包括标准品稀释液和层析液；其中冻干枪头内含有微球标记的抗BNP单克隆抗体；试纸卡包括由下向上依次设置的PVC底板、检测试纸和面卡；其中面卡上设置加样孔和观察窗；检测试纸包括吸水垫、NC膜、样品垫依次粘贴于PVC底板上；NC膜划有检测线和质控线，其中检测线为抗BNP单克隆抗体，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。
本发明BNP试剂盒检测原理是根据抗原抗体反应，将冻干枪头套到移液枪上，吸取标准品稀释液将标准品稀释液与冻干枪头内的抗BNP单克隆抗体进行稀释，再将稀释后的抗BNP单克隆抗体加入到层析液中，混匀后，加入试纸卡的加样口，在毛细管作用下，样品会向着吸水垫的方向移动，直至层析完全。
若样品中含有BNP，则此抗原会与枪头中的荧光微球抗体发生抗原抗体反应形成复合物，此复合物在经过T线时，复合物中的抗原又将与T线中的抗体发生反应，如此，该复合物即附着在T线，其他荧光抗体颗粒则继续向吸水垫方向移动而附着在质控区；反之若样本中不含有BNP，则复合物不会附着于T线，而只有在C线有荧光抗体颗粒的附着；用荧光定量检测仪检测后，分析仪自动扫描两条色带并检测检测区和质控区上的复合物发射的荧光强度，用两个色带荧光强度的比值计算所测物质的含量。
进一步的，标准品稀释液为1×PB缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
进一步的，层析液包括PB缓冲溶液、0.25%酪蛋白、70mMEDTA和0.05%T-2。
进一步的，微球标记的抗BNP单克隆抗体的制备方法为：羧基化EU稀土微球经过清洗、活化后与抗BNP单克隆抗体偶联，形成荧光微球复合体，并对荧光微球复合体进行基团封闭后清洗和保存。
具体的，羧基化EU稀土微球的清洗方法为：取100ul的羧基化EU稀土微球到一个新的2.0ml离心管中，然后加入200ul50mMMES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）（pH6.0）混匀，离心去除上清液，离心转速为15000rpm~20000rpm，时间为15min~30min，最终将乳胶微球超声重悬于500ulMES缓冲液中。
活化方法为：往离心管中分别滴加入使用50mMMES（pH6.0）新鲜配制的2ulNHS（50mg/ml）和EDC（（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）是个可溶于水的碳二亚胺）（50mg/ml）反应液，旋涡振荡混匀使微球充分悬浮，置于混合器上室温旋转孵育15min。
羧基化EU稀土微球与抗体的偶联方法为：孵育结束后用500ulMES缓冲液清洗2次，去除上清，然后加入500ul抗BNP单克隆抗体，并加入20-100ug的BSA，旋涡振荡混匀使羧基化EU稀土微球均匀后室温孵育2-4小时。过EDC和羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)将荧光微球颗粒的羧基活化，活化后的羧基与与抗BNP单抗中-NH2共价结合，形成荧光微球复合体。
荧光微球复合体基团封闭：偶联反应完成后离心去除上清液，然后往离心管中加入500ul的封闭液（2%BSA，100mM乙醇胺溶液，pH8.0）进行封闭，室温孵育2小时。
清洗和保存：将基团封闭后的荧光微球复合体用1ml封闭液进行洗涤，重复洗涤2次，然后将重新悬浮于500ulPBS缓冲液（50mMPBS，pH7.4）或Tris缓冲液（三羟甲基氨基甲烷）（50mMTris，pH8.0)中，置于4℃保存，如长期保存还需加入终浓度为0.2%BSA和0.02%NaN3溶液。
进一步的，检测线的制备方法为将NC膜贴于PVC底板上，用0.01MPBS包被液将抗BNP单克隆抗体稀释至2mg/mL，划线为检测线。
进一步的，质控线的制备方法为：用0.01MPBS包被液将羊抗小鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，划线为质控线。
优选的，冻干枪头的制备方法为：将制备标记好的荧光微球复合体喷点于枪头中，-80℃冰箱冷冻过夜后，冷冻真空干燥后可用于组装试剂盒。
优选的，样品垫的制备方法为：将玻璃纤维膜裁剪，用枪头将封闭液（2%BSA，100mM乙醇胺溶液，pH8.0）均匀涂布于玻璃纤维膜表面，置30℃烘箱过夜干燥。
优选的，检测试纸的组装与剪切方法为：
在已粘贴NC膜（包被有单抗检测区和羊抗小鼠质控区）的PVC底板，上下两端分别粘贴吸水垫和已处理好的样品垫，吸水垫在较窄一端；样品垫在较宽一端，组装完成。
试纸卡的制备
检测试纸固定在PVC底板上，检测试纸表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条的样品垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗。
试剂盒的制备
将试纸卡、含荧光微球复合体的冻干枪头、含标准品稀释液的冻存管、层析液的冻存管、两包1g干燥剂共同放入铝箔袋，真空封口后4℃保存，即制备完成检测BNP的免疫荧光试剂盒。
通过以上技术方案，本发明提出了一种BNP检测试剂盒，同时大幅度优化敏感度和检测性能而且检测耗时短。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的试剂盒检测流程图。
图2为本发明实施例1所提供的试剂盒的线性检测结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
冻干枪头的制备
具体的，羧基化EU稀土微球的清洗方法为：取100ul的羧基化EU稀土微球到一个新的2.0ml离心管中，然后加入200ul50mMMES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）（pH6.0）混匀，离心去除上清液，离心转速为1500rpm，时间为30min，最终将乳胶微球超声重悬于500ulMES缓冲液中。
活化方法为：往离心管中分别滴加入使用50mMMES（pH6.0）新鲜配制的2ulNHS（50mg/ml）和EDC（（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）是个可溶于水的碳二亚胺）（50mg/ml）反应液，旋涡振荡混匀使微球充分悬浮，置于混合器上室温旋转孵育15min。
羧基化EU稀土微球与抗体的偶联方法为：孵育结束后用500ulMES缓冲液清洗2次，去除上清，然后加入500ul抗BNP单克隆抗体，并加入20-100ug的BSA，旋涡振荡混匀使羧基化EU稀土微球均匀后室温孵育2-4小时。过EDC和羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)将荧光微球颗粒的羧基活化，活化后的羧基与与抗BNP单抗中-NH2共价结合，形成荧光微球复合体。
荧光微球复合体基团封闭：偶联反应完成后离心去除上清液，然后往离心管中加入500ul的封闭液（2%BSA，100mM乙醇胺溶液，pH8.0）进行封闭，室温孵育2小时。
清洗和保存：将基团封闭后的荧光微球复合体用1ml封闭液进行洗涤，重复洗涤2次，然后将重新悬浮于500ulPBS缓冲液（50mMPBS，pH7.4）或Tris缓冲液（三羟甲基氨基甲烷）（50mMTris，pH8.0)中，置于4℃保存，如长期保存还需加入终浓度为0.2%BSA和0.02%NaN3溶液。将制备标记好的荧光微球复合体喷点于枪头中使用量为2-2.5µl，-80℃冰箱冷冻过夜后
样品垫的制备方法为：将玻璃纤维膜裁剪，用枪头将封闭液（2%BSA，100mM乙醇胺溶液，pH8.0）均匀涂布于玻璃纤维膜表面，置30℃烘箱过夜干燥。
检测线的制备方法为将NC膜贴于PVC底板上，用0.01MPBS包被液将抗BNP单克隆抗体稀释至2mg/mL，划线为所述检测线。
用0.01MPBS包被液将羊抗小鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，划线为质控线。
检测试纸的组装与剪切方法为：
在已粘贴NC膜（包被有抗BNP单克隆抗体检测区和羊抗小鼠IgG抗体质控区）的PVC底板，上下两端分别粘贴吸水垫和已处理好的样品垫，吸水垫在较窄一端；样品垫在较宽一端，组装完成。
试纸卡的制备
检测试纸固定在PVC底板上，检测试纸表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条的样品垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗。
标准品稀释液为1×PB缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
层析液包括PB缓冲溶液、0.25%酪蛋白、70mMEDTA和0.05%T-2。
将试纸卡、含荧光微球复合体的冻干枪头、含标准品稀释液的冻存管、层析液的冻存管、两包1g干燥剂共同放入铝箔袋，真空封口后4℃保存，即制备完成检测BNP的免疫荧光试剂盒。
检测：
将冻干枪头（含荧光微球抗体2µl）套到移液枪上，吸取60µl的不同浓度样品，加入到240µl层析液中，混匀后取75µl混匀液体滴入加样口，20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。检测结果如表1所示。
表1试剂盒
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中样品浓度由标准品稀释液稀释，不同浓度，其线性检测结果如图2。由图2可知，本发明中的试剂盒敏感性较高，达到0.03ng/mL；线性较好，回归系数R2达到0.99以上。
将样品浓度（由标准品稀释液稀释）为25、5、0.5ng/mL三个梯度，进行准确度的检测准备同一批号检测试剂9个，每个样品重复检测3次。
将冻干枪头（含荧光微球抗体2µl）套到移液枪上，吸取60µl的不同浓度样品，加入到240µl层析液中，混匀。取75µl（1）中液体滴入加样口。每个样品重复三次。20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。结果：较高浓度检测相对偏差均小于10%，低浓度检测相对偏差稍大。
实施例2
将样品浓度由标准品稀释液稀释：10ng/mL。
检测：准备同一批检测试剂10份，同一样品重复检测10次
（1）将冻干枪头（含荧光微球抗体2µl）套到移液枪上，吸取60µl的样品加入到240µl层析液中，混匀。
（2）取75µl（1）中液体滴入加样口。每个样品重复三次。
（3）20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。结果：该试剂盒批内差为7.46%，小于10%，符合要求。
实施例3
检测限的测定
样品：正常人阴性血清(75岁以上)。
检测：准备同一批检测试剂10份，对正常人阴性血清进行检测。
（1）将冻干枪头（含荧光微球抗体2µl）套到移液枪上，吸取60µl的不同浓度样品，加入到240µl层析液中，混匀。
（2）取75µl（1）中液体滴入加样口。
（3）20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。
结果：临床中BNP检测阴性区间在0-1.8ng/mL范围内（75岁以上），所以检测限应小于1.8ng/mL，本试剂盒检测限为1.086ng/mL，符合要求。
实施例4
批间差的测定
检测：准备三批检测试剂各6份，检测同一样品。
（1）将冻干枪头（含荧光微球抗体2µl）套到移液枪上，吸取60µl的不同浓度样品加入到240µl层析液中，混匀。
（2）取75µl（1）中液体滴入加样口。每个样品重复三次。
（3）20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。
结果：该试剂盒批内差为13.17%，小于15%，符合要求。
实施例5
热稳定性的检测
检测：准备同一批检测试剂36份，分别放置于4℃、室温、37℃（各12份），分别于3天、7天后各取出6份，检测两个不同浓度的同一样品，每个样品各重复3次。
（1）将冻干枪头（含荧光微球抗体2.5µl）套到移液枪上，吸取60µl的不同浓度样品加入到240µl层析液中，混匀。
（2）取75µl（1）中液体滴入加样口。每个样品重复三次。
（3）20min后，插入到免疫荧光分析仪中进行检测。
在不同温度下放置3天、7天
结果：放置3天、7天后检测，常温检测结果较4℃结果无显著差异，而37℃检测结果明显下降，说明该试剂盒不耐高温。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种BNP检测试剂盒，其特征在于，由试纸卡、冻干枪头和样品处理液组成；其中所述样品处理液包括标准品稀释液和层析液；其中所述冻干枪头内含有微球标记的抗BNP单克隆抗体；所述试纸卡包括由下向上依次设置的PVC底板、检测试纸和面卡；其中所述面卡上设置加样孔和观察窗；所述检测试纸包括吸水垫、NC膜、样品垫依次粘贴于所述PVC底板上；所述NC膜划有检测线和质控线，其中检测线为抗BNP单克隆抗体，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的一种BNP检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液为1×PB缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的一种BNP检测试剂盒，其特征在于，所述层析液包括PB缓冲溶液、0.25%酪蛋白、70mMEDTA和0.05%T-2。
4.根据权利要求1所述的一种BNP检测试剂盒，其特征在于，所述微球标记的抗BNP单克隆抗体的制备方法为：羧基化EU稀土微球经过清洗、活化后与所述抗BNP单克隆抗体偶联，形成荧光微球复合体，并对所述荧光微球复合体进行基团封闭后清洗和保存。
5.根据权利要求1所述的一种BNP检测试剂盒，其特征在于，所述检测线的制备方法为将所述NC膜贴于PVC底板上，用0.01MPBS包被液将所述抗BNP单克隆抗体稀释至2mg/mL，划线为所述检测线。
6.根据权利要求5所述的一种BNP检测试剂盒，其特征在于，所述质控线的制备方法为：用所述0.01MPBS包被液将所述羊抗小鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，划线为所述质控线。
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