CN111537748A - 一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法。所述试纸条的硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述检测线包被新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白，所述质控线包被鸡IgY抗体；所述试纸条的结合垫上包被有量子点标记的羊抗人IgM抗体和量子点标记的羊抗鸡IgY抗体。本发明提供的试纸条，在检测线同时包被新型冠状病毒N蛋白和S1蛋白，并用量子点标记羊抗人IgM抗体和羊抗鸡IgY抗体，且人IgM抗体是在感染新型冠状病毒后首先出现的血清特异性抗体。所得试纸条能够有效准确地检测出初期感染的新型冠状病毒的患者，为防止病毒进一步扩散具有重要的意义。

Description

一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备 方法

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种免疫层析检测试纸条、试剂盒及其制备方法，尤其涉及一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)属于冠状病毒(Coronavirus)的一种，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，会引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，但许多症状是可以处理的，需根据患者临床情况进行治疗。因此，是否能够及时诊断患者为新型冠状病毒感染者十分重要，及时诊断有助于为患者争取治疗时间，同时采取适当的隔离措施，对于密切接触人员以及医护人员的保护具有十分重要的意义。

目前新型冠状病毒的检测有抗体检测和核酸检测。抗体检测采用胶体金法、磁微粒化学发光法；核酸检测多采用荧光PCR法，双扩增法、恒温扩增-实时荧光法、联合探针锚定聚合测序法、RNA恒温扩增-金探针层析法。

然而，在对新型冠状病毒进行抗体检测时，磁微粒化学发光法需要大型仪器设备不能实现现场快速检测；胶体金免疫层析技术中使用的胶体金具有胶体的特性，容易受到电解质的影响，使胶体金凝聚成大颗粒。因此胶体金用于免疫分析中时受环境pH和电解质影响，其稳定性稍差。胶体金是肉眼可见的颗粒，其灵敏度较差，无法检测出初期感染的新型冠状病毒的患者。胶体金与蛋白质或抗体是靠静电吸引结合在一起，有非特异干扰，容易出现假阳性。

在对新型冠状病毒进行核酸检测时，容易出现假阴性结果。由于采样不当、标本保存不当、采用不同类型的标本以及使用不同厂家试剂都可能造成核酸检测结果“假阴性”而出现漏诊；而且，核酸检测对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格不菲，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高；同时，核酸检测耗时较长，完成一个RT-PCR的检测通常需要4-6个小时，然而考虑到样本运输、大量样本积压的情况，通常最快24小时才可以报告结果。

因此，本领域亟需研发一种能够检测人新型冠状病毒的新手段或方法，以便于能够及时快速地检测出待测者是否感染新型冠状病毒，避免出现假阴性和假阳性结果，同时，也便于检测出初期感染的新型冠状病毒的患者，为患者提供及时有效的临床治疗，同时对密切接触人员和医护工作者也具有十分重要的保护意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法。所述试纸条利用量子点标记抗体，同时在检测线上包被新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白，实现对新型冠状病毒的快速、准确检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，所述试纸条的硝酸纤维素膜(NC膜)设有检测线和质控线，所述检测线包被新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)和S1蛋白，所述质控线包被鸡IgY抗体；所述试纸条的结合垫上包被有量子点标记的羊抗人IgM抗体和量子点标记的羊抗鸡IgY抗体。

其中，免疫球蛋白IgM抗体是在感染新型冠状病毒后首先出现的血清特异性抗体，IgG抗体随后出现；所述检测线包被的N蛋白(N，Nucleocapsid Protein)为病毒核衣壳内最重要的蛋白之一，主要负责RNA的复制功能；S1蛋白为新型冠状病毒中关键的S蛋白(棘突蛋白，spike protein)的亚单位之一，所述S蛋白包含S1和S2两个亚单位，S1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的C端RBD结构域，而RBD结构域负责和受体结合；且新型冠状病毒内N蛋白、S1蛋白均为真核表达。

本发明中，所述试纸条利用荧光免疫层析技术、采用免疫捕获法检测人新型冠状病毒IgM抗体。所述试纸条的检测线上同时包被新型冠状病毒的N蛋白和S1蛋白，即所述核衣壳蛋白和S1蛋白混合后进行包被，混合包被后得到的试纸条的T/C值高于单独包被S1蛋白和N蛋白，也就是说，混合包被得到的试纸条灵敏度较好，能够提高检测特异性，防止出现假阳性结果导致误诊。同时，采用量子点标记检测人新型冠状病毒IgM抗体，由于量子点发射光谱宽度较窄，光化学稳定性高，不易分解，其可以实现时间分辨荧光检测，长达200ns时间延迟使瞬时荧光干扰减到最小，能够进一步提高检测的灵敏度和特异性。因此，所述试纸条不仅检测灵敏度和特异性较好，还能检测出初期感染的新型冠状病毒的患者。

作为本发明优选的技术方案，所述核衣壳蛋白的工作浓度为0.1～0.5mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL或0.5mg/mL等，优选为0.25mg/mL。

优选地，所述S1蛋白的工作浓度为1.5～2mg/mL，例如可以是1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL或2mg/mL等，优选为1.75mg/mL。

本发明中，所述核衣壳蛋白与S1蛋白的工作浓度以及两者的使用比例较为重要，若是超出此范围，待测溶液层析至检测线上时，人新型冠状病毒IgM抗体无法正常与核衣壳蛋白与S1蛋白相结合，导致检测结果准确度和灵敏性降低。同时，核衣壳蛋白与S1蛋白的工作浓度在此范围中，也能够使两者保持较好的比例，当两者比例接近7:1时，所得检测试纸条的检测效果最好。

优选地，包被所述核衣壳蛋白和S1蛋白的操作为：将所述核衣壳蛋白和S1蛋白以(0.1～0.5):(1.5～2)的比例进行混合，再用包被稀释液稀释。

优选地，所述鸡IgY抗体的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，例如可以是0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL或1.2mg/mL等，优选为1mg/mL。本发明中，质控线上包被鸡IgY抗体，其工作浓度可以根据实验需求相应调整，同时，质控线的信号值还可以根据量子点标记的羊抗鸡IgY的喷量进行调整。

优选地，稀释所述新型冠状病毒核衣壳蛋白、S1蛋白和鸡IgY抗体时使用的溶液为包被稀释液，所述包被稀释液中包括质量分数为1～3％的蔗糖，例如可以是1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％或3％等，优选为2％。

优选地，所述包被稀释液为含有质量分数为1～3％(例如可以是1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％或3％等)蔗糖的PBS缓冲液。

作为本发明优选的技术方案，所述试纸条包括顺次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明提供的检测试纸条包括PVC底板，所述的PVC底板上衔接样品垫，结合垫、包被膜和吸水垫。

优选地，所述质控线位于硝酸纤维素膜上靠近吸水垫的一端，与吸水垫的距离为8～12mm，例如可以是8mm、9mm、10mm、11mm或12mm等。

优选地，所述检测线位于硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一端，与结合垫的距离为8～12mm，例如可以是8mm、9mm、10mm、11mm或12mm等。

作为本发明扩展的技术方案，所述试纸条上还可以增加一条检测线，用于检测人新型冠状病毒IgG或IgA抗体。

作为本发明优选的技术方案，所述样品垫制备时使用的样品垫处理液包括质量分数为0.3～0.5％(例如可以是0.3％、0.32％、0.35％、0.4％、0.42％、0.45％、0.48％或0.5％等)的BSA。优选地，所述样品垫处理液为含有质量分数为0.3～0.5％BSA的Tris-HCl缓冲液。

本发明中，样品垫处理液需要根据检测抗体的种类进行选择，针对本发明所要检测的IgM抗体，所选择的样品垫处理液为含有0.3～0.5％BSA的Tris-HCl缓冲液，若选用其他的缓冲液，可能无法减小待测样品中其他杂质的影响，使检测结果的特异性较差。

优选地，所述结合垫制备时使用的结合垫处理液包括质量分数为1～3％(例如可以是1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％或3％等)的海藻糖、0.5～1.5％(例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.3％或1.5％等)的酪蛋白钠和0.3～0.8％(例如可以是0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％或0.8％等)的NaCl。优选地，所述结合垫处理液为含有质量分数为1～3％的海藻糖、0.5～1.5％的酪蛋白钠和0.3～0.8的％NaCl的Tris-HCl缓冲液。

第二方面，如第一方面所述的试纸条的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备量子点标记的羊抗人IgM抗体和量子点标记的羊抗鸡IgY抗体，再将所述标记后的抗体喷膜得到结合垫；

(2)将鸡IgY抗体稀释后划线到硝酸纤维素膜上形成质控线，将新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白稀释后划线到所述硝酸纤维素膜上形成检测线；

(3)将吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫依次固定于底板上得到所述试纸条。

作为本发明优选的技术方案，所述羊抗人IgM抗体的标记方法为：将活化的量子点微球与所述羊抗人IgM抗体混合反应，所述量子点微球与抗体共价偶连，得到量子点标记的羊抗人IgM抗体。本发明中所述羊抗鸡IgY抗体的标记方法与羊抗人IgM抗体的标记方法相同。

优选地，所述羊抗人IgM抗体与量子点微球的质量比为(1～1.5):10，例如可以是1:10、1.05:10、1.1:10、1.15:10、1.2:10、1.25:10、1.3:10、1.35:10、1.4:10或1.5:10等。例如，相对于50μg的量子点微球，所述羊抗人IgM抗体的使用量为50～75μg。

优选地，所述量子点微球的粒径为80～120nm，例如可以是80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、105nm、110nm、115nm或120nm等。本发明中，免疫层析专用量子点纳米球的粒径为100±20nm；发射波长620±10nm，520±10nm；激发波长<500nm，优选为365～450nm；且表面具有羧基官能团。

优选地，所述结合垫上羊抗人IgM抗体和羊抗鸡IgY抗体的体积浓度比为(20～30):1，例如可以是20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1等。

优选地，所述混合反应的温度为18～26℃，例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃或26℃等。

优选地，所述活化使用的活化剂包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

优选地，所述Sulfo-NHS的质量浓度为10～30mg/mL，例如可以是10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL等，优选为20mg/mL。

优选地，所述EDC的质量浓度为10～30mg/mL，例如可以是10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL等，优选为20mg/mL。

本发明中，所述标记时使用的标记缓冲液的pH为5.5～6.5，例如可以是5.5、5.6、5.8、6、6.2、6.4或6.5等。优选地，所述标记缓冲液为磷酸盐缓冲液。

优选地，所述标记完成后使用的标记保存液的pH为7～7.5，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等。优选地，所述标记保存液为含有质量分数1～3％(例如可以是1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％或3％等)的海藻糖和0.5～1.5％(例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.3％或1.5％等)BSA的Tris-HCl缓冲液。

示例性的，所述抗人IgM抗体的标记方法包括如下步骤：

活化：以标记50μL(含量为10mg/mL)量子点微球为例(生产环境温度18～26℃、湿度45～65％)，取量子点微球50μL加到标记缓冲液中震荡混匀，加入活化剂，室温震荡反应；4℃离心弃上清，收集沉淀，用标记缓冲液重悬，定容后超声分散；

抗体标记：取70μg标记抗体(抗人IgM抗体)分散在标记缓冲液中，加入上述活化后的微球200μL(约相当于微球原始浓度的50μL)发生震荡偶联反应；4℃离心，弃上清，收集沉淀；

封闭抗体：每个管子用1％BSA封闭液重悬，定容后超声分散，封闭2h；

纯化：4℃离心弃上清，收集沉淀，每个管子用100μL保存液重悬，震荡分散；2～8℃(例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等)保存备用，储存效期7天。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述喷膜的喷量为3～8μL/cm，例如可以是3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、6μL/cm、7μL/cm或8μL/cm等。

优选地，步骤(2)所述划线的浓度为0.8～1.2μL/cm，例如可以是0.8μL/cm、0.9μL/cm、1μL/cm、1.1μL/cm或1.2μL/cm等，速度80～120mm/s，例如可以是80mm/s、90mm/s、95mm/s、100mm/s、105mm/s、110mm/s或120mm/s等。

优选地，制备得到所述结合垫和硝酸纤维素膜后还包括干燥的操作，所述干燥为将结合垫或硝酸纤维素膜放置在温度18～26℃(例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃或26℃等)、湿度≤30％(例如湿度为0％、5％、10％、15％、20％、25％或30％)的烘箱中干燥16～18h(例如可以是16h、16.2h、16.5h、17h、17.2h、17.5h或18h等)。

作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将活化的量子点微球与所述羊抗人IgM抗体混合反应，所述羊抗人IgM抗体与量子点微球的用量比为(1～1.5):10；所述量子点微球与抗体共价偶连，得到量子点标记的羊抗人IgM抗体；量子点标记的羊抗鸡IgY抗体与所述量子点标记的羊抗人IgM抗体的制备方法相同；

再将所述标记后的抗体稀释后以体积比(20～30):1混合，上样到喷金划线机中，按照3～8μL/cm的喷量喷膜后得到结合垫；

(2)将鸡IgY抗体稀释后划线到硝酸纤维素膜上形成质控线，所述鸡IgY抗体的工作浓度为0.8～1.2mg/mL；将新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白稀释后划线到所述硝酸纤维素膜上形成检测线，所述核衣壳蛋白的工作浓度为0.1～0.5mg/mL，所述S1蛋白的工作浓度为1.5～2mg/mL；所述划线的浓度为0.8～1.2μL/cm，速度80～120mm/s；

(3)将吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫依次固定于底板上得到所述试纸条。

示例性的，本发明提供一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上有顺次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。具体制备步骤如下：

(1)NC膜的的制备：质控线划线，用包被稀释液稀释鸡IgY抗体稀释至1mg/mL进行包被，划线参数为1μL/cm，速度100mm/s；检测线划线，将S1蛋白与N蛋白以1.75:0.25的比例混合，再用包被稀释液稀释，稀释后蛋白总浓度为2mg/mL，即包被稀释液稀释S1蛋白的工作浓度为1.75mg/mL，N蛋白浓度的工作浓度为0.25mg/mL，划线参数为1μL/cm，速度100mm/s。

(2)NC膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC底板上；

(3)吸水垫的粘贴：将吸水纸裁成尺寸为(23±1)mm×(300±5)mm，即为吸水垫，再将PVC底板平铺于工作台面上，轻轻揭开PVC板上吸水垫粘贴处的保护膜，将吸水垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸水垫一侧与底板的顶端对齐，吸水垫另一侧可覆盖于NC膜上2mm；

(4)结合垫的制备：将一张尺寸200mm×300mm玻璃纤维完全浸没在50mL结合垫处理液中，滚轮处理均匀。取出浸泡后的玻璃纤维，放置在37℃烘箱中干燥16～18h；

其中，所述结合垫处理液为含有质量分数为2％海藻糖、1％酪蛋白钠和0.5％NaCl的0.2M pH为7.59的Tris-HCl缓冲液。

将标记后抗人IgM抗体、羊抗鸡IgY抗体上样到喷金划线机中，二者的混合体积比例为25:1，按照5μL/cm的喷量喷到处理后的(1.1±1)mm×(300±5)mm玻璃纤维上，完成后，将其放置在温度18～26℃、湿度≤30％的烘箱中干燥过夜16～18h，干燥完，迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口即得荧光结合垫，2～8℃保存，待用，储存效期2年。

(5)结合垫的粘贴：将PVC板平铺于工作台面上；轻轻揭开PVC板上结合垫粘贴处的保护膜，将结合垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，结合垫覆盖在NC膜上2mm；

(6)样品垫的制备：将样品垫裁成23mm×300mm的大小，浸泡在样品垫处理液中，1h之后取出，于室温干燥16～18h，干燥完后，迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，2～8℃保存待用，储存效期2年；

其中，所述样品垫处理液为含有质量分数为0.4％BSA的0.2M pH为7.59的Tris-HCl缓冲液。

(7)样品垫的粘贴：轻轻揭开PVC板最底端的保护膜，将样品垫粘附于结合垫，底端与PVC底板底端对齐，方法同吸水垫，样品垫覆盖在结合垫上2mm；

(8)将粘贴好的大板切成4.0mm左右宽的试纸条即得到本发明所述的试纸条。

第三方面，本发明提供一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的检测卡，包括如第一方面所述的试纸条，以及包装所述试纸条的塑料外壳；所述塑料外壳的卡壳上盖设有加样孔和观察窗；所述加样孔在样品垫的上方并通过所述观察窗观测检测线和质控线。

例如，将第一方面所述的试纸条装入塑料外壳内，再将每一检测卡置于铝膜袋中，并加入0.5g干燥剂，热合封口即可得到用于检测人新型冠状病毒IgM抗体的检测卡。

同时，本发明所述的检测卡还可以为二联卡，其中一个用于检测人新型冠状病毒IgG抗体，另一个用于检测人新型冠状病毒IgM抗体。

第四方面，一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒包括如第三方面所述的检测卡。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，在检测线同时包被新型冠状病毒N蛋白和S1蛋白，N蛋白、S1蛋白均为真核表达，且N蛋白主要负责RNA的复制功能，S1能够促进病毒与宿主细胞受体的结合；并用量子点标记羊抗人IgM抗体和羊抗鸡IgY抗体，其中，人IgM抗体是在感染新型冠状病毒后首先出现的血清特异性抗体，所得试纸条能够提高人新型冠状病毒IgM抗体检测的灵敏度，在将阳性血浆稀释之后，所述试纸条的检测结果依然为阳性，说明所述试纸条能够检测出初期感染的新型冠状病毒的患者，同时所得试纸条特异性较好，能够防止出现假阳性结果导致误诊。

(2)本发明所述试纸条使用方法简单，能够实现现场的快速检测，能够及时有效准确地检测出初期感染的新型冠状病毒的患者，为防止病毒地进一步扩散具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明提供的试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

本发明所述的检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条是基于荧光免疫层析技术和免疫捕获法进行检测的，下面结合图1对所述试纸条的工作原理进行简单描述：

所述试纸条的硝酸纤维膜上包含检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线包被新型冠状病毒的N蛋白和S1蛋白，质控线包被鸡IgY抗体；所述试纸条的结合垫上固定量子点荧光微球标记的羊抗人IgM抗体和羊抗鸡IgY抗体；

在检测时，待测样本滴加到试纸条的样品垫上，在毛细效应下发生扩散，待测样本中的若含有人新型冠状病毒IgM抗体，所述人IgM抗体与量子点标记的羊抗人IgM抗体结合，扩散至测试区，被包被的新型冠状病毒N蛋白和S1蛋白捕获，并形成复合物聚集于硝酸纤维膜的检测线；结合垫中的羊抗鸡IgY抗体继续扩散，并与鸡IgY抗体结合，聚集在硝酸纤维膜的质控线；

在激发光的作用下，量子点发射一定波长的光信号，被荧光免疫层析读卡仪识别，并转化为一定的数值；荧光免疫层析读卡仪按内置的参考范围判断样本中人新型冠状病毒IgM抗体的浓度。

判别标准：T/C＞0.039时判定结果为阳性；T/C＜0.039时判定结果为阴性。

以下实施例中，所用鸡IgY抗体、羊抗人IgM抗体(多克隆抗体)和羊抗鸡IgY抗体(多克隆抗体)均为常规手段制备的抗体；新型冠状病毒N蛋白和S蛋白均为真核表达的蛋白，均以本领域技术人员知晓的实验方法进行制备。

实施例1

本实施例提供一种快速检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，所述的检测试纸条包括PVC底板，所述的PVC底板上衔接样品垫，结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫。

本实施例中，所使用到的各种溶液的成分如下表1所示，表中％均表示质量分数：

表1

所述试纸条的制备步骤包括：

(1)样品垫的制备：将样品垫裁成23mm×300mm的大小，浸泡在样品垫处理液中，1h之后取出，于室温干燥16h，干燥完后，迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，4℃保存待用；

(2)结合垫的制备：将一张尺寸200mm×300mm玻璃纤维完全浸没在50mL结合垫处理液中，滚轮处理均匀，取出浸泡后的玻璃纤维，放置在37℃烘箱中干燥16h，干燥完后，迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，4℃保存待用；

喷膜与干燥：将标记后抗人IgM抗体、羊抗鸡IgY抗体上样到喷金划线机中，两者的混合体积比例为25:1，按照5μL/cm的喷量喷到处理后的(1.1±1)mm×(300±5)mm玻璃纤维上；

完成后，将其放置在温度25℃、湿度≤30％的烘箱中干燥过夜16h，干燥完，迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口即得荧光结合垫，2～8℃保存，待用。

其中，羊抗人IgM抗体的标记方法为：

1、活化过程：生产环境温度25℃、湿度50％，取量子点微球50μL加到0.1mL标记缓冲液中震荡混匀，加入4μL活化剂1，3μL活化剂2，室温震荡反应30min；4℃13000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，用标记缓冲液重悬，定容至0.2mL，超声分散；

2、抗体标记：取70μg标记抗体(羊抗人IgM抗体)分散在0.05mL标记缓冲液中，加入上述活化后的微球200μL(约相当于微球原始浓度的50μL)，震荡5s，震荡偶联反应0.5h，4℃8000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀；

3、封闭抗体：每个管子用1％BSA封闭液重悬，定容至0.2mL，超声分散；封闭2h；

4、纯化方法：4℃8000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀，每个管子用100μL保存液重悬，震荡分散；4℃保存备用。所述羊抗鸡IgY的标记方法同羊抗人IgM的标记。

(3)NC膜的制备：①质控线划线：C线与硝酸纤维素膜上缘的距离为10mm；用包被稀释液稀释鸡IgY抗体稀释至1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；

②检测线划线：T线与硝酸纤维素膜下缘的距离为10mm；将S1蛋白与N蛋白以1.75:0.25的比例混合，再用包被稀释液稀释，稀释后蛋白总浓度为2mg/mL，即S1蛋白的工作浓度为1.75mg/mL，N蛋白浓度的工作浓度为0.25mg/mL，划线参数为1μL/cm，速度100mm/s；

完成后将片材放置在温度25℃、湿度≤30％的烘箱中干燥16h，干燥完迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口即得反应膜，2～8℃保存，待用。

(4)组装：各组件在PVC底板上的排列顺序依次为吸水垫-硝酸纤维素膜-荧光结合点垫-样品垫；

将PVC板平铺于工作台面上：①轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上；②揭开PVC板上吸水垫粘贴处的保护膜，将吸水垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸水垫一侧与底板的顶端对齐；③轻轻揭开PVC板上结合垫粘贴处的保护膜，将结合垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，结合垫覆盖在NC膜上2mm；④轻轻揭开PVC板最底端的保护膜，将样品垫粘附于结合垫，底端与PVC底板底端对齐，方法同吸水垫；

最后，将粘贴好的PVC底板切成4.0mm宽的试纸条即得到本发明所述的检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条。

实施例2～5

实施例2～5提供多个不同S1蛋白与N蛋白浓度的试纸条，与实施例1的区别在于，各实施例中检测线S1蛋白与N蛋白的工作浓度分别设定为：

实施例2：S1蛋白1.50mg/mL、N蛋白0.50mg/mL；

实施例3：S1蛋白1.00mg/mL、N蛋白1.00mg/mL；

实施例4：S1蛋白0.50mg/mL、N蛋白1.50mg/mL；

实施例5：S1蛋白0.25mg/mL、N蛋白1.75mg/mL；其余条件及制备方法与实施例1相同。

对比例1

本对比例提供一种快速检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，与实施例1的区别在于，所述检测线只包被S1蛋白，其工作浓度为2.00mg/mL；其余条件及制备方法与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供一种快速检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，与实施例1的区别在于，所述检测线只包被N蛋白，其工作浓度为2.00mg/mL；其余条件及制备方法与实施例1相同。

性能测试1

将实施例1制备得到的试纸条装入塑料卡壳内，将每一试剂卡置于铝膜袋中，并加入0.5g干燥剂1包，热合封口得到人新型冠状病毒IgM抗体检测卡。应用所述检测卡检测9例阴性血浆样本和2例胶体金试剂盒检测后显示呈弱阳性血浆，检测结果如下表2所示：

表2

由上表可知，本发明提供的试纸条的检测结果显示，其阴性符合率为100％，阳性符合率也为100％，并未出现误诊或漏诊现象。根据统计学原则，以T/C均值+2×标准差作为阴阳性判断依据，9例阴性样本测试的T/C均值+2×标准差结果为0.039，因此以0.039作为阴阳性判定的界限。

其中，在将2例胶体金试剂盒检测弱阳性的血浆稀释25倍后，本发明提供的试纸条仍可检出IgM抗体阳性，而这2例弱阳性样本已经是胶体金的最低检出限的样本，因此稀释25倍后的血浆胶体金的测试的结果仍为阴性，说明所述试纸条的灵敏度较好，其灵敏度优于胶体金检测试纸条的灵敏度。

性能测试2

将实施例1～5和对比例1～2提供的试剂条制成检测卡，检测同样的按1:100稀释的阳性样本，每个样本平行测试三次后取平均值，其中，样本稀释液为含有0.1％表面活性剂S9(Tetronic1307)、0.04M EDTA的0.2M pH为7.59的Tris-HCl缓冲液。

检测结果如表4所示：

表4

由上表中实施例1与对比例1～2可知，单独包被S1蛋白和N蛋白检测的T/C明显低于N蛋白和S1蛋白混合包被的T/C值；同时由实施例1与实施例2～5比较可知，在S1蛋白与N蛋白的工作浓度为1.75mg/mL和0.25mg/mL，即两者比值为7:1时，检测结果较好。

综上所述，本发明提供的试纸条对人新型冠状病毒IgM抗体检测的灵敏度较高，能够检测出初期感染的新型冠状病毒的患者，同时所得试纸条特异性较好，能够防止出现假阳性结果导致误诊，为防止病毒地进一步扩散具有重要的意义。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条，其特征在于，所述试纸条的硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述检测线包被新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白，所述质控线包被鸡IgY抗体；

所述试纸条的结合垫上包被有量子点标记的羊抗人IgM抗体和量子点标记的羊抗鸡IgY抗体。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述核衣壳蛋白的工作浓度为0.1～0.5mg/mL，优选为0.25mg/mL；

优选地，所述S1蛋白的工作浓度为1.5～2mg/mL，优选为1.75mg/mL；

优选地，所述鸡IgY抗体的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，优选为1mg/mL；

优选地，稀释所述新型冠状病毒核衣壳蛋白、S1蛋白和鸡IgY抗体时使用的溶液为包被稀释液，所述包被稀释液中包括质量分数为1～3％的蔗糖，优选为2％；

优选地，所述包被稀释液为含有质量分数为1～3％蔗糖的PBS缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括顺次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

优选地，所述质控线位于硝酸纤维素膜上靠近吸水垫的一端，与吸水垫的距离为8～12mm；

优选地，所述检测线位于硝酸纤维素膜上靠近结合垫的一端，与结合垫的距离为8～12mm。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫制备时使用的样品垫处理液包括质量分数为0.3～0.5％的BSA；

优选地，所述样品垫处理液为含有质量分数为0.3～0.5％BSA的Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述结合垫制备时使用的结合垫处理液包括质量分数为1～3％的海藻糖、0.5～1.5％的酪蛋白钠和0.3～0.8的％NaCl；

优选地，所述结合垫处理液为含有质量分数为1～3％的海藻糖、0.5～1.5％的酪蛋白钠和0.3～0.8的％NaCl的Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述结合垫上羊抗人IgM抗体和羊抗鸡IgY抗体的浓度比为(20～30):1。

5.根据权利要求1～4任一项所述的试纸条，其特征在于，所述羊抗人IgM抗体的标记方法为：将活化的量子点微球与所述羊抗人IgM抗体混合反应，所述量子点微球与抗体共价偶连，得到量子点标记的羊抗人IgM抗体；

优选地，所述羊抗人IgM抗体与量子点微球的质量比为(1～1.5):10；

优选地，所述量子点微球的粒径为80～120nm；

优选地，所述混合反应的温度为18～26℃；

优选地，所述活化使用的活化剂包括Sulfo-NHS和EDC；

优选地，所述Sulfo-NHS的质量浓度为10～30mg/mL，优选为20mg/mL；

优选地，所述EDC的质量浓度为10～30mg/mL，优选为20mg/mL。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备量子点标记的羊抗人IgM抗体和量子点标记的羊抗鸡IgY抗体，再将所述标记后的抗体混合后喷膜得到结合垫；

(2)将鸡IgY抗体稀释后划线到硝酸纤维素膜上形成质控线，将新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白稀释后划线到所述硝酸纤维素膜上形成检测线；

(3)将吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫依次固定于底板上得到所述试纸条。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述喷膜的喷量为3～8μL/cm；

优选地，步骤(2)所述划线的浓度为0.8～1.2μL/cm，速度为80～120mm/s；

优选地，制备得到所述结合垫和硝酸纤维素膜后还包括干燥的操作，所述干燥为将结合垫或硝酸纤维素膜放置在温度18～26℃、湿度≤30％的烘箱中干燥16～18h。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将活化的量子点微球与所述羊抗人IgM抗体混合反应，所述羊抗人IgM抗体与量子点微球的质量比为(1～1.5):10；所述量子点微球与抗体共价偶连，得到量子点标记的羊抗人IgM抗体；

再将所述标记后的抗体稀释后以体积比(20～30):1混合，上样到喷金划线机中，按照3～8μL/cm的喷量喷膜后得到结合垫；

(2)将鸡IgY抗体稀释后划线到硝酸纤维素膜上形成质控线，所述鸡IgY抗体的工作浓度为0.8～1.2mg/mL；将新型冠状病毒核衣壳蛋白和S1蛋白稀释后划线到所述硝酸纤维素膜上形成检测线，所述核衣壳蛋白的工作浓度为0.1～0.5mg/mL，所述S1蛋白的工作浓度为1.5～2mg/mL；所述划线的浓度为0.8～1.2μL/cm，速度80～120mm/s；

(3)将吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫依次固定于底板上得到所述试纸条。

9.一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的检测卡，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的试纸条，以及包装所述试纸条的塑料外壳；

所述塑料外壳的卡壳上盖设有加样孔和观察窗，所述加样孔在样品垫的上方并通过所述观察窗观测检测线和质控线。

10.一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求9所述的检测卡。

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