CN114113587A - 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡及应用,属于病毒胶体金免疫层析检测卡技术领域。检测卡包括底板、样品垫、金标结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸收垫;样品垫、金标结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸收垫从左至右依次粘贴在底板上,且样品垫与金标结合垫连接,金标结合垫与滤血膜连接,滤血膜与硝酸纤维素膜连接,硝酸纤维素膜与吸收垫连接;硝酸纤维素膜上分布有检测线G线、检测线M线和质控线;本发明中的检测卡采用捕获法,通过包被在硝酸纤维素膜上的IgG二抗和IgM二抗及包被在金标结合垫上的新型冠状病毒抗原,利用胶体金免疫层析的原理检测人全血中的新型冠状病毒IgM和IgG抗体,检测方法快速准确。
Description
技术领域
本发明涉及病毒胶体金免疫层析检测卡技术领域,特别地,涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡及应用。
背景技术
国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2020年2月11日宣布,新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。而世界卫生组织(WHO)同日宣布,由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19。冠状病毒是一个大型病毒家族,已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
人首次感染新型病毒后,机体的免疫系统会对病毒进行免疫防御,产生特异性的抗体。一般1-2周出现IgM抗体,约4周左右产生IgG抗体。新冠病毒IgM/IgG抗体试剂的使用,为临床提供了血清学的证据,可与核酸检测方法联合使用,从而为新冠病毒的诊断提供更全面、准确的信息。
抗体测定检测卡还可助力新型冠状病毒(SARS-CoV-2)疫苗的开发,用于检测接种疫苗后体内产生抗体的情况及疫苗的效果。
抗体测定检测卡还可用于流行病学调查,了解人群中有多少个体接触过相应的新型病毒,有助于国家对疫情的整体判断和控制。
发明内容
为了解决现有的新型冠状病毒抗体检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时,需要专业人员进行操作且主要依赖实验室的问题,本发明提供一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡及检测方法。采用捕获法,通过包被在硝酸纤维素膜上的IgG二抗和IgM二抗及包被在金标结合垫上的新型冠状病毒抗原,利用胶体金免疫层析的原理检测人全血中的新型冠状病毒IgM和IgG抗体,检测方法快速准确。
根据本发明的第一方面,提供了一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,所述检测卡包括底板、样品垫、金标结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸收垫;所述样品垫、金标结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸收垫从左至右依次粘贴在底板上,且样品垫与金标结合垫连接,金标结合垫与滤血膜连接,滤血膜与硝酸纤维素膜连接,硝酸纤维素膜与吸收垫连接;
所述硝酸纤维素膜上从左至右依次分布有检测线G线、检测线M线和质控线,或者所述硝酸纤维素膜上从左至右依次分布有检测线M线、检测线G线和质控线;
所述金标结合垫包被有新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物以及鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物;
所述硝酸纤维素膜上的检测线G线包被有IgG二抗,所述硝酸纤维素膜上的检测线M线包被有IgM二抗;
所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有抗鸡IgY二抗;
所述新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物用于与待测样品中的新型冠状病毒抗体特异性结合,所述IgG二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgG抗体特异性结合,所述IgM二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgM抗体特异性结合;所述鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物用于与所述抗鸡IgY二抗特异性结合。
优选地,所述IgG二抗为鼠抗人IgG二抗、兔抗人IgG二抗或鸡抗人IgG二抗,所述IgM二抗为鼠抗人IgM二抗、兔抗人IgM二抗或鸡抗人IgM二抗。
优选地,所述抗鸡IgY二抗为兔抗鸡IgY、鼠抗鸡IgY或猪抗鸡IgY。
优选地,所述新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒重组N蛋白或新型冠状病毒重组S蛋白。
优选地,所述鸡IgY抗体为鸡IgY单克隆抗体。
按照本发明的另一方面,提供了任一所述的检测卡用于检测新型冠状病毒抗体的应用。
优选地,包括以下步骤:
S1:将待测样品滴加至样品垫上,5min-15min后,待测样品逐渐层析至金标结合垫、滤血膜、硝酸纤维素膜和吸收垫上,根据显色结果判断待测样品中新型冠状病毒抗体的情况;
S2:若检测线G线和质控线内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgG抗体呈阳性;若检测线M线和质控线内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgM抗体呈阳性;若检测线G线、检测线M线和质控线内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgM抗体和IgG抗体呈阳性;
若仅在质控线内出现紫红色条带,而检测线G线和检测线M线内均无紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒抗体呈阴性;
若在检测线G线和/或检测线M线内出现紫红色条带,而质控线内无紫红色条带,则所述检测卡无效;若在检测线G线、检测线M线和质控线内均无紫红色条带,则所述检测卡无效。
优选地,所述待测样品用磷酸盐缓冲液稀释后滴至样品垫上。
优选地,所述待测样品的pH值为6.5-8.0。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,主要具备以下的技术优点:
(1)本发明采用捕获法,通过包被在硝酸纤维素膜上的IgG二抗和IgM二抗及包被在金标结合垫上的新型冠状病毒抗原,利用胶体金免疫层析的原理检测人全血中的新型冠状病毒IgM和IgG抗体,检测方法快速准确。
(2)本发明通过采取指尖全血测定新型冠状病毒IgM和IgG抗体,取样简单快速,5min即可得出结果。
(3)本发明优选地,IgG二抗为鼠抗人IgG二抗,IgM二抗为鼠抗人IgM二抗,二抗易获得。
(4)本发明优选地,抗鸡IgY二抗为兔抗鸡IgY,特异性好,不易产生交叉。
(5)本发明优选地,新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒重组N蛋白或新型冠状病毒重组S蛋白,特异性好,无生物活性,安全有效。
(6)本发明优选地,鸡IgY抗体为鸡IgY单克隆抗体,特异性好,活性高。
附图说明
图1新型冠状病毒IgM+IgG抗体胶体金免疫层析快速检测卡的结构示意图,其中1-底板、2-样品垫、3-金标结合垫、4-滤血膜、5-检测线G线、6-检测线M线、7-质控线、8-硝酸纤维素膜、9-吸收垫。
图2新型冠状病毒IgM+IgG抗体的检测结果呈现阴性。
图3新型冠状病毒IgM+IgG抗体的检测结果呈现阳性。
图4新型冠状病毒IgM+IgG抗体的检测结果无效。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,所述检测卡包括底板1、样品垫2、金标结合垫3、滤血膜4、硝酸纤维素膜8和吸收垫9;所述样品垫2、金标结合垫3、滤血膜4、硝酸纤维素膜8和吸收垫9从左至右依次粘贴在底板1上,且样品垫2与金标结合垫3连接,金标结合垫3与滤血膜4连接,滤血膜4与硝酸纤维素膜8连接,硝酸纤维素膜8与吸收垫9连接;
所述硝酸纤维素膜8上从左至右依次分布有检测线G线5、检测线M线6和质控线7,或者所述硝酸纤维素膜8上从左至右依次分布有检测线M线6、检测线G线5和质控线7;
所述金标结合垫3包被有新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物以及鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物;
所述硝酸纤维素膜8上的检测线G线5包被有IgG二抗,所述硝酸纤维素膜8上的检测线M线6包被有IgM二抗;
所述硝酸纤维素膜8上的质控线7包被有抗鸡IgY二抗;
所述新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物用于与待测样品中的新型冠状病毒抗体特异性结合,所述IgG二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgG抗体特异性结合,所述IgM二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgM抗体特异性结合;所述鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物用于与抗鸡IgY二抗特异性结合。
在一些实施例中,所述IgG二抗为鼠抗人IgG二抗、兔抗人IgG二抗或鸡抗人IgG二抗,所述IgM二抗为鼠抗人IgM二抗、兔抗人IgM二抗或鸡抗人IgM二抗。
在一些实施例中,所述抗鸡IgY二抗为兔抗鸡IgY、鼠抗鸡IgY或猪抗鸡IgY。
在一些实施例中,所述新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒重组N蛋白或新型冠状病毒重组S蛋白。
在一些实施例中,所述鸡IgY抗体为鸡IgY单克隆抗体。
实施例1:检测卡组分的制备
1、金标物质的制备
1.1胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,胶体金颗粒大小基本一致,分布均匀,胶体金颗粒直径约20-60nm为合格。
1.2胶体金偶联标记物的制备
1.2.1新型冠状病毒重组N蛋白与胶体金的偶联标记物的制备
用0.2mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值为9.0,将纯化的新型冠状病毒重组N蛋白逐级稀释分别与胶体金溶液混匀,再加入10%的氯化钠溶液混匀,室温静置2小时观察结果,新型冠状病毒重组N蛋白加入量不足以稳定胶体金,会出现由红变蓝的聚沉现象,而新型冠状病毒重组N蛋白加入量达到或超过最低稳定量,胶体金则保持红色不变,加入新型冠状病毒重组N蛋白使胶体金保持红色不变的最低量,即为型冠状病毒重组N蛋白的实际使用量,新型冠状病毒重组N蛋白与胶体金的偶联标记物4℃保存备用。
1.2.2新型冠状病毒重组S蛋白与胶体金的偶联标记物的制备
用0.2mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值为9.5,将纯化的新型冠状病毒重组S蛋白逐级稀释分别与胶体金溶液混匀,再加入10%的氯化钠溶液混匀,室温静置2小时观察结果,新型冠状病毒重组S蛋白加入量不足以稳定胶体金,会出现由红变蓝的聚沉现象,而新型冠状病毒重组S蛋白加入量达到或超过最低稳定量,胶体金则保持红色不变,加入新型冠状病毒重组S蛋白使胶体金保持红色不变的最低量,即为型冠状病毒重组S蛋白的实际使用量,新型冠状病毒重组S蛋白与胶体金的偶联标记物4℃保存备用。
1.2.3鸡IgY单克隆抗体与胶体金的偶联标记物的制备
用0.2mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值为8.5,将纯化的鸡IgY单克隆抗体逐级稀释分别与胶体金溶液混匀,再加入10%的氯化钠溶液混匀,室温静置2小时观察结果,鸡IgY单克隆抗体加入量不足以稳定胶体金,会出现由红变蓝的聚沉现象,而鸡IgY单克隆抗体加入量达到或超过最低稳定量,胶体金则保持红色不变,加入鸡IgY单克隆抗体使胶体金保持红色不变的最低量,即为鸡IgY单克隆抗体的实际使用量,鸡IgY单克隆抗体与胶体金的偶联标记物4℃保存备用。
1.2.4胶体金偶联标记物的混合
将制备的新型冠状病毒重组N蛋白、新型冠状病毒重组S蛋白、鸡IgY单克隆抗体3种偶联标记物按照7:1:7的比例混合,获得新型冠状病毒重组N蛋白、新型冠状病毒重组S蛋白、鸡IgY单克隆抗体的混合偶联标记物,4℃保存备用。
2、试纸条的组装
(1)准备洁净托盘放入样品垫,倒入样品垫处理液,浸泡10min后放入烘箱,设置37℃干燥24h±4h,铝箔袋密封,获得样品垫2,室温保存备用。
(2)采用喷金仪将新型冠状病毒重组N蛋白、新型冠状病毒重组S蛋白全长、鸡IgY单克隆抗体与胶体金的混合偶联标记物喷在结合垫上,37℃烘箱干燥2h,铝箔袋密封,获得金标结合垫3,室温保存备用。
(3)采用划膜仪将兔抗鸡IgY单克隆抗体-7#、抗人IgG抗体-6#、抗人IgM抗体-5#分别划膜于硝酸纤维素膜8上的质控线(即C线)7以及检测线G线5和的检测线M线6上,兔抗鸡IgY单克隆抗体-7#、抗人IgG抗体-6#、抗人IgM抗体-5#划线浓度分别为1.8mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml,37℃烘箱干燥24h±4h,铝箔袋密封,获得带有检测线G线5、检测线M线6(包被有抗人IgG抗体-6#、抗人IgM抗体-5#)和质控线7(包被有兔抗鸡IgY单克隆抗体-7#)的硝酸纤维素膜8,室温保存备用。
(4)将上述处理好的样品垫2、金标结合垫3、滤血膜4、带有检测线G线5、检测线M线6和质控线7的硝酸纤维素膜8、吸收垫9等材料依次粘贴在底板1上,底板1优选为PVC底板,切条、组装、密封,获得本发明的新型冠状病毒IgM+IgG胶体金免疫层析快速检测卡,室温保存备用。组装后的试纸条如图1所示。
实施例2:新型冠状病毒IgM+IgG抗体检测方法
(1)从塑封包装中取出检测卡,置于干燥的桌面上,检测卡上显示有质控区(C)和测试区(G、M);
(2)用采血器具取指尖血,采血完毕后止血,将取好的血样加在加样孔内;
(3)将稀释液瓶盖拧开,往滴入血样的加样孔内滴入稀释液2滴;在15min内读取结果,请勿于20min之后读取结果。
(4)结果判读:
阳性:IgG阳性,位于测试区(G)内出现一条紫红色条带,位于质控区(C)出现一条紫红色条带;IgM阳性,位于测试区(M)内出现一条紫红色条带,位于质控区(C)出现一条紫红色条带;IgG阳性和IgM阳性,位于测试区(G、M)内出现两条紫红色条带,位于质控区(C)出现一条紫红色条带;
阴性:仅在质控区(C)出现一条紫红色条带,在测试区(G、M)内无条带出现;
无效结果:仅在测试区(G)出现一条紫红色条带,在质控区(C)无紫红色条带出现;仅在测试区(M)出现一条紫红色条带,在质控区(C)无紫红色条带出现;在测试区(G、M)出现两条紫红色条带,在质控区(C)无紫红色条带出现;测试区(G、M)和质控区(C)均无紫红色条带出现。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测卡包括底板(1)、样品垫(2)、金标结合垫(3)、滤血膜(4)、硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9);所述样品垫(2)、金标结合垫(3)、滤血膜(4)、硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9)从左至右依次粘贴在底板(1)上,且样品垫(2)与金标结合垫(3)连接,金标结合垫(3)与滤血膜(4)连接,滤血膜(4)与硝酸纤维素膜(8)连接,硝酸纤维素膜(8)与吸收垫(9)连接;
所述硝酸纤维素膜(8)上从左至右依次分布有检测线G线(5)、检测线M线(6)和质控线(7),或者所述硝酸纤维素膜(8)上从左至右依次分布有检测线M线(6)、检测线G线(5)和质控线(7);
所述金标结合垫(3)包被有新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物以及鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物;
所述硝酸纤维素膜(8)上的检测线G线(5)包被有IgG二抗,所述硝酸纤维素膜(8)上的检测线M线(6)包被有IgM二抗;
所述硝酸纤维素膜(8)上的质控线(7)包被有抗鸡IgY二抗;
所述新型冠状病毒抗原与胶体金的偶联标记物用于与待测样品中的新型冠状病毒抗体特异性结合,所述IgG二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgG抗体特异性结合,所述IgM二抗用于与待测样品中的新型冠状病毒IgM抗体特异性结合;所述鸡IgY抗体与胶体金的偶联标记物用于与所述抗鸡IgY二抗特异性结合。
2.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,其特征在于,所述IgG二抗为鼠抗人IgG二抗、兔抗人IgG二抗或鸡抗人IgG二抗,所述IgM二抗为鼠抗人IgM二抗、兔抗人IgM二抗或鸡抗人IgM二抗。
3.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,其特征在于,所述抗鸡IgY二抗为兔抗鸡IgY、鼠抗鸡IgY或猪抗鸡IgY。
4.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,其特征在于,所述新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒重组N蛋白或新型冠状病毒重组S蛋白。
5.如权利要求1所述的新型冠状病毒抗体胶体金免疫层析检测卡,其特征在于,所述鸡IgY抗体为鸡IgY单克隆抗体。
6.如权利要求1-5任一所述的检测卡用于检测新型冠状病毒抗体的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将待测样品滴加至样品垫(2)上,5min-15min后,待测样品逐渐层析至金标结合垫(3)、滤血膜(4)、硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9)上,根据显色结果判断待测样品中新型冠状病毒抗体的情况;
S2:若检测线G线(5)和质控线(7)内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgG抗体呈阳性;若检测线M线(6)和质控线(7)内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgM抗体呈阳性;若检测线G线(5)、检测线M线(6)和质控线(7)内均出现紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒IgM抗体和IgG抗体呈阳性;
若仅在质控线(7)内出现紫红色条带,而检测线G线(5)和检测线M线(6)内均无紫红色条带,则待测样品中新型冠状病毒抗体呈阴性;
若在检测线G线(5)和/或检测线M线(6)内出现紫红色条带,而质控线(7)内无紫红色条带,则所述检测卡无效;若在检测线G线(5)、检测线M线(6)和质控线(7)内均无紫红色条带,则所述检测卡无效。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述待测样品用磷酸盐缓冲液稀释后滴至样品垫(2)上。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述待测样品的pH值为6.5-8.0。
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