CN103163298B - 一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条，包括上样垫(1)、胶体金垫(2)、NC膜(3)、吸样垫(4)和塑料板(7)，胶体金垫上标记有T1抗体和TP融合蛋白，NC膜上包被抗人IgMμ链单克隆抗体构成T线(5)和羊抗鼠IgG抗体构成C线(6)，所述上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料板上形成检测试剂条。本发明与现有技术相比具有灵敏度高、特异性强、操作简便快捷的特点，可为临床早期诊断、早期治疗及驱梅治疗后的疗效观察提供确切的实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种梅毒螺旋体IgM抗体检测试剂，具体是涉及一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条及其制备方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体(Treponemapallidum，TP)引起的一种性传播疾病，其主要通过性行为和血液传播，也可通过胎盘母婴垂直传播。近年来我国的梅毒发病率有逐年上升的趋势，2009年在全国法定传染病疫情报告中，梅毒的发病率位居第三位，与2008年同比增长了18.39％。梅毒患者是梅毒的惟一传播源，对梅毒进行早诊断、早治疗是控制其蔓延至关重要的一个环节。梅毒螺旋体可侵犯全身各脏器，造成多器官病变、功能失常、组织破坏，甚至死亡，对人们的健康构成了严重的威胁。由于梅毒螺旋体具有较强的传染性和病程的复杂性，且梅毒在早、中期临床表现不显著，常常造成病人对病情的忽视，给病人身体健康带来极大的危害，也使梅毒的传播更为加快。
血清学检测是诊断梅毒的重要实验室检测方法。目前梅毒的血清学检测方法主要有两种：一类是非梅毒螺旋体抗原血清试验，如快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)等，此类试验检测的是心磷脂抗体，为非特异性抗体检测试验，常用作梅毒的筛查试验，亦可用于梅毒的疗效观察、复发及再感染。由于此类实验受多种因素影响，常出现生物学假阴性和假阳性结果，对一、三期梅毒的阳性率不高，因此仅适于二期梅毒的诊断，而不适于诊断一、三期梅毒，包括潜伏梅毒、神经梅毒的诊断。作疗效观察时，常出现血清学固定，使临床医生难以判断治疗终点。另一类是梅毒螺旋体抗原血清实验，如梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(TP-ELISA)等，这类试验的敏感性高、特异性强，临床常用此类试验作为梅毒的确认试验。但是此类试验检测的是梅毒螺旋体IgG抗体和IgM抗体，而IgG抗体长期存在，血清反应持续存在阳性，不能用作梅毒治疗的疗效观察。因此迫切需要寻求一种敏感性高、特异性强的梅毒早期检测方法，为临床早期诊断、早期治疗及驱梅治疗后的疗效观察提供确切的实验依据。
抗梅毒螺旋体IgM抗体是梅毒感染最早产生的抗体，患者一般感染后两周即可从血清中测出，因此是梅毒早期感染并活动的标志。IgM抗体一般在感染的早期呈阳性，随着疾病的发展而增加，IgG抗体随后才慢慢上升，经有效治疗后IgM抗体消失。晚期潜伏梅毒患者出现IgM抗体阳性，需要考虑是否再感染或体内未清除病灶再燃的情况。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必是提示该患者具有传染性。此外，TP-IgM抗体对诊断先天性梅毒和神经梅毒具有重要意义。由于IgM抗体的分子量较大，不能透过胎盘屏障和血脑屏障等天然屏障，如若在新生儿血液中或成人脑脊液中检测到TP-IgM抗体，则可诊断先天性梅毒或神经性梅毒。目前认为TP-IgM抗体测定可用于：①梅毒的早期诊断；②梅毒治疗后的疗效观察；③梅毒复发或再感染的判断；④新生儿胎传梅毒的诊断；⑤神经梅毒的诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条及其制备方法。(因为题目就是及其制备方法，而且检测方法新颖不是很大，写成及其制备方法，而且在技术方案中检测方法的体现不多，是考虑到后期的意见答复。)
实现上述目的本发明的技术方案为，一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条，包括上样垫、胶体金垫、NC膜、吸样垫和塑料板，胶体金垫上标记有T1抗体和TP融合蛋白，NC膜上包被抗人IgMμ链单克隆抗体构成T线和羊抗鼠IgG抗体构成C线，所述上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料板上形成检测试剂条；或胶体金垫上标记抗人IgMμ链单克隆抗体，NC膜上包被TP重组抗原构成T线(5)和羊抗鼠IgG抗体构成C线(6)，同时包被标示加样位置的加样指示线(8)，所述上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料板上形成检测试剂条。
所述的TP抗原为TP15KD、TP17KD、TP47KD抗原中的一种或几种。
所述试剂条的制备方法包括以下步骤：
1)胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，用0.2MK2C03调节胶体金溶液的pH为8.5-9.5，然后置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液含0.5mg-3mgT1抗体缓慢滴加所述单抗至胶体金溶液中，室温搅拌1小时，加入BSA和PEG20000封闭，12000rpm离心，弃上清，沉淀加入保存液浓缩至原体积的1/10，按每毫升1ug、2.5ug、5ug加入TP融合抗原，室温搅拌1小时左右，用金标稀释液将浓缩胶体金稀释至浓度为5％、10％、15％、20％，按每毫升金标稀释液铺22cm2的比例分别均匀地铺在无纺布上，再置干燥室干燥2-4小时，切成6mm胶体金条，为胶体金垫；
标记抗人IgMμ链单克隆抗体的胶体金垫的方法同上操作；
2)NC膜的制备
用0.01M pH7.2的PBS将抗人IgMμ链单克隆抗体稀释成0.4-0.6mg/ml进行包被构成T线；同时包被羊抗鼠IgG抗体作为质控线C线，包被完成后干燥NC膜3～4小时；
NC膜上包被TP重组抗原的方法同上操作；
3)试剂条的装配
从干燥室内取出塑料支撑板，将已包被的NC膜粘贴在塑料支撑板的中部，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，在胶体金垫另一侧搭接上样垫；在NC膜C线一侧距边缘搭接吸样垫，然后用裁剪机将贴好的塑料板切成试纸条；
其中，干燥室的温度为20-25℃，湿度小于30％。
本发明与现有技术相比具有灵敏度高、特异性强、操作简便快捷的特点，可为临床早期诊断、早期治疗及驱梅治疗后的疗效观察提供确切的实验依据。
附图说明
图1是梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条的结构示意图；
1、上样垫；2、胶体金垫；3、硝酸纤维素(NC)膜；4、吸样垫；
5、T线；6、C线；7、塑料支撑板；
图2是梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条的结构示意图；
1、上样垫；2、胶体金垫；3、硝酸纤维素(NC)膜；4、吸样垫；
5、T线；6、C线；7、塑料支撑板；8、加样加样指示线
具体实施方式
为便于本发明技术方案的理解，下面结合具体的实施方式进行介绍。
实施例1
参见图1，一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条包括上样垫(1)、胶体金垫(2)、NC膜(3)、吸样垫(4)和塑料板(7)，胶体金垫上标记有T1抗体和TP融合蛋白，NC膜上包被抗人IgMμ链单克隆抗体构成T线(5)和羊抗鼠IgG抗体构成C线(6)，所述上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料板上形成检测试剂条。
所述检测试剂条通过以下的方法进行制备：
1.胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，0.2MK2C03调节胶体金溶液的pH为8.5-9.5，然后置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液含0.5mg-3mgT1抗体缓慢滴加所述单抗至胶体金溶液中，室温搅拌1小时，加入BSA和PEG20000封闭，12000rpm离心，弃上清，沉淀加入保存液浓缩至原体积的1/10，按每毫升1ug、2.5ug、5ug加入TP融合抗原，室温搅拌1小时左右，用金标稀释液将浓缩胶体金稀释至不同浓度(5％、10％、15％、20％)，按每毫升金标稀释液铺22cm2的比例分别均匀地铺在无纺布上，再置干燥房(温度20-25℃，湿度在小于30％)干燥2-4小时。切成6mm胶体金条，为胶体金垫。
2.NC膜的制备
用0.01M pH7.2的PBS将抗人IgMμ链单克隆抗体稀释成0.4-0.6mg/ml进行包被构成T线；同时包被羊抗鼠IgG抗体作为质控线C线，包被完成后干燥NC膜3～4小时。
3.试纸条的装配
在干燥室内温度20～25℃，湿度小于30％，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧距边缘处搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成适当宽度的试纸条。切好的试纸条也可以装入塑料卡内，形成检测试剂卡。
临床样本检测
将制备好的试剂条平放，先在上样垫加样位置加入3-10ul待检样本，再加入适量稀释液，静置20分钟观察检测结果。以日本富士株式会社生产的TPPA试剂和德国欧蒙公司生产FTA-ABS法试剂为对照，检测50份临床阳性样本，本试剂检出TP-IgM阳性50份，阳性符合率100％；50份临床阴性样本，本试剂检出50份阴性，特异性100％。
实施例2
同实施例1相似，区别在于标记、包被蛋白对调，即胶体金垫上标记抗人IgMμ链单克隆抗体，NC膜上检测区包被TP重组抗原作为T线(5)，同时包被标示加样位置的加样指示线(8)，具体参见图2。检测时先在NC膜标示线上加入3～5ul待检标准品，然后向上样垫上加入适量样本稀释液，静置20分钟观察检测结果。试剂条装配及临床样本检测结果判断均和实施例1相同。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种梅毒螺旋体IgM抗体快速检测试剂条，包括上样垫(1)、胶体金垫(2)、NC膜(3)、吸样垫(4)和塑料板(7)，其特征在于，胶体金垫上标记有T1抗体和TP融合蛋白，NC膜上包被抗人IgMμ链单克隆抗体构成T线(5)和羊抗鼠IgG抗体构成C线(6)，所述上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料板上形成检测试剂条。
2.根据权利要求1所述的检测试剂条，其特征在于，所述试剂条的制备方法包括以下步骤：
1)胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，用0.2MK2CO3调节胶体金溶液的pH为8.5-9.5，然后置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液含0.5mg-3mgT1抗体缓慢滴加T1抗体至胶体金溶液中，室温搅拌1小时，加入BSA和PEG20000封闭，12000rpm离心，弃上清，沉淀加入保存液浓缩至原体积的1/10，按每毫升1ug、2.5ug、5ug加入TP融合抗原，室温搅拌1小时左右，用金标稀释液将浓缩胶体金稀释至浓度为5％、10％、15％、20％，按每毫升金标稀释液铺22cm2的比例分别均匀地铺在无纺布上，再置干燥室干燥2-4小时，切成6mm胶体金条，为胶体金垫；
2)NC膜的制备
用0.01M pH 7.2的PBS将抗人IgMμ链单克隆抗体稀释成0.4-0.6mg/ml进行包被构成T线；同时包被羊抗鼠IgG抗体作为质控线C线，包被完成后干燥NC膜3～4小时。
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