JPH06105254B2 - 内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法 - Google Patents

内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法

Info

Publication number
JPH06105254B2
JPH06105254B2 JP3002200A JP220091A JPH06105254B2 JP H06105254 B2 JPH06105254 B2 JP H06105254B2 JP 3002200 A JP3002200 A JP 3002200A JP 220091 A JP220091 A JP 220091A JP H06105254 B2 JPH06105254 B2 JP H06105254B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
membrane
ligand
acid
alkaline phosphatase
passing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP3002200A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH04249768A (ja
Inventor
コリーン・エム・ニィク
Original Assignee
ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー filed Critical ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Publication of JPH04249768A publication Critical patent/JPH04249768A/ja
Publication of JPH06105254B2 publication Critical patent/JPH06105254B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating And Analyzing Materials By Characteristic Methods (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は被分析体のイムノアッセイに関するものであ
り、より詳細にはメンブレンイムノアッセイ法およびそ
れに有用な個々の試薬に関するものである。
【０００２】発明の背景 流体試料中に低濃度で存在する物質−−一般に被分析体
と呼ぶ−−の濃度を測定するための迅速な、かつ感度の
高いアッセイシステムが開発された。イムノアッセイ法
は抗原またはハプテンが特異的抗体に結合することに基
づくものであり、高度の特異性および感度を与えるの
で、特に有用である。これらのアッセイ法は上記試薬の
うち１種を標識された形で使用し、この標識試薬はトレ
ーサーと呼ばれる。
【０００３】イムノアッセイにおいては標識としてしば
しば酵素が用いられる。通常の酵素イムノアッセイ法
（ＥＩＡ）においては、酵素は特異的に結合する抗原−
抗体対の１成分に共有結合し、生成した酵素結合体が基
質と反応してシグナルを発し、これを検出および測定す
る。シグナルは肉眼もしくは分光測光法により検出され
る色の変化であってもよく、または基質が蛍光により検
出される物質に変換されるものであってもよい。
【０００４】ＥＩＡの簡便な形式は、アッセイ試薬のう
ち１種が固体状支持体に固定化された固相イムノアッセ
イ法である。固体状支持体はディップスティック、試験
管もしくはキュベットの内壁、またはマイクロタイター
プレートのウェルであってもよい。特に有用な固体状支
持体は微孔質メンブレンである。
【０００５】メンブレンイムノアッセイ法はしばしばフ
ロースルーアッセイ法と呼ばれる。流れが毛管作用によ
り生じるフロースルーＥＩＡの例は、米国特許第３，８
８８，６２９号（バグショーら）、米国特許第４，２４
６，３３９号（コールら）および米国特許第４，６３
２，９０１号（バルキルスら）各明細書に記載されるア
ッセイ法である。米国特許第４，２７７，５６０号（グ
レイ）および米国特許第４，８１２，２９３号（マクロ
ーリンら）はそれぞれ圧力および真空を用いるフロース
ルーアッセイ法の例である。
【０００６】メンブレンＥＩＡの場合、いかなる数量の
液体をもメンブレンに貫流させてアッセイ成分の結合、
分離および洗出を行うことができる。大部分のメンブレ
ンＥＩＡ法の最終工程は発色試薬、たとえば色原体をメ
ンブレンに導通するものである。色原体はメンブレンに
捕獲された酵素と反応して色の変化を生じ、これが被分
析体の存在を示すものとして検出され、または被分析体
の濃度を示すものとして測定される。
【０００７】イムノアッセイに慣用される酵素はアルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）である。この酵素は実際上す
べての細胞中に存在し、ホスフェート基の除去をその主
要な機能としてもつ。これは広く研究され、低いｐＨで
失活されることは周知である（シュレージンガー（Ｓｃ
ｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４０，４２
８４（１９６５）；マッコーム（ＭｃＣｏｍｂ）ら，Ａ
ｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，プレナム出
版社，ニューヨーク州ニューヨーク，１９７９年，４１
３頁）。
【０００８】ＡＰを標識として用いる比色アッセイ法に
おいてしばしば遭遇する問題は、酵素の遍在性により起
こる。臨床試料中の抗原に関する大部分のアッセイ法は
抗原を分離せずに行われる。試料中にＡＰが存在すると
（以下、内在ＡＰと呼ぶ）、これがメンブレンもしくは
アッセイ成分の１つに非特異的に結合し、またはアッセ
イプロトコールにおける洗浄工程によって完全には除去
されない可能性がある。この場合、臨床的に陰性の試料
から陽性のシグナルが生じる。本発明はこの問題を克服
することを目的とする。
【０００９】発明の要約 液状臨床試料中に存在する疑いのあるリガンドを測定す
るためのフロースルーアッセイ法は、不活性蛋白質で被
覆されたメンブレンに試料を導通し、これによりリガン
ドをメンブレンに付着させることを含む。本方法の他の
形態においては、メンブレンはさらにリガンドに特異的
に結合する抗リガンドで被覆される。本明細書において
不活性蛋白質という語は、アッセイの他のいずれの成分
に対しても免疫学的に非反応性であり、実質的にアッセ
イ媒質中の他の蛋白質に非特異的に結合しない蛋白質を
意味し、ただし不活性蛋白質は本発明のアッセイ法の一
部ではない他の物質に対しては免疫学的に十分に反応性
であってもよいと解される。
【００１０】試料をメンブレンに導通して結合させたの
ち、有機酸をメンブレンに導通して試料中の内在ＡＰを
失活させる。次いでＡＰを含有するトレーサーをメンブ
レン上の抗原と共にインキュベートしてトレーサーを抗
原に結合させる。メンブレンに結合したＡＰをインドキ
シル誘導体からなる基質と接触させると、これが有色の
不溶性物質に変換され、メンブレン上に可視スポットと
して析出する。好ましい基質はさらにテトラゾリウム塩
を含む。所望によりメンブレンに色止め（ｃｏｌｏｒ
ｓｔｏｐｐｉｎｇ）および色彩安定化溶液を導通するこ
とにより、スポットの色と背景の色のコントラストを後
に観察するために安定化することができる。
【００１１】好ましいリガンドはウイルス性抗原であ
り、これはトレーサーのＡＰ成分が特異的抗体に結合し
たアッセイ形式により検出される。好ましい失活用の酸
はヒドロキシポリカルボン酸であり、その極めて好まし
いものはクエン酸である。
【００１２】本発明には、本発明のアッセイ法を実施す
るのに有用な材料のキットが包含される。
【００１３】従って本発明は、標識としてＡＰを使用
し、かつ試料中の内在ＡＰを失活させるための有機酸洗
浄を採用する、臨床試料中の抗原に関するフロースルー
アッセイ法を提供する。低いｐＨにおいてＡＰが失活す
るのは周知の現象であるが、本発明の有機酸洗浄は抗原
自体を変性させることなく内在ＡＰを選択的に失活させ
る。これに対し鉱酸による内在ＡＰの失活は抗原とトレ
ーサーの結合を妨げ、アッセイを妨害するであろう。
【００１４】詳細な説明 本発明は種々の形態により実施されるが、ここに本発明
の好ましい形態を詳述する。ただしこの記述は本発明の
原理の例示であり、説明および記載されるこれらの形態
に本発明を限定するためのものではない。本発明の範囲
は特許請求の範囲およびそれらの均等物により判定され
るであろう。
【００１５】本発明の１観点は、標識としてＡＰを用い
ることによる液体中のリガンドの比色フロースルーイム
ノアッセイ法である。本発明によればメンブレンを有機
酸、好ましくはヒドロキシ多塩基酸で洗浄することによ
り、臨床試料中にしばしば存在する内在ＡＰを失活させ
ることができ、従ってメンブレン上に生じる色はリガン
ドのみによるものであることが見出された。
【００１６】本発明のアッセイ法は当技術分野で知られ
ているフロースルーアッセイに適したいずれか適宜なア
ッセイ装置中で実施することができる。好ましい装置に
おいてはアッセイ液の流れはメンブレンの下側に配置さ
れた吸着材料パッドにより誘発される毛管作用により促
進される。この種の装置は多数報告されており、数種が
市販されている。装置自体は本発明の特色を示すもので
はない。
【００１７】リガンドはいかなる供給源からのものであ
ってもよく、抗原、抗体またはハプテンのいずれであっ
てもよい。たとえばリガンドは体液中に存在する抗原で
あってもよく、またはこれは体液から単分離されたのち
異なる液体、たとえば緩衝液に装入されてもよい。他の
場合、リガンドは体液以外の供給源、たとえばクラミジ
ア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）などの微生物の培養物または
その細胞抽出物からのものであってもよい。好ましいリ
ガンドは抗原であり、極めて好ましくは体液中に存在す
るウイルス性抗原、たとえばアデノウイルス、パライン
フルエンザ３ウイルスならびに極めて好ましくは単純ヘ
ルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）お
よびインフルエンザＡ（ＦｌｕＡ）である。本発明を以
下一般的にウイルス性抗原について記述する。
【００１８】ここでアッセイ成分について詳述すると、
多孔質メンブレンはアッセイの他の成分または工程によ
って全く妨害されないいかなる材料のものであってもよ
い。適切なメンブレンはたとえばグラスファイバー、ポ
リビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ニトロ
セルロースおよびナイロンである。この種のメンブレン
は当技術分野で周知であり、パル、ニューヨーク州グレ
ンコーブ；ミリポア、マサチュセッツ州ベッドフォー
ド；およびシュライヘル・アンド・シュル、ニューハン
プシャー州キーンなどの業者から市販されている。
【００１９】メンブレンをリガンドに特異的な抗リガン
ドで被覆することができる。たとえばリガンドが好まし
いウイルス性抗原である場合、抗リガンドは該抗原に特
異的に結合してこれによりメンブレン上に抗原を捕獲す
る抗体である。メンブレンは捕獲用抗体により占有され
ていないメンブレン上の結合部位を充填するために不活
性蛋白質でさらに被覆されていてもよい。適切な不活性
蛋白質の限定ではない代表例はカゼインおよびアルブミ
ンであるが、他は当業者に自明であろう。不活性蛋白質
および抗体によるメンブレンの被覆は共にいずれか適切
な方法により行うことができ、好ましくはメンブレンを
蛋白質の溶液と共にインキユベートし、これにより蛋白
質をメンブレンの高分子マトリックス表面内へ物理的に
吸収させることにより行う。
【００２０】本発明の好ましい形態においては、メンブ
レンを不活性蛋白質で被覆し、この表面に抗原を直接吸
収させ、捕獲用抗体なしにアッセイを行う。捕獲用抗体
なしのフロースルーアッセイ法は出願中の米国特許出願
第２７２，３８０号明細書（１９８８年１１月１７日出
願、同一出願人）に示されている。
【００２１】捕獲用抗体および／または不活性蛋白質の
被膜を備えたメンブレンを、ウイルス性抗原が含有され
る疑いのある試料に暴露する。好ましくは被覆メンブレ
ンを試料と共に一時的フロースルー形式で約１−１５分
間、好ましくは約５分間、約０−５０℃、好ましくはほ
ぼ周囲温度においてインキユベートする。この処理によ
り試料中の抗原は、試料中のその濃度に比例して被覆メ
ンブレンに捕獲される。さらに試料が大量の余分な蛋白
質を含む場合、たとえば試料が体液である場合ですら、
ウイルス性抗原は優先的に吸収されることが認められ
た。
【００２２】インキユベーションののち、内在ＡＰを失
活させる試薬を含有する洗浄液をメンブレンに導通す
る。アッセイの他の観点に影響を及ぼさずに内在ＡＰを
失活させる有機酸はいずれも使用しうる。一塩基酸、た
とえば乳酸または酢酸を使用しうる。好ましい酸は多塩
基酸、たとえばコハク酸およびグルタル酸である。極め
て好ましい酸はヒドロキシ多塩基酸、たとえばリンゴ酸
および酒石酸、特にクエン酸である。失活用の酸は好ま
しくは水、緩衝液または食塩液中の溶液としてメンブレ
ンに導通される。約０．０５−１．０Ｍ、好ましくは約
０．１−０．２Ｍ、ｐＨ約１−３の水溶液を用いること
が好ましい。大部分の臨床試料については、どの程度の
内在ＡＰが存在しても失活させるには約３００μＬの溶
液で十分である。高濃度の内在ＡＰを含有する疑いのあ
る試料については、より多量の酸溶液を使用しうる。
【００２３】トレーサーは下記のように抗原（競合アッ
セイ）または検出抗体（サンドイツチアッセイ）のいず
れかに結合したＡＰからなる。種々の業者から多種のＡ
Ｐ製剤が市販されており、それらが抗原または抗体に結
合しうる限り標識として有用である。抗原または抗体へ
のＡＰの結合は周知であり、当業者に十分に理解されて
いる。
【００２４】当技術分野で知られているＡＰに対する基
質はいずれも使用しうる。好ましい基質はメンブレン上
に不溶性析出物を生じるものである。極めて好ましい基
質はインドキシル誘導体、たとえばインドキシルホスフ
ェートである。当技術分野で知られている他のインドキ
シル系基質、たとえば５−ブロモ−４−クロロ−インド
キシル誘導体も使用しうる。標準法によって適切なイン
ドキシル誘導体を製造するのに有用なインドキシル類の
広範なリストがホルト（Ｈｏｌｔ）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ，１９５８，１４８，４８１
−４９４に挙げられている。基質は水、食塩液または適
切な緩衝液に溶解されてもよい。
【００２５】インドキシル系基質の開裂により生じる色
が、基質組成物にテトラゾリウム塩を含有させることに
より増強されることが好ましい。適切なテトラゾリウム
塩はたとえばｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレ
ット（ＩＮＴ）およびニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）である。視覚検査に十分な強度の色がテトラゾリ
ウム塩の不在下で生じたとしても、この試薬を含有させ
ることによってより濃い色のスポットが得られ、これは
視覚検査をより容易にし、従ってアッセイの感度を高め
る。
【００２６】本発明のメンブレンアッセイ法は競合また
はサンドイッチ法により行うことができ、その際メンブ
レンを貫流する液体の流れはメンブレンの下側に配置さ
れた吸収材料により誘発される毛管作用により生じても
よい。本発明の競合アッセイ法においては、トレーサー
はＡＰが結合した抗原であり、抗原とトレーサーが被覆
メンブレン上の有効結合部位に対して競合する。本発明
の好ましいサンドイッチアッセイ形式においては、トレ
ーサーはＡＰに結合した抗原に対して特異的な検出抗体
である。好ましい検出抗体は、当技術分野で周知の常法
により形成されたモノクローナル抗体である。次いで基
質組成物をメンブレンに導通する。メンブレン上のＡＰ
が基質を色により検出しうる物質に変換する。発色の程
度は抗原濃度に比例し、これは予め定められた量の抗原
を含有する液体試料をアッセイして色の強度を比較する
ことにより判定される。
【００２７】所望により、色彩安定剤の溶液をメンブレ
ンに導通することにより発色反応を停止し、メンブレン
上の色を実質的に安定化することができる。適切な安定
剤は鉱酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸およびピロリン
酸、または所望により有機溶剤を含有する有機酸水溶液
である。適切な有機酸はたとえば酢酸、酒石酸、シュウ
酸、コハク酸、安息香酸、および好ましくはクエン酸で
ある。適切な有機溶剤はメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、アセトンおよびテトラヒドロフランであ
る。安定化用酸の濃度は、所望により約３０−７０重量
％の有機溶剤を含有する水または緩衝液中において約
０．１−０．５Ｍである。色彩安定剤に関するこれ以上
の詳細は同一出願人による出願中の米国特許第４１４，
１６１号明細書（１９８９年、９月２８日出願）に示さ
れている。
【００２８】本発明の他の観点は、本発明方法によりリ
ガンドのアッセイを行うための試薬キットまたは材料の
パッケージである。このキットは不活性蛋白質および所
望により捕獲用抗リガンドで被覆されたメンブレン、リ
ガンドまたは検出用抗リガンドの一方に結合したＡＰか
らなるトレーサー、ＡＰに対する基質、ならびに内在Ａ
Ｐを失活させるための有機酸、好ましくは二塩基酸の溶
液を含む。キットは酸の溶液、好ましくは有機溶剤を含
有する水溶液を含む色彩安定剤を含んでいてもよい。キ
ットはリガンドに対する標準液、たとえば既知濃度のリ
ガンド試料１種もしくは２種以上を含み、または他の試
薬、基質、もしくは溶液、たとえば食塩液、および用
具、たとえばアッセイを行うのに有用なバイアルもしく
はスポイトを含んでもよい。メンブレンはアッセイ液が
毛管作用によりメンブレンを貫流するのを促進するため
にメンブレンの下側に配置された材料、たとえば吸い取
り紙を含むハウジング、好ましくはプラスチック内に収
容されていてもよい。
【００２９】以下の例は本発明をさらに説明するために
提示されたものであり、本発明を限定するものと考える
べきではない。
【００３０】実施例 ＩインフルエンザＡウイルスのアッセイ 下記の構造のメンブレンフィルター積層物を組み立て
た：上層−３ミクロンのバイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎ
ｅ、登録商標）メンブレン（パル、ニューヨーク州グレ
ンコーブ、＃ＢＩＡ００３０ＨＣ５）。０．３％カゼイ
ンを含有するリン酸緩衝液に周囲温度で３０分間浸漬す
ることにより下塗り。
【００３１】次層−不織レーヨンシート（シュライヘル
・アンド・シュル、ニューハンプシャー州キーン；＃５
−Ｓ）。
【００３２】下層−セルロース製吸収パッド（２）（フ
ィルトレーション・サイエンシズ、ペンシルベニア州マ
ウント・ホリー・スプリングズ；＃ＥＤ３２０−２０
０）。
【００３３】メンブレン層は、上層の上方に形成された
受容ウェルを含むプラスチック製ホルダーに挿入され
た。このウェル内に、受容ウェルより狭い開口を備え、
メンブレン上層に接して位置する制流インサートがはめ
込まれた。
【００３４】Ａ型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ−
Ａ）（ＷＳＮ株）に感染したメイディン−ダービー犬の
腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を下記緩衝液中に希釈したものを
用いて、抗原原液を調製した：２５０ｍＭのトリスＨＣ
ｌ、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
１ｍＭのエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢
酸（ＥＧＴＡ）、４％（ｖ／ｖ）のポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート（ツウィーン２０）、１％の
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、０．２％のナトリウム
アジド（ＮａＮ3）、ｐＨ８．５。同様にして未感染Ｍ
ＤＣＫ細胞から対照抗原を調製した。
【００３５】２５０μＬアリコートのこの抗原（または
対照）を上記装置に装入し、制流インサートを貫流して
メンブレン上層上に排液させ、次いで３００μＬの０．
１５Ｍクエン酸水溶液を導通した。次いで制流インサー
トを取り除き、この装置に１ｍｇ／ｍＬの家兎ＩｇＧを
追加含有するトリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）１５０μＬを
添加した。
【００３６】アルカリホスファターゼである子牛腸ＡＰ
（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディ
アナポリス）に結合した２７μｇ／ｍＬの抗−Ｆｌｕ−
Ａ抗体を含有する溶液を下記緩衝液中に調製した：１０
０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２００
ｍＭのリン酸ナトリウム、１％のカゼイン、１ｍＭの塩
化マグネシウム、０．１ｍＭの塩化亜鉛、１ｍＭの２−
メルカプトエタノールおよび０．２％のＮａＮ3、ｐＨ
７．２。この混合物１５０μＬアリコートを上記装置に
添加し、メンブレン積層物に吸収させた。短時間（２
分）のインキュベーションののち、装置を３００μＬの
ＴＢＳ（ＩｇＧ不含）で洗浄した。
【００３７】０．３３ｍｇ／ｍＬのニトロブルーテトラ
ゾリウム、１％のメタノールおよび０．２％のＮａＮ3
を含有する溶液１５０μＬを装置に添加した。次いで、
２ｍｇ／ｍＬのインドキシルホスフェート、５０ｍＭの
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）
アセテート中の１６ｍＭのレバミソール（ｌｅｖａｍｉ
ｓｏｌｅ）、０．２％のＮａＮ3、１ｍＭの塩化マグネ
シウムを含有する溶液（ｐＨ９．８）１５０μＬを添加
した。周囲温度で５分間のインキュベーションののち、
１５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する安定剤溶液
（ｐＨ３．０）１５０μＬを添加することにより発色反
応を停止した。生じたシグナルスポットの相対的色濃度
を反射濃度計（グレタグ、ワシントン州シアトル、モデ
ル１８３）による反射率観測単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ
ｕｎｉｔ）で測定した。一連の抗原希釈液につき実施
した結果を図面に示し、陰性対照（無酸）および１Ｎ
ＨＣｌ、４．５Ｎ Ｈ2ＳＯ4、５％酢酸を用いて得た結
果と比較する。酢酸およびクエン酸洗浄を採用した場合
（および無酸）は抗原濃度の増大と共に反射率が増大し
たことが容易に認められ、これはアッセイが成功したこ
とを示す。しかしＨＣｌおよびＨ2ＳＯ4は抗原濃度の増
大と共に反射率が増大しなかったという点で、アッセイ
が不成功であった。いずれかの理論により拘束されるこ
とは望まないが、鉱酸はメンブレン上で抗原を変性さ
せ、結合抗体への結合を阻害したと考えられる。
【００３８】実施例 ＩＩ失活用酸の比較 Ｉ． 実施例Ｉに記載したメンブレンフィルター積層
物、プラスチックホルダーおよびアッセイプロトコール
を採用して、下記に挙げた失活用酸を感染および非感染
ＭＤＣＫ細胞において内在ＡＰの失活における有効性に
つき比較した。
【００３９】Ａ．．．０．１５Ｍ クエン酸 Ｂ．．．０．１５Ｍ グルタル酸 Ｃ．．．０．１５Ｍ 酒石酸 Ｄ．．．０．１５Ｍ コハク酸 Ｅ．．．０．１５Ｍ リンゴ酸 Ｆ．．．０．１５Ｍ 乳酸 Ｇ．．．無酸−陰性対照 この実験の結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】ａ） ＷＳＮ感染ＭＤＣＫ細胞 ｂ） 非感染ＭＤＣＫ細胞 ｃ） （＋）および（−）は視覚的に検出される色の有
無を示す。
【００４２】上記の表から分かるように、有機酸の存在
は感染細胞のアッセイを妨害せず、非感染細胞（無抗
原）について実施した試験は各酸につき陰性のシグナル
を与え、これらの細胞における内在ＡＰが失活したこと
を示す。
【００４３】ＩＩ． 実施例Ｉを反復し、ただしＭＤＣ
Ｋ細胞を用いず、希釈用緩衝液に４．８単位／試験の大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＰをスパイクした。従ってこの
実験の場合は抗原が存在しないのでメンブレン上に標識
ＡＰが捕獲されず、内在ＡＰである大腸菌ＡＰスパイク
が存在する唯一のＡＰであった。実験の結果は下記のと
おりである。
【００４４】
【表２】
【００４５】 酸 反射率 視覚検査 Ａ ．０３ （−） Ｂ ．０６ （＋） Ｃ ．０４ （−） Ｄ ．０６ （＋） Ｅ ．０６ （＋） Ｆ ．０６ （＋） Ｇ ．０９ （＋） この実験から分かるように、失活用酸（Ａ−Ｆ）はすべ
てＡＰスパイクのため無酸の対照（Ｇ）と比較してシグ
ナルが低下し、クエン酸（Ａ）および酒石酸（Ｃ）が極
めて有効であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアッセイ法によるインフルエンザウイ
ルスのアッセイ結果を示す図である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 液体試料中のリガンドの測定法におい
    て、 ａ）リガンドを含有する疑いのある液体試料を不活性蛋
    白質で被覆された多孔質メンブレンに導通し、これによ
    り該リガンドを被覆メンブレンに固着させ； ｂ）有機多塩基酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導
    通し； ｃ）抗リガンドに結合したアルカリホスファターゼから
    なるトレーサーを含有する溶液を該メンブレンに導通
    し、これにより該トレーサーをリガンドに結合させ； ｄ）テトラゾリウム塩およびインドキシル誘導体からな
    る、アルカリホスファターゼに対する基質溶液を該メン
    ブレンに導通し、該基質がメンブレン上のアルカリホス
    ファターゼにより有色物質に変換され；そして ｅ）メンブレン上の該有色物質を検出することにより第
    １の液体中のリガンドの存在を判定することを含む方
    法。
  2. 【請求項２】 リガンドがウイルス性抗原である、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 多塩基酸がクエン酸、コハク酸、グルタ
    ル酸、リンゴ酸および酒石酸よりなる群から選ばれる、
    請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 さらに、メンブレンに色彩安定化溶液を
    導通することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 液体試料中のリガンドの測定法におい
    て、 ａ）リガンドを含有する疑いのある液体試料を、抗リガ
    ンドおよび不活性蛋白質よりなる群から選ばれる試薬で
    被覆された多孔質メンブレンに導通し、これにより該リ
    ガンドを被覆メンブレンに固着させ； ｂ）有機酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導通し； ｃ）アルカリホスファターゼからなるトレーサーを含有
    する溶液を該メンブレンに導通し、これにより該トレー
    サーを抗リガンドおよびリガンドの一方に結合させて、
    メンブレン上にアルカリホスファターゼを含有する結合
    画分を形成させ； ｄ）インドキシル誘導体からなる、アルカリホスファタ
    ーゼに対する基質溶液を該メンブレンに導通して有色物
    質を形成させ；そして ｅ）メンブレン上の該有色物質を検出することにより第
    １の液体中のリガンドの存在を判定することを含む方
    法。
  6. 【請求項６】 液体試料中のウイルス性抗原の測定法に
    おいて、 ａ）ウイルス性抗原を含有する疑いのある液体試料を不
    活性蛋白質で被覆されたメンブレンに導通し、これによ
    り該ウイルス性抗原を被覆メンブレンに固着させ； ｂ）クエン酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導通
    し； ｃ）アルカリホスファターゼに結合した抗体を含有する
    溶液を該メンブレンに導通し、これにより該抗体を該抗
    原に結合させて、メンブレン上にアルカリホスファター
    ゼを含有する結合画分を形成させ； ｄ）インドキシルホスフェートおよびニトロブルーテト
    ラゾリウムからなる基質溶液を該メンブレンに導通し、
    アルカリホスファターゼがインドキシルホスフェートお
    よびニトロブルーテトラゾリウムをメンブレン上で有色
    物質に変換し； ｅ）クエン酸を含有する色彩安定化溶液をメンブレンに
    導通し；そして ｆ）メンブレン上の該有色物質を検出することにより第
    １の液体中の抗原の存在を判定することを含む方法。
  7. 【請求項７】 液体中のリガンドのアッセイを行うため
    の材料のキットにおいて、不活性蛋白質および第１抗リ
    ガンドの少なくとも１種で被覆されたメンブレン、該リ
    ガンドおよび第２抗リガンドの一方に結合したアルカリ
    ホスファターゼを含むトレーサー、アルカリホスファタ
    ーゼに対する基質、ならびに有機二塩基酸を含有する洗
    浄液を含むキット。
  8. 【請求項８】 酸がクエン酸および酒石酸よりなる群か
    ら選ばれる、請求項７に記載のキット。
  9. 【請求項９】 さらに、リガンドを欠如する溶液および
    既知濃度のリガンドを含有する溶液よりなる群から選ば
    れる少なくとも１種の溶液を含む、請求項７に記載のキ
    ット。
  10. 【請求項１０】 さらに、該メンブレンおよび該メンブ
    レンに隣接配置された吸収材料を内包するハウジングを
    含む、請求項７に記載のキット。
JP3002200A 1990-03-01 1991-01-11 内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法 Expired - Lifetime JPH06105254B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/486,650 US5279935A (en) 1990-03-01 1990-03-01 Method of immunossay including deactivation of endogenous alkaline phosphatase
US486650 1995-06-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04249768A JPH04249768A (ja) 1992-09-04
JPH06105254B2 true JPH06105254B2 (ja) 1994-12-21

Family

ID=23932730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3002200A Expired - Lifetime JPH06105254B2 (ja) 1990-03-01 1991-01-11 内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5279935A (ja)
EP (1) EP0444302B1 (ja)
JP (1) JPH06105254B2 (ja)
AT (1) ATE138201T1 (ja)
AU (1) AU625790B2 (ja)
CA (1) CA2030649A1 (ja)
DE (1) DE69027020T2 (ja)
DK (1) DK0444302T3 (ja)
ES (1) ES2087118T3 (ja)
FI (1) FI911013A (ja)
GR (1) GR3020247T3 (ja)
IE (1) IE904127A1 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2023850A1 (en) * 1989-09-28 1991-03-29 Randal A. Hoke Stabilizing reagent for membrane immunoassay
DE69127383T2 (de) * 1990-01-19 1998-03-05 Mina Ltd Gerät und Verfahren zur Untersuchung von Blut und zur Fingerabdruck-Identifikation
ES2123774T3 (es) * 1993-02-17 1999-01-16 Dade Behring Inc Metodo y composicion para la reduccion de la fosfatasa alcalina endogena.
US5516647A (en) * 1993-11-05 1996-05-14 Abbott Laboratories Compounds useful as alkaline phosphatase inhibitors and therapeutic agents
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US5874216A (en) 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
JP4992068B2 (ja) * 2000-01-27 2012-08-08 メディミューン，エルエルシー 超高親和性中和抗体
EP2341075A1 (en) * 2000-03-01 2011-07-06 MedImmune, LLC Antibodies binding to the f protein of a respiratory syncytial virus (rsv)
JP2004500859A (ja) 2000-05-31 2004-01-15 プロメガ　コーポレイション キナーゼ及びホスファターゼ用の評価分析法
WO2002010744A1 (fr) * 2000-08-01 2002-02-07 International Reagents Corporation Procede pour pretraiter un echantillon
US7052831B2 (en) * 2000-09-29 2006-05-30 Becton Dickinson And Company Detection of multiple analytes from a single sample using a multi-well, multi-analyte flow-through diagnostic test device
US6855493B2 (en) 2000-11-28 2005-02-15 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
US7179900B2 (en) * 2000-11-28 2007-02-20 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
JP3973876B2 (ja) * 2001-10-30 2007-09-12 株式会社三菱化学ヤトロン 新規の細菌分析方法
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
WO2006050166A2 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Inc. Methods of preventing and treating rsv infections and related conditions
EP1978363B1 (en) * 2007-04-03 2010-02-24 Sysmex Corporation Immunoassay method, reagent kit for detecting alkaline phosphatase, and reagent kit for immunoassay
JP4830966B2 (ja) * 2007-05-11 2011-12-07 富士レビオ株式会社 不活化アルカリフォスファターゼの製造方法及び酵素免疫測定用の精度向上剤
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
WO2010011860A1 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 Diabetomics, Llc Methods for detecting pre-diabetes and diabetes
WO2010132447A2 (en) 2009-05-11 2010-11-18 Diabetomics, Llc Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
WO2011119484A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
JP5716501B2 (ja) * 2011-04-04 2015-05-13 東洋紡株式会社 検体の前処理方法
EP2771349B1 (en) 2011-09-16 2020-02-26 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
EP3418397B1 (en) 2012-01-24 2020-10-07 CD Diagnostics, Inc. System for detecting infection in synovial fluid
EP3415919B1 (en) 2012-02-07 2020-07-29 Intuitive Biosciences Inc. Mycobacterium tuberculosis specific peptides for detection of infection or immunization in non-human primates
US8945827B2 (en) 2013-03-13 2015-02-03 Awareness Technology, Inc. Serological methods and diagnostic tests for syphilis antibodies
CA2983732A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Fungal detection using mannan epitope
AU2016301231A1 (en) 2015-08-04 2018-02-22 Cd Diagnostics, Inc. Methods for detecting adverse local tissue reaction (ALTR) necrosis
EP3978619A1 (en) 2015-12-09 2022-04-06 Intuitive Biosciences, Inc. Automated silver enhancement system
WO2017147186A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Ursure, Inc. System and method for detecting therapeutic agents to monitor adherence to a treatment regimen
JP6659406B2 (ja) * 2016-03-04 2020-03-04 田中貴金属工業株式会社 イムノクロマトグラフィー装置
WO2017178554A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for the rapid detection of the escherichia coli o25b-st131 clone
US11300576B2 (en) 2019-01-29 2022-04-12 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1006557B (it) * 1971-09-08 1976-10-20 Bagshawe Kenneth Dawson Cella di reazione particolarmente utile in prove di radioimmunita
US4277560A (en) * 1978-10-24 1981-07-07 Technicon Instruments Corporation Enzyme immunoassays using immobilized reagents in a flowing stream
US4246339A (en) * 1978-11-01 1981-01-20 Millipore Corporation Test device
US4632901A (en) * 1984-05-11 1986-12-30 Hybritech Incorporated Method and apparatus for immunoassays
US4782016A (en) * 1985-01-18 1988-11-01 Eastman Kodak Company Analytical element and method for determination of theophylline by enzyme inhibition
US4656128A (en) * 1985-01-22 1987-04-07 Research Corporation Modified alkaline phosphatase
US4738932A (en) * 1985-12-03 1988-04-19 Advanced Polymer Systems, Inc. Reaginic test for syphilis
JPS62170850A (ja) * 1986-01-23 1987-07-27 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫化学的測定法
US4812293A (en) * 1986-06-30 1989-03-14 Becton, Dickinson And Company Vacuum actuated assay device and method of using same
CA1289876C (en) * 1986-07-15 1991-10-01 Richard R. Anderson Solid phase system incorporating tetrazolium salts for use in ligand-receptor assays
US4956302A (en) * 1987-09-11 1990-09-11 Abbott Laboratories Lateral flow chromatographic binding assay device
IL85018A0 (en) * 1988-01-03 1988-06-30 Orgenics Ltd Stable chromogenic substrate mixture of indoxyl phosphate and tetrazolium salt,method of making and using same in biological and diagnostic assays

Also Published As

Publication number Publication date
ATE138201T1 (de) 1996-06-15
AU625790B2 (en) 1992-07-16
JPH04249768A (ja) 1992-09-04
GR3020247T3 (en) 1996-09-30
FI911013A0 (fi) 1991-02-28
DK0444302T3 (da) 1996-09-02
FI911013A (fi) 1991-09-02
EP0444302A1 (en) 1991-09-04
EP0444302B1 (en) 1996-05-15
DE69027020T2 (de) 1996-10-31
AU6701790A (en) 1991-09-05
US5279935A (en) 1994-01-18
DE69027020D1 (de) 1996-06-20
ES2087118T3 (es) 1996-07-16
CA2030649A1 (en) 1991-09-02
IE904127A1 (en) 1991-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH06105254B2 (ja) 内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法
US4960692A (en) Assay employing binding pair members on particles and on a filter or membrane
EP0321261B1 (en) Use of immobilized biotinylated receptor in test device, kit and method for determining a ligand
US5139934A (en) Substrate composition and method for solid phase urease immunoassay
US4786589A (en) Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants
DK175008B1 (da) Fremgangsmåde og udstyr til bestemmelse af et viralt antigen i en væske
EP0328413B1 (en) Sodium decyl sulfate wash solution, test kit and method for the determination of an immunological ligand
KR920007686B1 (ko) 추출 조성물, 테스트 키트 및 이것을 이용해 단순포진 비루스의 항원을 추출하거나 정량하는 방법
EP0328388A2 (en) Wash solution, test kit and method for the determination of an immunological ligand
JPH0820446B2 (ja) アルカリホスファターゼを用いた免疫検定のためのキットおよび方法
EP0687910B1 (en) Test kit and method for competitive specific binding assay
EP0420170A2 (en) Stabilizing reagent for membrane immunoassay
JP2003107090A (ja) 免疫クロマトグラフ用標識複合体組成物
JP2001272405A (ja) 検査キット
CA2028146A1 (en) Composition containing labeled streptococcal antibody, test kit and assay using same
JP2002243743A (ja) 被検物質の検出方法
KR920007205B1 (ko) 단순 포진 비루스 항원 측정용 세정 조성물, 테스트 키트 및 그 사용법
CA2005511A1 (en) Enzyme-labeled receptor composition, diagnostic kit and use in method to determine a ligand
IE911600A1 (en) Immunoreagent composition, test kit and rapid assay for¹human chorionic gonadotropin
JPH0763396B2 (ja) イムノブロット分析用標識ペルオキシダーゼの検出試薬
JPH0755807A (ja) 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液
JP2000083697A (ja) 色素源基質を含有する組成物