JPH04249768A - 内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法 - Google Patents

内在アルカリホスファターゼの失活を含むイムノアッセイ法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は被分析体のイムノアッセイに関するものであり
、より詳細にはメンブレンイムノアッセイ法およびそれ
に有用な個々の試薬に関するものである。
【０００２】発明の背景 流体試料中に低濃度で存在する物質−−一般に被分析体
と呼ぶ−−の濃度を測定するための迅速な、かつ感度の
高いアッセイシステムが開発された。イムノアッセイ法
は抗原またはハプテンが特異的抗体に結合することに基
づくものであり、高度の特異性および感度を与えるので
、特に有用である。これらのアッセイ法は上記試薬のう
ち１種を標識された形で使用し、この標識試薬はトレー
サーと呼ばれる。
【０００３】イムノアッセイにおいては標識としてしば
しば酵素が用いられる。通常の酵素イムノアッセイ法（
ＥＩＡ）においては、酵素は特異的に結合する抗原−抗
体対の１成分に共有結合し、生成した酵素結合体が基質
と反応してシグナルを発し、これを検出および測定する
。シグナルは肉眼もしくは分光測光法により検出される
色の変化であってもよく、または基質が蛍光により検出
される物質に変換されるものであってもよい。
【０００４】ＥＩＡの簡便な形式は、アッセイ試薬のう
ち１種が固体状支持体に固定化された固相イムノアッセ
イ法である。固体状支持体はディップスティック、試験
管もしくはキュベットの内壁、またはマイクロタイター
プレートのウェルであってもよい。特に有用な固体状支
持体は微孔質メンブレンである。
【０００５】メンブレンイムノアッセイ法はしばしばフ
ロースルーアッセイ法と呼ばれる。流れが毛管作用によ
り生じるフロースルーＥＩＡの例は、米国特許第３，８
８８，６２９号（バグショーら）、米国特許第４，２４
６，３３９号（コールら）および米国特許第４，６３２
，９０１号（バルキルスら）各明細書に記載されるアッ
セイ法である。米国特許第４，２７７，５６０号（グレ
イ）および米国特許第４，８１２，２９３号（マクロー
リンら）はそれぞれ圧力および真空を用いるフロースル
ーアッセイ法の例である。
【０００６】メンブレンＥＩＡの場合、いかなる数量の
液体をもメンブレンに貫流させてアッセイ成分の結合、
分離および洗出を行うことができる。大部分のメンブレ
ンＥＩＡ法の最終工程は発色試薬、たとえば色原体をメ
ンブレンに導通するものである。色原体はメンブレンに
捕獲された酵素と反応して色の変化を生じ、これが被分
析体の存在を示すものとして検出され、または被分析体
の濃度を示すものとして測定される。
【０００７】イムノアッセイに慣用される酵素はアルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）である。この酵素は実際上す
べての細胞中に存在し、ホスフェート基の除去をその主
要な機能としてもつ。これは広く研究され、低いｐＨで
失活されることは周知である（シュレージンガー（Ｓｃ
ｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）ら，Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４０
，４２８４（１９６５）；マッコーム（ＭｃＣｏｍｂ）
ら，Ａｌｋａｌｉｎｅ　　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，プ
レナム出版社，ニューヨーク州ニューヨーク，１９７９
年，４１３頁）。
【０００８】ＡＰを標識として用いる比色アッセイ法に
おいてしばしば遭遇する問題は、酵素の遍在性により起
こる。臨床試料中の抗原に関する大部分のアッセイ法は
抗原を分離せずに行われる。試料中にＡＰが存在すると
（以下、内在ＡＰと呼ぶ）、これがメンブレンもしくは
アッセイ成分の１つに非特異的に結合し、またはアッセ
イプロトコールにおける洗浄工程によって完全には除去
されない可能性がある。この場合、臨床的に陰性の試料
から陽性のシグナルが生じる。本発明はこの問題を克服
することを目的とする。
【０００９】発明の要約 液状臨床試料中に存在する疑いのあるリガンドを測定す
るためのフロースルーアッセイ法は、不活性蛋白質で被
覆されたメンブレンに試料を導通し、これによりリガン
ドをメンブレンに付着させることを含む。本方法の他の
形態においては、メンブレンはさらにリガンドに特異的
に結合する抗リガンドで被覆される。本明細書において
不活性蛋白質という語は、アッセイの他のいずれの成分
に対しても免疫学的に非反応性であり、実質的にアッセ
イ媒質中の他の蛋白質に非特異的に結合しない蛋白質を
意味し、ただし不活性蛋白質は本発明のアッセイ法の一
部ではない他の物質に対しては免疫学的に十分に反応性
であってもよいと解される。
【００１０】試料をメンブレンに導通して結合させたの
ち、有機酸をメンブレンに導通して試料中の内在ＡＰを
失活させる。次いでＡＰを含有するトレーサーをメンブ
レン上の抗原と共にインキュベートしてトレーサーを抗
原に結合させる。メンブレンに結合したＡＰをインドキ
シル誘導体からなる基質と接触させると、これが有色の
不溶性物質に変換され、メンブレン上に可視スポットと
して析出する。好ましい基質はさらにテトラゾリウム塩
を含む。所望によりメンブレンに色止め（ｃｏｌｏｒ　
　ｓｔｏｐｐｉｎｇ）および色彩安定化溶液を導通する
ことにより、スポットの色と背景の色のコントラストを
後に観察するために安定化することができる。
【００１１】好ましいリガンドはウイルス性抗原であり
、これはトレーサーのＡＰ成分が特異的抗体に結合した
アッセイ形式により検出される。好ましい失活用の酸は
ヒドロキシポリカルボン酸であり、その極めて好ましい
ものはクエン酸である。
【００１２】本発明には、本発明のアッセイ法を実施す
るのに有用な材料のキットが包含される。
【００１３】従って本発明は、標識としてＡＰを使用し
、かつ試料中の内在ＡＰを失活させるための有機酸洗浄
を採用する、臨床試料中の抗原に関するフロースルーア
ッセイ法を提供する。低いｐＨにおいてＡＰが失活する
のは周知の現象であるが、本発明の有機酸洗浄は抗原自
体を変性させることなく内在ＡＰを選択的に失活させる
。これに対し鉱酸による内在ＡＰの失活は抗原とトレー
サーの結合を妨げ、アッセイを妨害するであろう。
【００１４】詳細な説明 本発明は種々の形態により実施されるが、ここに本発明
の好ましい形態を詳述する。ただしこの記述は本発明の
原理の例示であり、説明および記載されるこれらの形態
に本発明を限定するためのものではない。本発明の範囲
は特許請求の範囲およびそれらの均等物により判定され
るであろう。
【００１５】本発明の１観点は、標識としてＡＰを用い
ることによる液体中のリガンドの比色フロースルーイム
ノアッセイ法である。本発明によればメンブレンを有機
酸、好ましくはヒドロキシ多塩基酸で洗浄することによ
り、臨床試料中にしばしば存在する内在ＡＰを失活させ
ることができ、従ってメンブレン上に生じる色はリガン
ドのみによるものであることが見出された。
【００１６】本発明のアッセイ法は当技術分野で知られ
ているフロースルーアッセイに適したいずれか適宜なア
ッセイ装置中で実施することができる。好ましい装置に
おいてはアッセイ液の流れはメンブレンの下側に配置さ
れた吸着材料パッドにより誘発される毛管作用により促
進される。この種の装置は多数報告されており、数種が
市販されている。装置自体は本発明の特色を示すもので
はない。
【００１７】リガンドはいかなる供給源からのものであ
ってもよく、抗原、抗体またはハプテンのいずれであっ
てもよい。たとえばリガンドは体液中に存在する抗原で
あってもよく、またはこれは体液から単分離されたのち
異なる液体、たとえば緩衝液に装入されてもよい。他の
場合、リガンドは体液以外の供給源、たとえばクラミジ
ア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）などの微生物の培養物または
その細胞抽出物からのものであってもよい。好ましいリ
ガンドは抗原であり、極めて好ましくは体液中に存在す
るウイルス性抗原、たとえばアデノウイルス、パライン
フルエンザ３ウイルスならびに極めて好ましくは単純ヘ
ルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）お
よびインフルエンザＡ（ＦｌｕＡ）である。本発明を以
下一般的にウイルス性抗原について記述する。
【００１８】ここでアッセイ成分について詳述すると、
多孔質メンブレンはアッセイの他の成分または工程によ
って全く妨害されないいかなる材料のものであってもよ
い。適切なメンブレンはたとえばグラスファイバー、ポ
リビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ニトロ
セルロースおよびナイロンである。この種のメンブレン
は当技術分野で周知であり、パル、ニューヨーク州グレ
ンコーブ；ミリポア、マサチュセッツ州ベッドフォード
；およびシュライヘル・アンド・シュル、ニューハンプ
シャー州キーンなどの業者から市販されている。
【００１９】メンブレンをリガンドに特異的な抗リガン
ドで被覆することができる。たとえばリガンドが好まし
いウイルス性抗原である場合、抗リガンドは該抗原に特
異的に結合してこれによりメンブレン上に抗原を捕獲す
る抗体である。メンブレンは捕獲用抗体により占有され
ていないメンブレン上の結合部位を充填するために不活
性蛋白質でさらに被覆されていてもよい。適切な不活性
蛋白質の限定ではない代表例はカゼインおよびアルブミ
ンであるが、他は当業者に自明であろう。不活性蛋白質
および抗体によるメンブレンの被覆は共にいずれか適切
な方法により行うことができ、好ましくはメンブレンを
蛋白質の溶液と共にインキユベートし、これにより蛋白
質をメンブレンの高分子マトリックス表面内へ物理的に
吸収させることにより行う。
【００２０】本発明の好ましい形態においては、メンブ
レンを不活性蛋白質で被覆し、この表面に抗原を直接吸
収させ、捕獲用抗体なしにアッセイを行う。捕獲用抗体
なしのフロースルーアッセイ法は出願中の米国特許出願
第２７２，３８０号明細書（１９８８年１１月１７日出
願、同一出願人）に示されている。
【００２１】捕獲用抗体および／または不活性蛋白質の
被膜を備えたメンブレンを、ウイルス性抗原が含有され
る疑いのある試料に暴露する。好ましくは被覆メンブレ
ンを試料と共に一時的フロースルー形式で約１−１５分
間、好ましくは約５分間、約０−５０℃、好ましくはほ
ぼ周囲温度においてインキユベートする。この処理によ
り試料中の抗原は、試料中のその濃度に比例して被覆メ
ンブレンに捕獲される。さらに試料が大量の余分な蛋白
質を含む場合、たとえば試料が体液である場合ですら、
ウイルス性抗原は優先的に吸収されることが認められた
。
【００２２】インキユベーションののち、内在ＡＰを失
活させる試薬を含有する洗浄液をメンブレンに導通する
。アッセイの他の観点に影響を及ぼさずに内在ＡＰを失
活させる有機酸はいずれも使用しうる。一塩基酸、たと
えば乳酸または酢酸を使用しうる。好ましい酸は多塩基
酸、たとえばコハク酸およびグルタル酸である。極めて
好ましい酸はヒドロキシ多塩基酸、たとえばリンゴ酸お
よび酒石酸、特にクエン酸である。失活用の酸は好まし
くは水、緩衝液または食塩液中の溶液としてメンブレン
に導通される。約０．０５−１．０Ｍ、好ましくは約０
．１−０．２Ｍ、ｐＨ約１−３の水溶液を用いることが
好ましい。大部分の臨床試料については、どの程度の内
在ＡＰが存在しても失活させるには約３００μＬの溶液
で十分である。高濃度の内在ＡＰを含有する疑いのある
試料については、より多量の酸溶液を使用しうる。
【００２３】トレーサーは下記のように抗原（競合アッ
セイ）または検出抗体（サンドイツチアッセイ）のいず
れかに結合したＡＰからなる。種々の業者から多種のＡ
Ｐ製剤が市販されており、それらが抗原または抗体に結
合しうる限り標識として有用である。抗原または抗体へ
のＡＰの結合は周知であり、当業者に十分に理解されて
いる。
【００２４】当技術分野で知られているＡＰに対する基
質はいずれも使用しうる。好ましい基質はメンブレン上
に不溶性析出物を生じるものである。極めて好ましい基
質はインドキシル誘導体、たとえばインドキシルホスフ
ェートである。当技術分野で知られている他のインドキ
シル系基質、たとえば５−ブロモ−４−クロロ−インド
キシル誘導体も使用しうる。標準法によって適切なイン
ドキシル誘導体を製造するのに有用なインドキシル類の
広範なリストがホルト（Ｈｏｌｔ）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｒｏｙａｌ　　Ｓｏｃ
ｉｅｔｙ　　ｏｆ　　Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ，１９５８，１
４８，４８１−４９４に挙げられている。基質は水、食
塩液または適切な緩衝液に溶解されてもよい。
【００２５】インドキシル系基質の開裂により生じる色
が、基質組成物にテトラゾリウム塩を含有させることに
より増強されることが好ましい。適切なテトラゾリウム
塩はたとえばｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレ
ット（ＩＮＴ）およびニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）である。視覚検査に十分な強度の色がテトラゾリ
ウム塩の不在下で生じたとしても、この試薬を含有させ
ることによってより濃い色のスポットが得られ、これは
視覚検査をより容易にし、従ってアッセイの感度を高め
る。
【００２６】本発明のメンブレンアッセイ法は競合また
はサンドイッチ法により行うことができ、その際メンブ
レンを貫流する液体の流れはメンブレンの下側に配置さ
れた吸収材料により誘発される毛管作用により生じても
よい。本発明の競合アッセイ法においては、トレーサー
はＡＰが結合した抗原であり、抗原とトレーサーが被覆
メンブレン上の有効結合部位に対して競合する。本発明
の好ましいサンドイッチアッセイ形式においては、トレ
ーサーはＡＰに結合した抗原に対して特異的な検出抗体
である。好ましい検出抗体は、当技術分野で周知の常法
により形成されたモノクローナル抗体である。次いで基
質組成物をメンブレンに導通する。メンブレン上のＡＰ
が基質を色により検出しうる物質に変換する。発色の程
度は抗原濃度に比例し、これは予め定められた量の抗原
を含有する液体試料をアッセイして色の強度を比較する
ことにより判定される。
【００２７】所望により、色彩安定剤の溶液をメンブレ
ンに導通することにより発色反応を停止し、メンブレン
上の色を実質的に安定化することができる。適切な安定
剤は鉱酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸およびピロリン
酸、または所望により有機溶剤を含有する有機酸水溶液
である。適切な有機酸はたとえば酢酸、酒石酸、シュウ
酸、コハク酸、安息香酸、および好ましくはクエン酸で
ある。適切な有機溶剤はメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、アセトンおよびテトラヒドロフランであ
る。安定化用酸の濃度は、所望により約３０−７０重量
％の有機溶剤を含有する水または緩衝液中において約０
．１−０．５Ｍである。色彩安定剤に関するこれ以上の
詳細は同一出願人による出願中の米国特許第４１４，１
６１号明細書（１９８９年、９月２８日出願）に示され
ている。
【００２８】本発明の他の観点は、本発明方法によりリ
ガンドのアッセイを行うための試薬キットまたは材料の
パッケージである。このキットは不活性蛋白質および所
望により捕獲用抗リガンドで被覆されたメンブレン、リ
ガンドまたは検出用抗リガンドの一方に結合したＡＰか
らなるトレーサー、ＡＰに対する基質、ならびに内在Ａ
Ｐを失活させるための有機酸、好ましくは二塩基酸の溶
液を含む。キットは酸の溶液、好ましくは有機溶剤を含
有する水溶液を含む色彩安定剤を含んでいてもよい。キ
ットはリガンドに対する標準液、たとえば既知濃度のリ
ガンド試料１種もしくは２種以上を含み、または他の試
薬、基質、もしくは溶液、たとえば食塩液、および用具
、たとえばアッセイを行うのに有用なバイアルもしくは
スポイトを含んでもよい。メンブレンはアッセイ液が毛
管作用によりメンブレンを貫流するのを促進するために
メンブレンの下側に配置された材料、たとえば吸い取り
紙を含むハウジング、好ましくはプラスチック内に収容
されていてもよい。
【００２９】以下の例は本発明をさらに説明するために
提示されたものであり、本発明を限定するものと考える
べきではない。
【００３０】実施例　　Ｉ インフルエンザＡウイルスのアッセイ 下記の構造のメンブレンフィルター積層物を組み立てた
：上層−３ミクロンのバイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ、
登録商標）メンブレン（パル、ニューヨーク州グレンコ
ーブ、＃ＢＩＡ００３０ＨＣ５）。０．３％カゼインを
含有するリン酸緩衝液に周囲温度で３０分間浸漬するこ
とにより下塗り。
【００３１】次層−不織レーヨンシート（シュライヘル
・アンド・シュル、ニューハンプシャー州キーン；＃５
−Ｓ）。
【００３２】下層−セルロース製吸収パッド（２）（フ
ィルトレーション・サイエンシズ、ペンシルベニア州マ
ウント・ホリー・スプリングズ；＃ＥＤ３２０−２００
）。
【００３３】メンブレン層は、上層の上方に形成された
受容ウェルを含むプラスチック製ホルダーに挿入された
。このウェル内に、受容ウェルより狭い開口を備え、メ
ンブレン上層に接して位置する制流インサートがはめ込
まれた。
【００３４】Ａ型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ−Ａ
）（ＷＳＮ株）に感染したメイディン−ダービー犬の腎
臓（ＭＤＣＫ）細胞を下記緩衝液中に希釈したものを用
いて、抗原原液を調製した：２５０ｍＭのトリスＨＣｌ
、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１
ｍＭのエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸
（ＥＧＴＡ）、４％（ｖ／ｖ）のポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート（ツウィーン２０）、１％のＮ
−アセチル−Ｌ−システイン、０．２％のナトリウムア
ジド（ＮａＮ３）、ｐＨ８．５。同様にして未感染ＭＤ
ＣＫ細胞から対照抗原を調製した。
【００３５】２５０μＬアリコートのこの抗原（または
対照）を上記装置に装入し、制流インサートを貫流して
メンブレン上層上に排液させ、次いで３００μＬの０．
１５Ｍクエン酸水溶液を導通した。次いで制流インサー
トを取り除き、この装置に１ｍｇ／ｍＬの家兎ＩｇＧを
追加含有するトリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）１５０μＬを
添加した。
【００３６】アルカリホスファターゼである子牛腸ＡＰ
（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディ
アナポリス）に結合した２７μｇ／ｍＬの抗−Ｆｌｕ−
Ａ抗体を含有する溶液を下記緩衝液中に調製した：１０
０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２００
ｍＭのリン酸ナトリウム、１％のカゼイン、１ｍＭの塩
化マグネシウム、０．１ｍＭの塩化亜鉛、１ｍＭの２−
メルカプトエタノールおよび０．２％のＮａＮ３、ｐＨ
７．２。この混合物１５０μＬアリコートを上記装置に
添加し、メンブレン積層物に吸収させた。短時間（２分
）のインキュベーションののち、装置を３００μＬのＴ
ＢＳ（ＩｇＧ不含）で洗浄した。
【００３７】０．３３ｍｇ／ｍＬのニトロブルーテトラ
ゾリウム、１％のメタノールおよび０．２％のＮａＮ３
を含有する溶液１５０μＬを装置に添加した。次いで、
２ｍｇ／ｍＬのインドキシルホスフェート、５０ｍＭの
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）
アセテート中の１６ｍＭのレバミソール（ｌｅｖａｍｉ
ｓｏｌｅ）、０．２％のＮａＮ３、１ｍＭの塩化マグネ
シウムを含有する溶液（ｐＨ９．８）１５０μＬを添加
した。周囲温度で５分間のインキュベーションののち、
１５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する安定剤溶液
（ｐＨ３．０）１５０μＬを添加することにより発色反
応を停止した。生じたシグナルスポットの相対的色濃度
を反射濃度計（グレタグ、ワシントン州シアトル、モデ
ル１８３）による反射率観測単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ
　　ｕｎｉｔ）で測定した。一連の抗原希釈液につき実
施した結果を図面に示し、陰性対照（無酸）および１Ｎ
　　ＨＣｌ、４．５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、５％酢酸を用いて
得た結果と比較する。酢酸およびクエン酸洗浄を採用し
た場合（および無酸）は抗原濃度の増大と共に反射率が
増大したことが容易に認められ、これはアッセイが成功
したことを示す。しかしＨＣｌおよびＨ２ＳＯ４は抗原
濃度の増大と共に反射率が増大しなかったという点で、
アッセイが不成功であった。いずれかの理論により拘束
されることは望まないが、鉱酸はメンブレン上で抗原を
変性させ、結合抗体への結合を阻害したと考えられる。
【００３８】実施例　　ＩＩ 失活用酸の比較 Ｉ．　　実施例Ｉに記載したメンブレンフィルター積層
物、プラスチックホルダーおよびアッセイプロトコール
を採用して、下記に挙げた失活用酸を感染および非感染
ＭＤＣＫ細胞において内在ＡＰの失活における有効性に
つき比較した。
【００３９】Ａ．．．０．１５Ｍ　　クエン酸Ｂ．．．
０．１５Ｍ　　グルタル酸 Ｃ．．．０．１５Ｍ　　酒石酸 Ｄ．．．０．１５Ｍ　　コハク酸 Ｅ．．．０．１５Ｍ　　リンゴ酸 Ｆ．．．０．１５Ｍ　　乳酸 Ｇ．．．無酸−陰性対照 この実験の結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】ａ）　　ＷＳＮ感染ＭＤＣＫ細胞ｂ）　　
非感染ＭＤＣＫ細胞 ｃ）　　（＋）および（−）は視覚的に検出される色の
有無を示す。
【００４２】上記の表から分かるように、有機酸の存在
は感染細胞のアッセイを妨害せず、非感染細胞（無抗原
）について実施した試験は各酸につき陰性のシグナルを
与え、これらの細胞における内在ＡＰが失活したことを
示す。
【００４３】ＩＩ．　　実施例Ｉを反復し、ただしＭＤ
ＣＫ細胞を用いず、希釈用緩衝液に４．８単位／試験の
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＰをスパイクした。従ってこ
の実験の場合は抗原が存在しないのでメンブレン上に標
識ＡＰが捕獲されず、内在ＡＰである大腸菌ＡＰスパイ
クが存在する唯一のＡＰであった。実験の結果は下記の
とおりである。
【００４４】
【表２】
【００４５】 　　　　　　　　酸　　　　　　　　　　　　　　　　
　　反射率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
視覚検査 　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　．０３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
（−）　　　　　　　　Ｂ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　．０６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　（＋）　　　　　　　　Ｃ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　．０４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（−）　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　．０６　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　（＋）　　　　　　　　Ｅ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　．０６　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　（＋）　　　　　　　　Ｆ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　．０６　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　（＋）　　　　　　　
　Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　．０９　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　（＋）この実験
から分かるように、失活用酸（Ａ−Ｆ）はすべてＡＰス
パイクのため無酸の対照（Ｇ）と比較してシグナルが低
下し、クエン酸（Ａ）および酒石酸（Ｃ）が極めて有効
であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアッセイ法によるインフルエンザウイ
ルスのアッセイ結果を示す図である。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　液体試料中のリガンドの測定法におい
    て、 ａ）リガンドを含有する疑いのある液体試料を不活性蛋
    白質で被覆された多孔質メンブレンに導通し、これによ
    り該リガンドを被覆メンブレンに固着させ；ｂ）有機多
    塩基酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導通し； ｃ）抗リガンドに結合したアルカリホスファターゼから
    なるトレーサーを含有する溶液を該メンブレンに導通し
    、これにより該トレーサーをリガンドに結合させ；ｄ）
    テトラゾリウム塩およびインドキシル誘導体からなる、
    アルカリホスファターゼに対する基質溶液を該メンブレ
    ンに導通し、該基質がメンブレン上のアルカリホスファ
    ターゼにより有色物質に変換され；そしてｅ）メンブレ
    ン上の該有色物質を検出することにより第１の液体中の
    リガンドの存在を判定することを含む方法。
  2. 【請求項２】　　リガンドがウイルス性抗原である、請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】　　多塩基酸がクエン酸、コハク酸、グル
    タル酸、リンゴ酸および酒石酸よりなる群から選ばれる
    、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】　　さらに、メンブレンに色彩安定化溶液
    を導通することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】　　液体試料中のリガンドの測定法におい
    て、 ａ）リガンドを含有する疑いのある液体試料を、抗リガ
    ンドおよび不活性蛋白質よりなる群から選ばれる試薬で
    被覆された多孔質メンブレンに導通し、これにより該リ
    ガンドを被覆メンブレンに固着させ； ｂ）有機酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導通し；
    ｃ）アルカリホスファターゼからなるトレーサーを含有
    する溶液を該メンブレンに導通し、これにより該トレー
    サーを抗リガンドおよびリガンドの一方に結合させて、
    メンブレン上にアルカリホスファターゼを含有する結合
    画分を形成させ； ｄ）インドキシル誘導体からなる、アルカリホスファタ
    ーゼに対する基質溶液を該メンブレンに導通して有色物
    質を形成させ；そして ｅ）メンブレン上の該有色物質を検出することにより第
    １の液体中のリガンドの存在を判定することを含む方法
    。
  6. 【請求項６】　　液体試料中のウイルス性抗原の測定法
    において、 ａ）ウイルス性抗原を含有する疑いのある液体試料を不
    活性蛋白質で被覆されたメンブレンに導通し、これによ
    り該ウイルス性抗原を被覆メンブレンに固着させ；ｂ）
    クエン酸を含有する洗浄液を該メンブレンに導通し； ｃ）アルカリホスファターゼに結合した抗体を含有する
    溶液を該メンブレンに導通し、これにより該抗体を該抗
    原に結合させて、メンブレン上にアルカリホスファター
    ゼを含有する結合画分を形成させ； ｄ）インドキシルホスフェートおよびニトロブルーテト
    ラゾリウムからなる基質溶液を該メンブレンに導通し、
    アルカリホスファターゼがインドキシルホスフェートお
    よびニトロブルーテトラゾリウムをメンブレン上で有色
    物質に変換し； ｅ）クエン酸を含有する色彩安定化溶液をメンブレンに
    導通し；そして ｆ）メンブレン上の該有色物質を検出することにより第
    １の液体中の抗原の存在を判定することを含む方法。
  7. 【請求項７】　　液体中のリガンドのアッセイを行うた
    めの材料のキットにおいて、不活性蛋白質および第１抗
    リガンドの少なくとも１種で被覆されたメンブレン、該
    リガンドおよび第２抗リガンドの一方に結合したアルカ
    リホスファターゼを含むトレーサー、アルカリホスファ
    ターゼに対する基質、ならびに有機二塩基酸を含有する
    洗浄液を含むキット。
  8. 【請求項８】　　酸がクエン酸および酒石酸よりなる群
    から選ばれる、請求項７に記載のキット。
  9. 【請求項９】　　さらに、リガンドを欠如する溶液およ
    び既知濃度のリガンドを含有する溶液よりなる群から選
    ばれる少なくとも１種の溶液を含む、請求項７に記載の
    キット。
  10. 【請求項１０】　　さらに、該メンブレンおよび該メン
    ブレンに隣接配置された吸収材料を内包するハウジング
    を含む、請求項７に記載のキット。
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