JPH0820446B2 - アルカリホスファターゼを用いた免疫検定のためのキットおよび方法 - Google Patents
アルカリホスファターゼを用いた免疫検定のためのキットおよび方法Info
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- JPH0820446B2 JPH0820446B2 JP1299458A JP29945889A JPH0820446B2 JP H0820446 B2 JPH0820446 B2 JP H0820446B2 JP 1299458 A JP1299458 A JP 1299458A JP 29945889 A JP29945889 A JP 29945889A JP H0820446 B2 JPH0820446 B2 JP H0820446B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は分析物（analyte）の免疫検定とそれに用い
る材料に関し、特に詳しくは新規なアルカリホスファタ
ーゼ基質組成物を用いる免疫検定方法とその材料に関す
る。
る材料に関し、特に詳しくは新規なアルカリホスファタ
ーゼ基質組成物を用いる免疫検定方法とその材料に関す
る。
（従来の技術） 流体中の基質濃度を測定するために迅速かつ高感度の
検定系が開発されている。免疫検定は抗原またはハプテ
ンと特異的抗体との結合に依存し、高レベルの特異性と
感受性とを示すので特に有用である。これらの検定法は
一般に上記試薬の１種類を標識した形で用い、この標識
試薬はしばしばトレーサーと呼ばれる。免疫検定法は溶
液中または固体支持体上で実施され、遊離（非結合）ト
レーサーから結合トレーサーの分離を必要とする不均一
系であるかまたは分離工程を必要としない均一系であ
る。
検定系が開発されている。免疫検定は抗原またはハプテ
ンと特異的抗体との結合に依存し、高レベルの特異性と
感受性とを示すので特に有用である。これらの検定法は
一般に上記試薬の１種類を標識した形で用い、この標識
試薬はしばしばトレーサーと呼ばれる。免疫検定法は溶
液中または固体支持体上で実施され、遊離（非結合）ト
レーサーから結合トレーサーの分離を必要とする不均一
系であるかまたは分離工程を必要としない均一系であ
る。
酵素は免疫検定法で標識としてしばしば用いられてい
る。通常の酵素免疫検定法（EIA）では、酵素は特異的
に結合する抗原−抗体対の１成分と共有結合し、生成し
た酵素結合体は基質と反応して、シグナルを形成し、こ
のシグナルが検出され、測定される。シグナルは裸眼ま
たは分光測光法によって検出される色の変化であるか、
または螢光によって検出される生成物への基質の変換で
ある。
る。通常の酵素免疫検定法（EIA）では、酵素は特異的
に結合する抗原−抗体対の１成分と共有結合し、生成し
た酵素結合体は基質と反応して、シグナルを形成し、こ
のシグナルが検出され、測定される。シグナルは裸眼ま
たは分光測光法によって検出される色の変化であるか、
または螢光によって検出される生成物への基質の変換で
ある。
免疫検定法において用いられる酵素は安定であり、高
反応性であり、非常に純粋な形で入手可能でなければな
らず、安定な結合体（トレーサー）を生じ、使用するた
めに安価で、安全かつ便利でなければならない。これら
の基準を満たし、免疫検定にしばしば用いられる酵素は
アルカリホスファターゼ（AP）である。
反応性であり、非常に純粋な形で入手可能でなければな
らず、安定な結合体（トレーサー）を生じ、使用するた
めに安価で、安全かつ便利でなければならない。これら
の基準を満たし、免疫検定にしばしば用いられる酵素は
アルカリホスファターゼ（AP）である。
APは実質的に全ての動物種に生じるが、哺乳動物では
２種類の形式で生ずる。１つの形式は多くの組織内に広
く分布しているが、他方の形式は腸に限定される。
２種類の形式で生ずる。１つの形式は多くの組織内に広
く分布しているが、他方の形式は腸に限定される。
APは一般に無色のホスホリル化基質からのホスフェー
ト基の開裂に触媒作用を及ぼして、有色生成物を生ず
る。酵素はアルカリ性PHにおいて活性であるので、APを
用いる検定系は一般に、検定媒質（assay medium）のPH
を７〜９の範囲内に維持する緩衝剤を含む。
ト基の開裂に触媒作用を及ぼして、有色生成物を生ず
る。酵素はアルカリ性PHにおいて活性であるので、APを
用いる検定系は一般に、検定媒質（assay medium）のPH
を７〜９の範囲内に維持する緩衝剤を含む。
レバミゾール（Levamisole）（−）2,3,5,6,−テトラ
ヒドロ−６−フェニルイミダゾ〔1,2−ｂ〕チアゾール
は幾つかの種類の哺乳動物組織からのAPの強力な阻害剤
であることが周知である。しかしこれは腸からのAPに対
しては約1/100の効力を有するにすぎない〔ヴァンベレ
（Van Belle）のバイオチムエトバイオフィズアクタ（B
iochim.et Biophys.Acta.）289,158（1972）〕。
ヒドロ−６−フェニルイミダゾ〔1,2−ｂ〕チアゾール
は幾つかの種類の哺乳動物組織からのAPの強力な阻害剤
であることが周知である。しかしこれは腸からのAPに対
しては約1/100の効力を有するにすぎない〔ヴァンベレ
（Van Belle）のバイオチムエトバイオフィズアクタ（B
iochim.et Biophys.Acta.）289,158（1972）〕。
免疫検定法のこの選択性から利点が生ずる。レバミゾ
ールは検出に用いるとウシ腸APが発する特定の免疫シグ
ナルを妨げないが、臨床サンプル中に存在する非腸APか
ら生ずる非特異的なシグナルを減ずる。モリス（Morri
s）等はジャーナルオブイムノロジカルメソッドス（Jou
rnal of Immunological Methods）68,11（1984）の中
で、基質と非腸由来のAPを阻害するために加えたレバミ
ゾールとの存在下で、ウシ腸APとヤギ抗マウスIgbとの
結合体によって、全細胞の表面上の抗原とモノクロナー
ル抗体の結合を検出することを開示している。
ールは検出に用いるとウシ腸APが発する特定の免疫シグ
ナルを妨げないが、臨床サンプル中に存在する非腸APか
ら生ずる非特異的なシグナルを減ずる。モリス（Morri
s）等はジャーナルオブイムノロジカルメソッドス（Jou
rnal of Immunological Methods）68,11（1984）の中
で、基質と非腸由来のAPを阻害するために加えたレバミ
ゾールとの存在下で、ウシ腸APとヤギ抗マウスIgbとの
結合体によって、全細胞の表面上の抗原とモノクロナー
ル抗体の結合を検出することを開示している。
ポンダー（Ponder）等はジャーナルオブヒストケミス
トリーアンドサイトケミストリー（Journal of Histoch
emistry and Cytochemistry）29,981（1981）におい
て、組織スライスを抗マウスH2抗体と共にインキュペー
トし、腸AP標識結合体で処理した後、その酵素の基質と
非腸APを阻害するためのレバミゾールとによって処理す
ることによる組織スライス中のマウスH2抗原の検出方法
を開示している。ポンダー等の方法では、基質を組織ス
ライスと混合する前に過したAP基質溶液に1mM濃度の
レバミゾールを加える。
トリーアンドサイトケミストリー（Journal of Histoch
emistry and Cytochemistry）29,981（1981）におい
て、組織スライスを抗マウスH2抗体と共にインキュペー
トし、腸AP標識結合体で処理した後、その酵素の基質と
非腸APを阻害するためのレバミゾールとによって処理す
ることによる組織スライス中のマウスH2抗原の検出方法
を開示している。ポンダー等の方法では、基質を組織ス
ライスと混合する前に過したAP基質溶液に1mM濃度の
レバミゾールを加える。
上記特許に開示されている、EIAに有用なレバミゾー
ルはアルカリ性PHでは不安定なことが知られている。デ
ィキンソン（Dickinson）等はアナリストAnalyst96,248
（1971）に於てレバミゾールが高温では迅速に分解し、
PH7.9ではPH2におけるよりも70倍の速さで分解すること
を示している。従って、本発明まではレバミゾールとAP
活性のために必要な高PH検定緩衝液とを検定実施前に予
め混合することができなかった。従って、検定試薬を予
め混合することから生ずる時間、費用及び検定の容易さ
に関する有意な利益が得られなかった。本発明は先行技
術の検定法のこの欠点を解消することを目的とする。
ルはアルカリ性PHでは不安定なことが知られている。デ
ィキンソン（Dickinson）等はアナリストAnalyst96,248
（1971）に於てレバミゾールが高温では迅速に分解し、
PH7.9ではPH2におけるよりも70倍の速さで分解すること
を示している。従って、本発明まではレバミゾールとAP
活性のために必要な高PH検定緩衝液とを検定実施前に予
め混合することができなかった。従って、検定試薬を予
め混合することから生ずる時間、費用及び検定の容易さ
に関する有意な利益が得られなかった。本発明は先行技
術の検定法のこの欠点を解消することを目的とする。
（発明の構成） 標識としてAPを用いて分析物の免疫検定法を実施する
ために有用な組成物は特定アミンを含む高PH緩衝液中で
安定化した６−フェニルテトラヒドロイミダゾ−〔1,2
−ｂ〕チアゾールクラスの要素を含む。好ましいチアゾ
ールはレバミゾールであり、好ましい緩衝液は２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノール（AMP）とAPの基質
を含む。
ために有用な組成物は特定アミンを含む高PH緩衝液中で
安定化した６−フェニルテトラヒドロイミダゾ−〔1,2
−ｂ〕チアゾールクラスの要素を含む。好ましいチアゾ
ールはレバミゾールであり、好ましい緩衝液は２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノール（AMP）とAPの基質
を含む。
本発明の他の態様は、本発明の組成物と標識としての
腸APを用いた、組成物中のレバミゾールが非腸APを阻害
する、分析物の免疫検定法である。本発明の好ましい検
定法ではウィルス抗原を固体支持体上に捕獲して、腸AP
と結合した特異的抗体と接触させる。本発明の開示で
は、不活性蛋白質なる用語は、固体支持体上に固定され
るが検定法の他の成分とは実質的に反応しない蛋白質を
意味する。
腸APを用いた、組成物中のレバミゾールが非腸APを阻害
する、分析物の免疫検定法である。本発明の好ましい検
定法ではウィルス抗原を固体支持体上に捕獲して、腸AP
と結合した特異的抗体と接触させる。本発明の開示で
は、不活性蛋白質なる用語は、固体支持体上に固定され
るが検定法の他の成分とは実質的に反応しない蛋白質を
意味する。
本発明は、本発明の検定法の実施に有用な組成物を含
む材料のキットを包含する。
む材料のキットを包含する。
標識として腸APを用いる検定法にレバミゾールを含め
ると、体液サンプル中に存在してAP基質の非特異的脱ホ
スホリル化を生ずる非腸APを阻害することによって検定
感度が有意に高められる。レバミゾールはAP活性に必要
なアルカリ性PHでは不安定であるので、先行技術の開示
ではレバミゾールが検定の直前に基質に加えられる。特
定の緩衝液により検定法の好ましいPHにおいて安定化し
たレバミゾールを含む組成物を提供することによって、
本発明は調製時に充分な保存寿命安定性を伴ってレバミ
ゾール基質と緩衝液とを混合することを可能にし、それ
によって分析精度と１種類の試薬溶液のみを扱うことに
よる便利さとを備えた分析手段を提供することが可能に
なる。
ると、体液サンプル中に存在してAP基質の非特異的脱ホ
スホリル化を生ずる非腸APを阻害することによって検定
感度が有意に高められる。レバミゾールはAP活性に必要
なアルカリ性PHでは不安定であるので、先行技術の開示
ではレバミゾールが検定の直前に基質に加えられる。特
定の緩衝液により検定法の好ましいPHにおいて安定化し
たレバミゾールを含む組成物を提供することによって、
本発明は調製時に充分な保存寿命安定性を伴ってレバミ
ゾール基質と緩衝液とを混合することを可能にし、それ
によって分析精度と１種類の試薬溶液のみを扱うことに
よる便利さとを備えた分析手段を提供することが可能に
なる。
本発明は多くの種々な形式の実施態様によって実施さ
れるが、ここでは特に好ましい実施態様を詳述する。こ
の開示が本発明の原理の例示と見なすべきものであり、
本発明をここに述べる実施態様に限定することを意図し
ないものであることは理解されよう。本発明の範囲は特
許請求の範囲とその均等物によって定められる。
れるが、ここでは特に好ましい実施態様を詳述する。こ
の開示が本発明の原理の例示と見なすべきものであり、
本発明をここに述べる実施態様に限定することを意図し
ないものであることは理解されよう。本発明の範囲は特
許請求の範囲とその均等物によって定められる。
本発明は標識としての腸APと、被検サンプル中に存在
すると考えられる非腸APの阻害剤としてのレバミゾール
とを含む検定に有用な新しい組成物を提供する。本発明
を非腸APの好ましい阻害剤であるレバミゾールに関して
説明するが、非腸APを選択的に阻害するイミダゾ〔1,2
−ｂ〕チアゾールクラスの他の化合物も本発明の範囲内
に入ると考えられる。
すると考えられる非腸APの阻害剤としてのレバミゾール
とを含む検定に有用な新しい組成物を提供する。本発明
を非腸APの好ましい阻害剤であるレバミゾールに関して
説明するが、非腸APを選択的に阻害するイミダゾ〔1,2
−ｂ〕チアゾールクラスの他の化合物も本発明の範囲内
に入ると考えられる。
レバミゾールは多年にわたって獣医学用に用いられて
いる駆虫薬の属名（genesic name）である。これは化学
的には（−）2,3,5,6,−テトラヒドロ−６−フェニルイ
ミダゾ〔1,2−ｂ〕チアゾールであり、多くの同族体が
公知である。例えば、側基（pendent）のフェニル環に
炭素数１〜６の低級アルキル基及び例えばクロロ，ブロ
モのようなハロゲン基等の置換基を有する同族体が非腸
APの阻害剤であり、本発明の範囲に含まれる。本発明を
レバミゾールに関して述べるが、一般にテトラミゾール
として知られた、レバミゾールのラセミ形も本発明に用
いられる。
いる駆虫薬の属名（genesic name）である。これは化学
的には（−）2,3,5,6,−テトラヒドロ−６−フェニルイ
ミダゾ〔1,2−ｂ〕チアゾールであり、多くの同族体が
公知である。例えば、側基（pendent）のフェニル環に
炭素数１〜６の低級アルキル基及び例えばクロロ，ブロ
モのようなハロゲン基等の置換基を有する同族体が非腸
APの阻害剤であり、本発明の範囲に含まれる。本発明を
レバミゾールに関して述べるが、一般にテトラミゾール
として知られた、レバミゾールのラセミ形も本発明に用
いられる。
本発明によると、pH4以上の溶液中では加水分解する
レバミゾールはAPが必要とするアルカリ性pHでは特定の
高pHアミン緩衝液を含む組成物中でAPと混合することに
よって安定化されることが判明した。この組成物は緩衝
液、レバミゾール、APの基質、及び任意に塩化マグネシ
ウムを含む。組成物中のレバミゾールの濃度は約0.1〜1
00mM、好ましくは約４〜30mMである。
レバミゾールはAPが必要とするアルカリ性pHでは特定の
高pHアミン緩衝液を含む組成物中でAPと混合することに
よって安定化されることが判明した。この組成物は緩衝
液、レバミゾール、APの基質、及び任意に塩化マグネシ
ウムを含む。組成物中のレバミゾールの濃度は約0.1〜1
00mM、好ましくは約４〜30mMである。
本発明の緩衝液は、レバミゾールが実質的に安定であ
る高pHアミン緩衝液である。適当な緩衝液はトリエタノ
ールアミン、２−アミノ−２−メチル−1,3−プロパン
ジオール（AMPD）、及び好のましくはAMPである。アミ
ンは緩衝液中に約１〜100、好ましくは約40〜60ミリモ
ルの濃度で存在しうる。
る高pHアミン緩衝液である。適当な緩衝液はトリエタノ
ールアミン、２−アミノ−２−メチル−1,3−プロパン
ジオール（AMPD）、及び好のましくはAMPである。アミ
ンは緩衝液中に約１〜100、好ましくは約40〜60ミリモ
ルの濃度で存在しうる。
組成物中に含まれるAPの適当な基質はニトロフェノー
ル、好ましくはｐ−ニトロフェノールのリン酸エステル
である。好ましい基質は３−ヒドロキシインドールのリ
ン酸エステルであり、これは脱ホスホリル化の際に有色
インドキシルに酸化結合する。このような基質の典型的
な例は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェート、好ましくは３−インドリルホスフェートであ
る。基質は組成物中に約0.1〜100ミリモル、好ましくは
約１〜50ミリモルの濃度で存在する。最も好ましい緩衝
液は50mM AMP、pH9.8である。
ル、好ましくはｐ−ニトロフェノールのリン酸エステル
である。好ましい基質は３−ヒドロキシインドールのリ
ン酸エステルであり、これは脱ホスホリル化の際に有色
インドキシルに酸化結合する。このような基質の典型的
な例は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェート、好ましくは３−インドリルホスフェートであ
る。基質は組成物中に約0.1〜100ミリモル、好ましくは
約１〜50ミリモルの濃度で存在する。最も好ましい緩衝
液は50mM AMP、pH9.8である。
好ましい組成物は付加的に塩化マグネシウムを約0.1
〜2.0ミリモル、好ましくは約0.5〜1.0ミリモルの濃度
で含有する。
〜2.0ミリモル、好ましくは約0.5〜1.0ミリモルの濃度
で含有する。
本発明の組成物はトレーサーの標識成分として腸APを
用いる免疫検定法に特に適している。APが基質の脱ホス
ホリル化に触媒作用を及ぼす免疫検定法は技術上周知で
あり、組成物のレバミゾール成分による非腸APの阻害を
含む免疫検定法は本発明の範囲に入ると考えられる。
用いる免疫検定法に特に適している。APが基質の脱ホス
ホリル化に触媒作用を及ぼす免疫検定法は技術上周知で
あり、組成物のレバミゾール成分による非腸APの阻害を
含む免疫検定法は本発明の範囲に入ると考えられる。
一般に、本発明の免疫検定法は抗原、抗体またはハプ
テンの測定に用いられる。本明細書では、測定すべき物
質を分析物と呼ぶ。分析物に対する唯一の限定は分析物
に実質的に特異的に結合する抗分析物が得られなければ
ならないということである。従って、分析物が抗原であ
る場合には、適当な抗分析物は特異的抗体である。もし
分析物がハプテンであるならば、適当な抗分析物は抗ハ
プテン抗体である。もし分析物が抗体であるならば、適
当な抗分析物は特異的抗−抗体である。本発明に抗分析
物として有用な抗体はモノクローナル抗体かポリクロー
ナル抗体のいずれかである。特異的に結合する抗体の調
製は技術上周知であり、本発明のこの態様を完全に理解
するためにこれ以上の説明はもはや不要である。
テンの測定に用いられる。本明細書では、測定すべき物
質を分析物と呼ぶ。分析物に対する唯一の限定は分析物
に実質的に特異的に結合する抗分析物が得られなければ
ならないということである。従って、分析物が抗原であ
る場合には、適当な抗分析物は特異的抗体である。もし
分析物がハプテンであるならば、適当な抗分析物は抗ハ
プテン抗体である。もし分析物が抗体であるならば、適
当な抗分析物は特異的抗−抗体である。本発明に抗分析
物として有用な抗体はモノクローナル抗体かポリクロー
ナル抗体のいずれかである。特異的に結合する抗体の調
製は技術上周知であり、本発明のこの態様を完全に理解
するためにこれ以上の説明はもはや不要である。
本発明の組成物を用いて有利に分析できる分析物は如
何なる由来のものでもよく、抗原、抗体またはハプテン
でありうる。例えば分析物は体液中に存在する抗原であ
るか、または体液から単離して、緩衝液のような異なる
液体中に導入することができる。他の場合には、分析物
を体液以外の例えば微生物の培養物または微生物の細胞
抽出物のような起源から得られる。好ましい分析物は抗
原であり、最も好ましくは例えばヘルペス単純ウィルス
（HSV）、アデノウィルス、インフルエンザＡウィル
ス、パラインフルエンザ３ウィルス及びRSVのような、
体液中に存在するウィルス抗原である。
何なる由来のものでもよく、抗原、抗体またはハプテン
でありうる。例えば分析物は体液中に存在する抗原であ
るか、または体液から単離して、緩衝液のような異なる
液体中に導入することができる。他の場合には、分析物
を体液以外の例えば微生物の培養物または微生物の細胞
抽出物のような起源から得られる。好ましい分析物は抗
原であり、最も好ましくは例えばヘルペス単純ウィルス
（HSV）、アデノウィルス、インフルエンザＡウィル
ス、パラインフルエンザ３ウィルス及びRSVのような、
体液中に存在するウィルス抗原である。
本発明の免疫検定法は技術上知られた通常のサンドイ
ッチ法または競合法によって実施される。この検定法は
不均一系まはは均一系のいずれでもよく、液相中または
固体支持体上で実施可能である。
ッチ法または競合法によって実施される。この検定法は
不均一系まはは均一系のいずれでもよく、液相中または
固体支持体上で実施可能である。
例えば、典型的なサンドイッチ検定法では、捕獲抗体
（Capture antibody）は例えば計量棒（dipstick）、
膜、マイクロタイタープレートウエルまたは管内壁のよ
うな固体支持体上に固定される。抗体被覆支持体を例え
ばカゼインまたはアルブミンのような不活性蛋白質でさ
らに被覆して、支持体上の実質的に全ての残留結合部位
をブロックして、支持体へのトレーサーの直接の非特異
的結合を抑制することが好ましい。不活性蛋白質による
ブロックは免疫検定技術分野において通常行われること
である。
（Capture antibody）は例えば計量棒（dipstick）、
膜、マイクロタイタープレートウエルまたは管内壁のよ
うな固体支持体上に固定される。抗体被覆支持体を例え
ばカゼインまたはアルブミンのような不活性蛋白質でさ
らに被覆して、支持体上の実質的に全ての残留結合部位
をブロックして、支持体へのトレーサーの直接の非特異
的結合を抑制することが好ましい。不活性蛋白質による
ブロックは免疫検定技術分野において通常行われること
である。
抗原を含むと考えられる溶液を抗体で被覆しブロック
した支持体に加え、抗体への抗原の結合を促進する条件
を与える。（この明細書では、抗体に結合した抗原を以
下では結合分画（bound fraction）と呼ぶことにす
る）。腸APとの共有結合によって標識した第２抗体を含
むトレーサーを加える。第２抗体が抗原と結合した後
に、抗体抗原標識抗体結合分画が固定された固体支持体
を本発明の組成物と接触させる。組成物中の基質は、固
体支持体上の結合トレーサーのAP成分によって脱ホスホ
リル化されて発色する。この色は、抗原の存在を示し、
色の強度は液体中の抗原濃度に直接比例する。
した支持体に加え、抗体への抗原の結合を促進する条件
を与える。（この明細書では、抗体に結合した抗原を以
下では結合分画（bound fraction）と呼ぶことにす
る）。腸APとの共有結合によって標識した第２抗体を含
むトレーサーを加える。第２抗体が抗原と結合した後
に、抗体抗原標識抗体結合分画が固定された固体支持体
を本発明の組成物と接触させる。組成物中の基質は、固
体支持体上の結合トレーサーのAP成分によって脱ホスホ
リル化されて発色する。この色は、抗原の存在を示し、
色の強度は液体中の抗原濃度に直接比例する。
本発明の典型的な競合検定法では、固体支持体上の一
定量の抗体を、腸APが結合した既知量の抗原を有する、
抗原とトレーサーを含むと考えられる液体と接触させ
る。抗原と酵素標識抗原は、溶液中のそれらの濃度に直
接比例して、支持体上の抗体に結合する。従って結合後
に支持体は、抗体−抗原結合分画と、抗体−AP標識抗原
結合分画とを含む。検定液相からの支持体の分離後、支
持体上の結合分画を、AP基質と接触させて発色させる。
しかし、本発明の競合検定法では、発色した色は液体中
の抗原濃度に反比例する。
定量の抗体を、腸APが結合した既知量の抗原を有する、
抗原とトレーサーを含むと考えられる液体と接触させ
る。抗原と酵素標識抗原は、溶液中のそれらの濃度に直
接比例して、支持体上の抗体に結合する。従って結合後
に支持体は、抗体−抗原結合分画と、抗体−AP標識抗原
結合分画とを含む。検定液相からの支持体の分離後、支
持体上の結合分画を、AP基質と接触させて発色させる。
しかし、本発明の競合検定法では、発色した色は液体中
の抗原濃度に反比例する。
本発明の好ましい検定法では、ウィルス抗原を含むと
推定されるサンプルを、固体支持体と共に直接インキュ
ベートする、すなわち捕獲抗体は用いられない。ウィル
ス抗原が固体支持体上に直接吸収（absorb）され、次に
標識としての腸APと、非腸APを阻害するためのレバミゾ
ールを用いて分析されることがわかった。本発明のこの
実施態様では、抗原を吸収した固体支持体は、上記に述
べたように、不活性蛋白質によってブロックするかまた
は、不活性蛋白質で予備ブロックし、この予備ブロック
した支持体上に直接抗原が吸収される。
推定されるサンプルを、固体支持体と共に直接インキュ
ベートする、すなわち捕獲抗体は用いられない。ウィル
ス抗原が固体支持体上に直接吸収（absorb）され、次に
標識としての腸APと、非腸APを阻害するためのレバミゾ
ールを用いて分析されることがわかった。本発明のこの
実施態様では、抗原を吸収した固体支持体は、上記に述
べたように、不活性蛋白質によってブロックするかまた
は、不活性蛋白質で予備ブロックし、この予備ブロック
した支持体上に直接抗原が吸収される。
本発明の組成物は、分析物に対して免疫検定法を実施
するために有用な材料のキットの一部として含まれる。
このキットは、任意に捕獲抗分析物を固定した固体支持
体、腸APを含む分析物のトレーサーおよび本発明の組成
物を含む。このキットに含まれる組成物は、レバミゾー
ル、本発明の緩衝液、APの基質を含み、任意に塩化マグ
ネシウムも含む。このキットはさらに検定試薬の容器お
よび器具、例えば、本発明の組成物を用いた検定法の実
施に有用なバイアル、スポイト等を含む。
するために有用な材料のキットの一部として含まれる。
このキットは、任意に捕獲抗分析物を固定した固体支持
体、腸APを含む分析物のトレーサーおよび本発明の組成
物を含む。このキットに含まれる組成物は、レバミゾー
ル、本発明の緩衝液、APの基質を含み、任意に塩化マグ
ネシウムも含む。このキットはさらに検定試薬の容器お
よび器具、例えば、本発明の組成物を用いた検定法の実
施に有用なバイアル、スポイト等を含む。
次の実施例は、本発明をさらに説明するために述べる
ものであり、本発明の限定を意図しないものである。
ものであり、本発明の限定を意図しないものである。
実施例Ｉ 種々の緩衝液中のレバミゾールの安定性 1mM塩化マグネシウムを含み、pH9.8に調節した、100mM
濃度の様々な緩衝液を調製した。緩衝液をオートクレー
ブで処理し、1mMレバミゾールを加え45℃に放置した
（促進分解試験）。次に、機能を有するレバミゾール量
を0.5mMレバミゾールの存在下または不存在下でのウシ
の肝臓アルカリンホスファターゼの活性を比較すること
により測定した：緩衝化サンプルの1:20稀釈物を、5mMp
−ニトロフェニルホスフェート含有1Mジエタノールアミ
ン（pH9.8）中に調製した。牛の肝臓APを添加し反応動
力学（reaction kinetics）を405nmで測定した。ホスフ
ァターゼに作用するレバミゾールの阻害定数（ki）を、
以下の関係式を用いて“ｔ＝0"で算出した。
濃度の様々な緩衝液を調製した。緩衝液をオートクレー
ブで処理し、1mMレバミゾールを加え45℃に放置した
（促進分解試験）。次に、機能を有するレバミゾール量
を0.5mMレバミゾールの存在下または不存在下でのウシ
の肝臓アルカリンホスファターゼの活性を比較すること
により測定した：緩衝化サンプルの1:20稀釈物を、5mMp
−ニトロフェニルホスフェート含有1Mジエタノールアミ
ン（pH9.8）中に調製した。牛の肝臓APを添加し反応動
力学（reaction kinetics）を405nmで測定した。ホスフ
ァターゼに作用するレバミゾールの阻害定数（ki）を、
以下の関係式を用いて“ｔ＝0"で算出した。
次に、機能を有するレバミゾールの量を、上記式の変
換式を用いて計算した。
換式を用いて計算した。
第Ｉ表は、試験中の種々の時間におけるレバミゾール
残留率を示す。
残留率を示す。
レバミゾールの安定性は他の緩衝液におけるよりも、
AMPDにおいて特にAMPにおいて実質的に大きいことがわ
かる。
AMPDにおいて特にAMPにおいて実質的に大きいことがわ
かる。
実施例II レバミゾールのｐ−ブロモ同族体の促進安定性試験
は、実施例Ｉで述べたと同様に実施した。この化合物は
レバミゾールよりも約10倍強力であるので、0.1mMp−ブ
ロモレバミゾール含有の種々の緩衝化原液を得るために
適当な希釈を実施した。第II表はこの実験の結果を示
す。
は、実施例Ｉで述べたと同様に実施した。この化合物は
レバミゾールよりも約10倍強力であるので、0.1mMp−ブ
ロモレバミゾール含有の種々の緩衝化原液を得るために
適当な希釈を実施した。第II表はこの実験の結果を示
す。
レバミゾールのｐ−ブロモ同族体の分解は親化合物よ
りもかなり迅速であることが認められるが、好ましい緩
衝剤の順序はほとんど変化しなかった。
りもかなり迅速であることが認められるが、好ましい緩
衝剤の順序はほとんど変化しなかった。
実施例III 呼吸器シンシチアル（Respiratory Syncyctical）ウィ
ルス（RSV）の検定 膜フィルタースタックは次の構造で構成した。
ルス（RSV）の検定 膜フィルタースタックは次の構造で構成した。
上層−0.3％カゼイン含有リン酸塩緩衝化生理食塩水中
で周囲温度で30分間浸漬することにより予備被覆した３
ミクロンのイムノダインイムノアフィニティーメンブレ
ン（Immunodyne Immunoaffinity Membrane）〔ポール
（Pall）、ニューヨーク州イーストヒルズ、＃BIA0030H
C5〕 中間層−不織レーヨンシート〔シュレイチャーアンドシ
ュエル（Schleicher and Schuell）、ニューハンプシャ
ー州、キーン＃５−Ｓ）。
で周囲温度で30分間浸漬することにより予備被覆した３
ミクロンのイムノダインイムノアフィニティーメンブレ
ン（Immunodyne Immunoaffinity Membrane）〔ポール
（Pall）、ニューヨーク州イーストヒルズ、＃BIA0030H
C5〕 中間層−不織レーヨンシート〔シュレイチャーアンドシ
ュエル（Schleicher and Schuell）、ニューハンプシャ
ー州、キーン＃５−Ｓ）。
下層−セルロース吸収パッド（２）〔フィルトレーショ
ンサイエンシス（Filtlation Sciences）ペンシルバニ
ア州マントホリースプリング；＃ED320−200） 膜層は、上層の上に形成された受容孔のあるプラスチ
ックホルダーに入れた。この孔に、受容孔より狭い開口
と上層膜に対して平坦な部位とを有する流量制限インサ
ートをこの孔に嵌め込んだ。
ンサイエンシス（Filtlation Sciences）ペンシルバニ
ア州マントホリースプリング；＃ED320−200） 膜層は、上層の上に形成された受容孔のあるプラスチ
ックホルダーに入れた。この孔に、受容孔より狭い開口
と上層膜に対して平坦な部位とを有する流量制限インサ
ートをこの孔に嵌め込んだ。
抗原ストックは下記の組成の緩衝液中で希釈した呼吸
器シンチアルウイルス（RSV）〔ロング（Long）菌株〕
感染HEp−２細胞を用いて調製した:250mMトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン塩酸（トリスHCl）、150mM
塩化ナトリウム（NaCl）、10mMエチレンジアミンテトラ
アセテート（EDTA）、４％（V/V）ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート〔ツィーン（Tween）20〕、
１％ｎ−アセチルシステイン、0.2％アジ化ナトリウム
（NaN3）、pH8.5。対照抗原は非感染HEp−２細胞から同
様に調製した。
器シンチアルウイルス（RSV）〔ロング（Long）菌株〕
感染HEp−２細胞を用いて調製した:250mMトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン塩酸（トリスHCl）、150mM
塩化ナトリウム（NaCl）、10mMエチレンジアミンテトラ
アセテート（EDTA）、４％（V/V）ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート〔ツィーン（Tween）20〕、
１％ｎ−アセチルシステイン、0.2％アジ化ナトリウム
（NaN3）、pH8.5。対照抗原は非感染HEp−２細胞から同
様に調製した。
この抗原（または対照）の150μｌアリコートを装置
に供給し、流量制限インサートを通して上部膜層上に排
出させた。（液体は支持吸収層の毛管作用によって上部
膜を通って排出される。）次に流量制限インサートを除
去し、この装置に50mMトリスHCl、150mM NaCl、0.2％Na
N3、pH7.2から成り〔トリス緩衝化生理的食塩水（TB
S）〕、さらにウサギIgG1mg/mlを含む洗浄溶液150μｌ
を加えた。
に供給し、流量制限インサートを通して上部膜層上に排
出させた。（液体は支持吸収層の毛管作用によって上部
膜を通って排出される。）次に流量制限インサートを除
去し、この装置に50mMトリスHCl、150mM NaCl、0.2％Na
N3、pH7.2から成り〔トリス緩衝化生理的食塩水（TB
S）〕、さらにウサギIgG1mg/mlを含む洗浄溶液150μｌ
を加えた。
アルカリホスファターゼに結合した抗RSV抗体27μg/m
lを含む溶液を、50mMトリスHCl、100mM NaCl、200mMリ
ン酸ナトリウム、１％カゼイン、1mM塩化マグネシウ
ム、0.1mM塩化亜鉛、及び1mM2−メルカブトエタノール
を含む緩衝液（pH7.5）中に調製した。この混合物のア
リコート150μｌを装置に加え、膜スタックに吸収させ
た。短時間（２分間）のインキュベーション後に、装置
をTBS（IgG含まず）300μｌで洗浄した。
lを含む溶液を、50mMトリスHCl、100mM NaCl、200mMリ
ン酸ナトリウム、１％カゼイン、1mM塩化マグネシウ
ム、0.1mM塩化亜鉛、及び1mM2−メルカブトエタノール
を含む緩衝液（pH7.5）中に調製した。この混合物のア
リコート150μｌを装置に加え、膜スタックに吸収させ
た。短時間（２分間）のインキュベーション後に、装置
をTBS（IgG含まず）300μｌで洗浄した。
0.33mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム、１％メタ
ノール及び0.2％NaN3を含む溶液150μｌを装置に加え
た。この後に、50mM 2−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノール酢酸（AMPHOAc）中の12mMレバミゾール、0.2％
NaN3、1mM塩化マグネシウムを含む溶液（pH9.8）を加え
た。周囲温度において５分間インキュベーションした後
に、200mMリン酸カルシウム、10mM EDTA、0.2％NaN3を
含む溶液（pH7.2）150μｌを添加して発色反応を停止さ
せた。
ノール及び0.2％NaN3を含む溶液150μｌを装置に加え
た。この後に、50mM 2−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノール酢酸（AMPHOAc）中の12mMレバミゾール、0.2％
NaN3、1mM塩化マグネシウムを含む溶液（pH9.8）を加え
た。周囲温度において５分間インキュベーションした後
に、200mMリン酸カルシウム、10mM EDTA、0.2％NaN3を
含む溶液（pH7.2）150μｌを添加して発色反応を停止さ
せた。
生成した膜の色の濃度を反射濃度計（reflectance de
nsitometer）〔グレタグ（Gretag）、ワシントン州シア
トル、モデル183〕によって測定した。一連の抗原希釈
物を用いて実施した実験の結果を添付図面に示す。
nsitometer）〔グレタグ（Gretag）、ワシントン州シア
トル、モデル183〕によって測定した。一連の抗原希釈
物を用いて実施した実験の結果を添付図面に示す。
本発明はAP活性に必要なアルカリ性pHにおいてレバミ
ゾールが安定であるので、非腸APを選択的に阻害するレ
バミゾールの能力を利用できる緩衝化組成物を提供す
る。この場合に、レバミゾールとAP基質とのプレパッケ
ージングの利点を利用した高感度の免疫検定法に腸APを
用いることができる。
ゾールが安定であるので、非腸APを選択的に阻害するレ
バミゾールの能力を利用できる緩衝化組成物を提供す
る。この場合に、レバミゾールとAP基質とのプレパッケ
ージングの利点を利用した高感度の免疫検定法に腸APを
用いることができる。
図面は本発明の方法による呼吸器シンチアルウイルス
（RSV）と反射濃度のプロットを示している。
（RSV）と反射濃度のプロットを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５ Ｓ 33/569 Ｇ
Claims (2)
- 【請求項１】固体支持体上に固定された不活性蛋白質； ウイルス抗原に特異的に結合しうる、腸アルカリホスフ
ァターゼに結合した抗体；および、 50mM ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、４
〜30mM レバミゾール、１〜15mM ３−インドリルホス
フェートおよび0.5〜1.0mM 塩化マグネシウムを含む緩
衝液； を含むキットであって、不活性蛋白質はウイルス抗原、
腸アルカリホスファターゼおよび抗体のいずれとも実質
的に反応しないことを特徴とする、ウイルス抗原に関す
るアルカリホスファターゼ免疫検定のためのキット。 - 【請求項２】（ａ）不活性蛋白質で予めコートされた固
体支持体と、ウイルス抗原を含むと推定される液体を混
合してウイルス抗原を支持体に付着させ； （ｂ）抗原に特異的に結合しうる抗体であって、腸アル
カリホスファターゼに結合した抗体を含有するトレーサ
ーとウイルス抗原を結合させて、支持体上に腸アルカリ
ホスファターゼを含む結合分画を形成し； （ｃ）腸アルカリホスファターゼを含む支持体を液体か
ら分離し； （ｄ）支持体を、レバミゾール、アルカリホスファター
ゼ用基質および２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ール含有緩衝液を含む組成物と接触させて、支持体上の
アルカリホスファターゼによって基質を有色生成物に変
換させ；そして （ｅ）有色生成物の形成によってウイルス抗原を検出す
る； 工程からなるが、その際、不活性蛋白質はウイルス抗
原、腸アルカリホスファターゼおよび抗体のいずれとも
実質的に反応しないことを特徴とする、ウイルス抗原の
検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US272844 | 1988-11-18 | ||
| US07/272,844 US5135847A (en) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | Substrate composition for alkaline phosphatase and method for assay using same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02207800A JPH02207800A (ja) | 1990-08-17 |
| JPH0820446B2 true JPH0820446B2 (ja) | 1996-03-04 |
Family
ID=23041552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1299458A Expired - Lifetime JPH0820446B2 (ja) | 1988-11-18 | 1989-11-17 | アルカリホスファターゼを用いた免疫検定のためのキットおよび方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5135847A (ja) |
| EP (1) | EP0369362B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0820446B2 (ja) |
| AT (1) | ATE118553T1 (ja) |
| AU (1) | AU619053B2 (ja) |
| CA (1) | CA2001206C (ja) |
| DE (1) | DE68921151T2 (ja) |
| DK (1) | DK577089A (ja) |
| ES (1) | ES2067518T3 (ja) |
| FI (1) | FI96801C (ja) |
| GR (1) | GR3015082T3 (ja) |
| IE (1) | IE67351B1 (ja) |
| MY (1) | MY106970A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2008275592A (ja) * | 2007-04-03 | 2008-11-13 | Sysmex Corp | アルカリホスファターゼ標識検出用試薬キット、免疫測定用試薬キット及び免疫測定方法 |
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| DK0636247T3 (da) * | 1993-02-17 | 1999-05-31 | Dade Behring Inc | Fremgangsmåde og sammensætning til reduktion af virkningerne af endogen alkalisk phosphatase |
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| CN111289456B (zh) * | 2020-03-31 | 2023-04-07 | 西安交通大学第二附属医院 | 一种检测粪便及肠道组织中肠碱性磷酸酶iap的方法 |
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| US4693970A (en) * | 1985-06-21 | 1987-09-15 | Becton, Dickinson And Company | Immunoassay using complement |
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1989
- 1989-10-23 CA CA002001206A patent/CA2001206C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-23 MY MYPI89001472A patent/MY106970A/en unknown
- 1989-10-27 AU AU43866/89A patent/AU619053B2/en not_active Ceased
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- 1989-11-11 AT AT89120946T patent/ATE118553T1/de not_active IP Right Cessation
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