FI96801B - Materiaalipakkaus ja menetelmä analyytin määrittämiseksi - Google Patents

Description

96801

Materiaalipakkaus ja menetelmä analyytin määrittämiseksi

Keksintö kohdistuu analyytin immuunimääritykseen sekä siinä käytettävään materiaalipakkaukseen, ja se kohdistuu erityisemmin menetelmään ja materiaaleihin immuunimäärityksen toteuttamiseksi käyttäen alkalisen fosfataasin uutta substraattikoos-tumusta.

Alalla on kehitetty sekä nopeita että herkkiä määritysjärjestelmiä aineen pitoisuuden määrittämiseksi fluidista. Immuuni -määritykset riippuvat antigeenin tai hapteenin sitoutumisesta spesifiseen vasta-aineeseen, ja ne ovat olleet erityisen käyttökelpoisia, koska niiden spesifisyys ja herkkyys ovat hyvät. Näissä määrityksissä käytetään yleensä yhtä edellä mainittua reagenssia leimatussa muodossa ja tätä leimattua reagenssia kutsutaan usein jäljittäjäksi. Immuunimääritysmenetelmät voidaan toteuttaa liuoksessa tai kiinteän kantajan pinnalla, ja ne voivat olla joko heterogeenisia, jolloin sitoutuneen jäljittäjän erottaminen vapaasta (sitoutumattomasta) jäljittäjästä on välttämätöntä, tai homogeenisia, jolloin erotusvaihetta ei tarvita.

Entsyymejä on käytetty usein leima-aineina immuunimäärityksis-sä. Tavanomaisessa, entsyymiin perustuvassa immuunimäärityk-sessä (EIM) entsyymi konjugoidaan kovalenttisesti spesifisesti sitoutuvan antigeeni-vasta-aine-parin yhteen komponenttiin ja tuloksena saatava entsyymikonjugaatti saatetaan reagoimaan substraatin kanssa signaalin tuottamiseksi, joka signaali ilmaistaan ja mitataan. Tämä signaali voi olla värin muuttuminen, joka ilmaistaan näköhavainnon perusteella tai spektrofo-tometrisellä tekniikalla, tai se voi olla substraatin muuttuminen tuotteeksi, joka voidaan ilmaista fluoresenssin perusteella .

Immuunimäärityksessä käytettävältä entsyymiltä vaaditaan, että se on stabiili, hyvin reaktiivinen, sitä on saatavana erittäin puhtaassa muodossa, tuottaa stabiileja konjugaatteja (jäljittäjiä) ja on halpaa, turvallista ja sen käyttö on vaivatonta.

96801 2 Nämä vaatimukset täyttävä ja immuunimäärityksessä usein käytetty entsyymi on alkalinen fosfataasi (AP).

AP-entsyymiä esiintyy olennaisesti kaikissa eläinlajeissa ja sitä esiintyy nisäkkäässä kahtena eri muotona. Yksi näistä muodoista on jakautuneena moniin eri kudoksiin, kun taas toista esiintyy vain suolistossa.

AP katalysoi fosfaattiryhmien pilkkoutumista irti yleensä värittömistä fosforyloituneista substraateista, jolloin saadaan värillisiä tuotteita. Koska tämä entsyymi on aktiivista alka-lisessa pH-arvossa, niin AP-entsyymiä hyväksikäyttävät määritys järjestelmät käsittävät yleensä puskurin, joka pitää määri tysväliaineen pH-arvon alueella 7-9.

Hyvin tunnettua on se, että levamisoli, (-)2,3,5,6-tetrahydro-6 - fenyyli-imidatso[1,2-b]tiatsoli, on nisäkkään useista kudos-tyypeistä peräisin olevan AP:n voimakas inhibiittori. Sen inhiboiva teho on kuitenkin arviolta 100 kertaa heikompaa suolistosta saadun AP:n tapauksessa (Van Belle, Biochim. et Bio-ohvs. Acta.. 289, 158 (1972).

Tätä selektiivisyyttä on hyödynnetty immuunimäärityksessä. Määrityksessä käytettäessä levamisoli ei häiritse vasikan suolistosta saadun AP:n tuottamaa spesifistä immuunisignaalia, mutta se heikentää mahdollisen, muualta kuin suolistosta peräisin olevan AP:n, jota saattaa olla läsnä kliinisessä näytteessä, tuottamaa epäspesifistä signaalia. Julkaisussa Morris et ai., Journal of Immunological Methods. 68, li (1984), kuvataan menetelmä, jolla voidaan ilmaista kokonaisten solujen pinnalla olevia antigeenejä vastustavien monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen vasikan suolistosta saadun AP:n ja vuohen anti-hiiri-Igb:n väliseen konjugaattiin substraatin ja levamisolin läsnäollessa, jonka levamisolin tehtävänä on inhiboida muualta kuin suolistosta peräisin oleva AP.

Julkaisussa Ponder et ai., Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29, 981 (1981), kuvataan kudospaloissa läsnäolevan hiiri-H2-antigeenin ilmaiseminen inkuboimalla kudospaloja anti -hiiri -H2 -vasta-aineen kanssa ja käsittelemällä suoliston 11 3 96801 AP-entsyymillä leimatulla konjugaatilla, minkä jälkeen käytetään entsyymin substraattia ja levamisolia muualta kuin suolistosta peräisin olevan AP:n inhiboimiseksi. Tässä Ponder'in et ai. mukaisessa menetelmässä suodatettuun AP-substraatti -liuokseen lisätään levamisolia pitoisuudeksi 1 mM ennen substraatin yhdistämistä kudoskappaleisiin.

Vaikka levamisoli onkin käyttökelpoinen EIM-menetelmissä, kuten edellä mainituissa patenttijulkaisuissa kuvataan, niin se tiedetään kuitenkin epästabiiliksi alkalisessa pH:ssa. Julkaisussa Dickinson et ai., Analyst. 96, 248, (1971), ovat osoittaneet, että levamisoli hajoaa nopeasti korkeassa lämpötilassa ja että se hajoaa 70 kertaa nopeammin pH-arvossa 7,9 kuin pH-arvossa 2. Näin ollen oheiseen keksintöön saakka levamisolia ja AP-aktiivisuudelle välttämätöntä määrityspusku-ria, jonka pH on korkea, ei olla voitu sekoittaa edeltäkäsin ennen määrityksen suorittamista. Täten menetelmässä ei olla voitu käyttää hyväksi niitä etuja, kuten ajan ja kustannusten säästöä sekä määrityksen vaivattomuutta, jotka saavutetaan sekoittamalla määritysreagenssit etukäteen. Oheisen keksinnön tavoitteena on päästä eroon tästä tekniikan nykytason mukaisiin määrityksiin liittyvästä puutteesta.

Koostumus, jota voidaan käyttää analyytin immuunimääritykses-sä, jossa AP-entsyymi toimii leimana, käsittää 6-fenyylitet-rahydroimidatso[l,2-b]tiatsoli-luokan jäsenen stabiloituna tiettyä amiinia sisältävässä puskurissa, jonka pH on suuri. Edullinen tiatsoli on levamisoli ja edullinen puskuri käsittää 2-amino-2-metyyli-1-propanolia (AMP) ja AP-entsyymin substraattia.

Keksinnön muuna piirteenä on analyytin immuunimääritys käyttäen keksinnön mukaista koostumusta ja leimana suolistosta saatua AP-entsyymiä, jolloin koostumuksessa läsnäoleva levamisoli inhiboi muualta kuin suolistosta peräisin olevan AP:n. Keksinnön mukaisessa edullisessa määrityksessä virusantigeeni vangitaan kiinteän kantajan pinnalle ja saatetaan kosketukseen suoliston AP-entsyymiin konjugoidun spesifisen vasta-aineen kanssa. Oheisessa julkaisussa käsitteellä inertti proteiini tarkoitetaan mitä tahansa sellaista proteiinia, joka voidaan 4 96801 kiinnittää kiinteään kantajaan, mutta joka ei reagoi olennaisesti minkään muun määrityksessä läsnäolevan komponentin kanssa.

Keksintö kohdistuu myös materiaalipakkaukseen, joka sisältää keksinnön mukaisessa määrityksessä käyttökelpoista koostumusta. Keksinnön mukaiselle materiaalipakkaukselle on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksien 1 ja 2 tunnus-merkkiosissa.

Levamisolin eli 2,3,4,5-tetrahydro-6-fenyyli-imidatso[1,2-b]-triatsolin sisällyttäminen määritykseen, jossa suoliston AP-entsyymiä käytetään leimana, parantaa merkittävästi määrityksen herkkyyttä inhiboimalla muualta kuin suolistosta peräisin olevaa AP-entsyymiä, jota voi olla läsnä ruumiinnäytteessä ja joka muussa tapauksessa aiheuttaisi AP-substraatin epäspesifistä defosforyloitumista. Koska levamisoli on epästabiilia AP-aktiivisuudelle välttämättömässä aikaiisessa pH-arvossa, niin tekniikan nykytason mukaisissa menetelmissä sitä lisätään välittömästi ennen määrityksen substraattia. Keksinnössä saadaan aikaan koostumus, joka sisältää levamisolia stabiloituna erityisessä puskurissa ja määrityksen toivotussa pH-arvossa, joten keksintö tekee mahdolliseksi levamisolisubstraatin ja puskurin sekoittamisen valmistushetkellä siten, että varas-tointistabiilisuus on riittävä, jolloin analyytikko pääsee nauttimaan tarkasta ja vaivattomasta määritysmenetelmästä joutuessaan käsittelemään vain yhtä reagenssiliuosta.

Kuvio esittää tuloksia, jotka saatiin määritettäessä hengityselinten solusitkosvirusta (RSV) keksinnön mukaisella menetelmällä.

Vaikka hyvin monet erilaiset suoritusmuodot täyttävätkin kek-sinnnön vaatimukset, niin seuraavassa kuvataan kuitenkin yksityiskohtaisesti keksinnön edullisia suoritusmuotoja pitäen mielessä se, että oheisen julkaisun tavoitteena on havainnollistaa keksinnön periaatteita, keksintöä kuitenkaan kuvattuihin suoritusmuotoihin rajoittamatta. Keksinnön laajuus on määritelty liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa ja niiden vastineissa.

5 96801

Keksinnössä saadaan aikaan uusi koostumus, jota voidaan käyttää sellaisessa määrityksessä, joka käsittää leimana toimivaa suoliston AP-entsyymiä sekä levamisolia mahdollisen muualta kuin suolistosta peräisin olevan AP:n inhibiittorina, jota muualta kuin suolistosta peräisin olevaa AP-entsyymiä voi olla läsnä määritettävässä näytteessä. Keksintö kuvataan levamiso-lin avulla, joka levamisoli on muualta kuin suolistosta peräisin olevan AP-entsyymin edullisin inhibiittori; kuitenkin on selvää, että myös kaikkien muiden imidatso[1,2-b]-tiatsolien luokkaan kuuluvien yhdisteiden, jotka inhiboivat selektiivisesti muualta kuin suolistosta peräisin olevaa AP-entsyymiä, katsotaan kuuluvan keksinnnön puitteisiin.

Levamisoli on eläinlääketieteessä useiden vuosien ajan käytössä olleiden matolääkkeiden yleisnimitys. Se on kemiallisesti (-)2,3,5,6-tetrahydro-6-fenyyli-imidatso[1,2-b]tiatsoli ja sen monia analogeja tunnetaan. Esimerkiksi analogit, joissa sivu-ryhmän muodostavassa fenyylirenkassa on substituentteja, esimerkiksi 1-6 hiiliatomia käsittävä alempi alkyyli ja halogee-niryhmät kuten kloori ja bromi, inhiboivat muualta kuin suolistosta peräisin olevaa AP-entsyymiä ja niiden katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin. Samoin on selvää, että vaikka keksintö kuvataankin levamisolin avulla, niin keksinnössä voidaan kuitenkin käyttää myös levamisolin raseemista muotoa, joka tunnetaan yleisesti tetramisolina.

Keksinnön mukaisesti ollaan todettu, että levamisoli, joka hydrolysoituu, kun se joutuu liuokseen, jonka pH on 4 tai sitä suurempi, voidaan stabiloida AP-entsyymille välttämättömässä alkalisessa pH-arvossa sisällyttämällä sitä koostumukseen, joka käsittää valikoituja amiinipuskureita, joilla on korkea pH. Tämä koostumus käsittää puskurin, levamisolin, AP-entsyymin substraatin ja se sisältää valinnaisesti magnesiumklori-dia. Levamisolin pitoisuus tässä koostumuksessa voi olla noin 0,1-100 mM, edullisesti noin 4-30 mM.

Keksinnön mukainen puskuri voi olla mikä tahansa amiinipusku-ri, jolla on korkea pH, ja jossa levamisoli on olennaisen stabiilia. Sopivia puskureita ovat trietanoliamiini, 2-amino-2-metyyli-1,3-propaanidioli (AMPD) ja edullisesti AMP. Amiinia 6 96801 voi olla läsnä puskurissa pitoisuutena, joka on noin 1-100, edullisesti noin 40-60 mM.

Sopivia AP-entsyymin substraatteja, joita voidaan sisällyttää koostumukseen, ovat nitrofenolin, edullisesti p-nitrofenolin fosfaattiestereitä. Edulliset substraatit ovat 3-hydroksi-in-dolien fosfaattiestereitä, joissa tapahtuu defosforylaation seurauksena hapettavaa kytkeytymistä värillisiksi indoksyy-leiksi. Esimerkkeinä näistä substraateista voidaan mainita 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti ja edullisesti 3-indolyy-lifosfaatti. Tätä substraattia voi olla läsnä koostumuksessa noin 0,1-100 mM:n pitoisuutena, edullisesti noin 1-50 mM:n pitoisuutena. Kaikkein edullisin puskuri on 50 mM AMP, pH 9,8.

Edulliset koostumukset sisältävät lisäksi magnesiumkloridia noin 0,1-2,0 mM:n pitoisuutena, edullisesti noin 0,5-1,0 mM:n pitoisuutena.

Keksinnön mukainen koostumus soveltuu erityisen hyvin immuuni-määritykseen, jossa suoliston AP-entsyymiä käytetään jäljittäjän leimakomponenttina. Alalla tunnetaan hyvin sellaiset immuunimääritysmenetelmät, joissa AP katalysoi substraatin defosforylaatiota, ja kaikkien niiden immuunimääritysmenetel-mien, joissa koostumuksen levamisolikomponenttia käytetään inhiboimaan muualta kuin suolistosta peräisin oleva AP, katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin.

Yleisesti, keksinnön mukaista immuunimääritystä voidaan käyttää antigeenin, vasta-aineen tai hapteenin määrittämiseen. Tässä kuvauksessa määritettävään aineeseen viitataan käsitteellä ana-lyytti. Ainoa tähän analyyttiin liittyvä rajoitus on se, että olennaisen spesifisesti analyyttiin sitoutuvan antianalyytin saamisen on oltava mahdollista. Täten, mikäli analyytti on antigeeni, niin sopiva antianalyytti on spesifinen vasta-aine. Mikäli analyytti on hapteeni, niin sopiva antianalyytti on an-tihapteeni-vasta-aine. Mikäli analyytti on vasta-aine, niin sopiva antianalyytti on spesifinen vasta-vasta-aine. Vasta-aineet, joita voidaan käyttää antianalyytteina oheisessa keksinnössä, voivat olla joko monoklonaalisia tai polyklonaalisia. Spesifisesti sitoutuvien vasta-aineiden kehittäminen on alalla ti 7 96801 hyvin tunnettua, joten yksityiskohtaisempaa kuvausta ei tarvita keksinnön täydelliseksi ymmärtämiseksi.

Analyytit, joita voidaan määrittää edullisesti käyttämällä hyväksi keksinnön mukaista koostumusta, voivat olla peräisin mistä lähteestä tahansa, ja ne voivat olla antigeenejä, vasta-aineita tai hapteeneja. Analyytti voi olla esimerkiksi ruumiinnesteessä läsnäoleva antigeeni, tai se on voitu eristää ruumiinnesteestä ja siirtää sitten toiseen nesteeseen kuten puskuriin. Muissa tapauksissa analyytti voi olla peräisin muusta lähteestä kuin ruumiinnesteestä, esimerkiksi mikro-organismien viljelmästä tai siitä saadusta solu-uutteesta. Edullisia analyytteja ovat antigeenit, edullisimmin ruumiinnesteessä läsnäolevat virusantigeenit, joista voidaan mainita Herpes simplex-virus (HSV), adenovirus, influenssa A-virus, parainfluenssa 3-virus ja RSV.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle virusantigeenin ja analyytin ilmaisemiseksi on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimusten 3 ja 5 tunnusmerkkiosissa.

Keksinnön mukainen immuunimääritys voidaan toteuttaa millä tahansa alalla tunnetulla perinteisellä kerrostemenetelmällä tai kilpailuun perustuvalla menetelmällä. Määritys voi olla joko heterogeeninen tai homogeeninen, ja se voidaan toteuttaa joko nestefaasissa tai kiinteän kantajan päällä. Esimerkiksi, tyypillisessä kerrostemäärityksessä sieppausvasta-aine voidaan kiinnittää kiinteään kantajaan, kuten mittatikkuun, kalvoon, mikrotiitterilevyn koloon tai putken sisäseinämään. Vasta-aineella pinnoitettu kantaja pinnoitetaan tämän jälkeen edullisesti inertillä proteiinilla kuten kaseiinilla tai albumiinilla olennaisesti kaikkien kantajan pinnalle jääneiden sitoutumiskohtien suojaamiseksi, millä tukahdutetaan jäljittäjän epäspesifinen sitoutuminen suoraan kantajaan. Suojaaminen inertillä proteiinilla on tavanomaista immuunimäärityksissä.

Tähän jälkeen lisätään liuos, jonka oletetaan sisältävän antigeeniä, ja aikaan saadaan olosuhteet, jotka johtavat antigeenin 8 96801 sitoutumiseen vasta-aineeseen. (Tässä kuvauksessa vasta-aineeseen sitoutunutta antigeeniä nimitetään seuraavassa sitoutuneeksi -fraktioksi.) Sitten lisätään jäljittäjää, jonka käsittämä toinen vasta-aine on leimattu siihen kovalenttisesti kon-juqoidulla suoliston AP-emtsyymi11ä. Sen jälkeen, kun toinen vasta-aine on sitoutunut antigeeniin, kiinteä kantaja, johon on kiinnittynyt vasta-aineesta, antigeenistä ja leimatusta vasta-aineesta muodostunut sitoutunut -fraktio, saatetaan kosketukseen keksinnön mukaisen koostumuksen kanssa. Koostumuksessa läsnäoleva substraatti de-fos-foryloituu kiinteän kantajan pinnalle sitoutuneen jäljittäjän AP—komponentin vaikutuksesta, jolloin muodostuu väriä. Väri osoittaa antigeenin läsnäolon ja värin voimakkuus on suoraan verrannollinen antigeenin pitoisuuteen nesteessä.

Keksinnön mukaisessa, tyypillisessä kilpailuun perustuvassa määrityksessä rajoitettu määrä kiinteän kantajan päällä olevaa vasta-ainetta voidaan saattaa kosketukseen sellaisen nesteen kanssa, jonka nesteen oletetaan sisältävän antigeeniä, ja jonka sisältämä jäljittäjä käsittää tunnetun määrän antigeeniä sekä siihen konjugoitua suoliston AP-entsyymiä. Antigeeni ja ent-syymillä leimattu antigeeni sitoutuvat kantajan päällä olevaan vasta-aineeseen tavalla, joka on suoraan verrannollinen niiden pitoisuuteen liuoksessa. Näin ollen sitoutumisen jälkeen kantaja sisältää vasta-aineesta ja antigeenistä muodostuneen sitoutuneen -fraktion sekä vasta-aineesta ja AP-entsyymi 11 ä lei — ; (Hatusta antigeenistä muodostuneen sitoutuneen -fraktion. Sen jälkeen, kun kantaja on erotettu määrityksen -f 1 ui di f aasi at a, kantajan pinnalla olevat sitoutuneet fraktiot voidaan saattaa kosketukseen AP-substraatin kanssa värin muodostamiseksi. Tässä keksinnön mukaisessa, kilpailuun perustuvassa määrityksessä värin muodostuminen on kuitenkin kääntäen verrannol1inen antigeenin pitoisuuteen nesteessä.

Keksinnön mukaisessa edullisessa määrityksessä näytettä, jonka epäillään sisältävän virusantigeeni a, inkuboidaan suoraan kiinteän kantajan kanssa, eli siinä ei käytetä sieppaavaa vasta-ainetta. Ollaan todettu, että virusantigeenejä voidaan absor— li 9 96801 boida suoraan kiinteään kantajaan ja määrittää tämän jälkeen käyttäen suoliston AP:tä leimana ja levamisolia inhiboimaan muualta kuin suolistosta peräisin oleva AP- Keksinnön tässä suoritusmuodossa kiinteä kantaja* jonka pinnalle on absorboitunut antigeeniä, voidaan suojata inertillä proteiinilla, kuten edellä esitetään, tai kantaja voidaan suojata etukäteen inertillä proteiini11 a, minkä jälkeen antigeeni absorboidaan suoraan edeltäkäsin suojatulle kantajan pinnalle.

Keksinnön mukainen koostumus voidaan sisällyttää osaksi materiasi i pakkausta, jolla voidaan toteuttaa analyytin immuunimää— ritys. Tämä reagenssipakkaus voi sisältää kiinteän kantajan, jonka pinnalle on valinnaisesti voitu immobi1isoida sieppaava anti analyytti, suoliston AP-entsyymiä käsittävän jäljittäjän analyyttia varten sekä keksinnön mukaista koostumusta. Reagenssi pakkauksen käsittämä koostumus voi sisältää levamisolia, keksinnön mukaista puskuria, AP:n substraattia ja se voi sisältää valinnaisesti magnesiumklori di a. Reagenssipakkaus voi käsittää lisäksi astioita määritysreagensseja varten sekä muita tarvikkeita, kuten näytepul1 oja, tippapulloja ja muita vastaa— ;· via, joita voidaan käyttää keksinnön mukaista koostumusta hy väksikäyttävän määrityksen toteuttamiseen.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on kuvata edelleen keksintöä sitä kuitenkaan millään tavalla rajoittamatta.

Esimerkki I

Levami5olin stabiilisuus eri puskureissa Tässä esimerkissä valmistettiin erilaisia puskureita, joiden pitoisuus oli lOO mM, jotka sisälsivät 1 mM magnesiumklori di a, ja joiden pH oli asetettu arvoon 9,8. Nämä puskurit autokla— ; voitiin, niihin lisättiin levamisolia pitoisuudeksi 1 mM ja

ne laitettiin 45 *C:n lämpötilaan (nopeutetun hajoamisen koe). Tämän jälkeen määritettiin toiminnallisen levamisolin määrä vertaamalla naudan maksan ai kali sen -f os-f ataasin aktiivisuutta levamisolin (pitoisuutena 0,05 M) läsnäollessa ja puuttuessa: puskuroidusta näytteestä tehtiin 1-20—kertäinen laimennos 1 M

,ο 96801 dietanoliamiini in, pH 9,8, joka sisälsi 5 mM g-nitrofenyyl i-fosfaattia. Naudan maksan APstä lisättiin ja reaktiokinetiikkaa seurattiin aallonpituudella 405 nm. Fosfataasiin vaikuttavan levamisolin inhibitiovakio (Ki) määritettiin ajanhetkellä "t=0" käyttäen yhtälöä:

Alkuperäinen levamisoli x 7. aktiivisuus

Ki ------------------------------------------ 100 - 7. aktiivisuus

Sitten toiminnallisen levamisolin määrä laskettiin edellä esitetystä yhtälöstä, joka oli muutettu muotoon:

Ki x (lOO — V. aktiivisuus)

Levamisolin pitoisuus = ---------------------------- 7. aktiivisuus

Taulukossa I on esitetty prosentteina kokeen aikana eri hetkillä jäljellä oleva 1evamisoiimäärä.

Taulukko I

Jäljellä oleva toiminnallinen levamisoli, 7. Puskuri 0- vrk, 5. vrk. 9. vrk. 17, vr k : AMP 100 117,92 106,99 87,07 AMPD lOO 109,86 90,20 71,74 trietanoiiamiini 100 94,36 66,56 37,62 karbonaatti 100 63,83 32,06 13,65 dietanoliamiini 100 79,78 9,12 0,31 glysiini 100 0,08 0,02 0,00

Todetaan, että levamisolin stabiilisuus on olennaisesti suurempi AMPD:ssä ja erityisesti AMP:ssä kuin muissa puskureissa.

Esimerkki II

Levamisolin g-bromianalogin nopeutettu stabii1isuustutkimus toteutettiin esimerkissä I kuvatulla tavalla. Koska tämä yhdiste on noin 10 kertaa voimakkaampaa kuin levamisoli, niin siitä tehtiin sopivat laimennokset siten, että saatiin erilaisia puskuroituja, 0,1 mM g-bromi1evamisolia sisältäviä varasto-liuoksia. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa II.

Il

Taulukko II

11 96801 Jäljellä oleva toiminnallinen levamisoli, % Puskuri O. vrk. 5. vrk. 9. vrk. 17. vrk AMPD 100 73,95 37,26 18,46 AMP 100 55,43 23,87 9,60 trietanoliamiini 100 58,95 22,09 7,86 karbonaatti 100 44,39 10,83 2,62 dietanoliamiini 100 33,57 1,30 0,53 glysiini 100 0,29 0,25 0,00

Todetaan, että levamisoli n g.-bromi anal ogi n hajoaminen on melkoisesta nopeampaa kuin emäyhdisteen hajoaminen, kun taas puskureiden edul1isuusjärjestys pysyy olennaisesti muuttumattomana.

Esimerkki III

Hengityselinten solusitkosviruksen (RSV) määrittäminen

Ensin koottiin kaivosuodatuskerroste, jonka rakenne oli seu— raava:

Ylin kerros: 3 mikronin Immunodyne-immuunia-f-finiteetti — kalvo (Pall, East Hills, New York, no. BIA0030HC5). Pinnoitettu edeltäkäsin upottamalla -fosfaatilla puskuroituun ja 0,3 % kaseiinia sisältävään suolaliuokseen 30 minuutiksi ympäristön lämpötilassa.

Seuraava kerros: raionia oleva huovikekerros (Schleicher ja

Schuell, Keene, New Hampshire; no. 5—S).

Alin kerros: kaksi imukykyistä sei1uioosatyynyä (Filtra tion Sciences, Mount Holly Springs, Pennsylvania; no. ED 320-200).

Kaivokerrokset suljettiin muovipidikkeen sisään, joka pidike käsittää ylimmän kerroksen yläpuolelle muodostetun vastaanotto-syvennöksen. Tähän syvennökseen sijoitettiin virtausta rajoittava upoke, jossa oleva aukko oli kapeampi kuin vastaanotto- 12 96801 syvennös, ja joka sijaitsee ylitä kalvoa vasten, sen kanssa samassa tasossa.

Anti geeni näyte valmistettiin hengityselinten soiusitkosviruk-sella (RSV; Long—kanta) i nf ektoi dui sta HEp—2—soi ui sta, joiden 1 aimentamiseen käytetty puskuri sisälsi: 250 mM tri s(hydroksi-metyyl i ) ami nometaani-hydrokl ori di a (Tris-HCl), 150 mli natrium-kloridia (NaCl), 10 mM ety1eenidi amiinitetra-asetaattia (EDTA), 4 7. (v/v) pol yöksi etyl eeni sorbi taani -monol auraatti a (Tween 20), 1 7. n-asetyyl i kystei ini ä ja 0,2 7. natr i umatsi di a (NaNs), pH B,5. Vertailuantigeeni valmistettiin samalla tavalla käyttäen i n-f ektoi tumattomi a HEp-2—soi u ja.

150 μΐ tätä anti geeninäytettä (tai vertailua) laitettiin kuvattuun laitteeseen ja sen annettiin valua virtausta rajoittavan upokkeen läpi ja edelleen ylimmän kaivokerroksen päälle. (Kannattavien absorbenttikerrosten kapi 11 aari vaikutus vetää nesteen ylimmän kalvon läpi.) Tämän jälkeen virtausta rajoittava upoke poistettiin ja laitteeseen lisättiin 150 μΐ pesuliuosta, jonka koostumus oli 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl , 0,2 V. NaNs, pH 7,2 ·' [Tris-puskuroitu suolaliuos (TBS)l, joka sisälsi lisäksi kanii nin IgG:tä pitoisuutena 1 mg/ml.

Liuos, joka sisälsi 27 ug/ml ai kali seen fosfataasiin konjugoi— tua anti-RSV-vasta-ainetta, valmistettiin puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 200 mM natrium-fosfaattia, 17. kaseiinia, 1 mM magnesi umkl ori di a, 0,1 mM si nkki kl or idi a ja 1 mM 2-merkaptoetanolia, pH 7,5. 150 μΐϊη erä tätä seosta lisättiin laitteeseen ja sen annettiin imeytyä kaivokerrostee-seen. Lyhyen (kaksi minuuttia kestäneen) inkuboinnin jälkeen laite pestiin 300 pl:lla TBS-liuosta (joka ei sisältänyt IgG:tä).

Laitteeseen lisättiin 150 μΐ liuosta, joka sisälsi 0,33 mg/ml ni trosi ni tetratsol i umi a, 1 7. metanolia ja 0,2 7. yhdistettä NaNs. Sen jälkeen lisättiin 150 μΐ liuosta, joka sisälsi 12 mM levamisolia, 50 mM 2—amino—2—metyyli-1-propanoliasetaattia (AMP HOAc), 0,2 7. NaNs, 19 mM magnesi umkl or i di a, pH 9,8. Huo 13 96801 neen lämpötilassa viisi minuuttia kestäneen inkuboinnin jälkeen värinmuodostusreaktio pysäytettiin lisäämällä 150 μΐ liuosta, joka sisälsi 200 mM kai i um-Fos-f aatti a, 10 mM EDTA, 0,2 7. NaNs, pH 7,2.

Tuloksena saadun kalvon värin voimakkuus mitattiin heijastus-kykyyn perustuvalla densitometri11ä (Gretag, Seattle, Washington, malli 1B3). Antigeenin 1aimennossarjal1 a toteutetun kokeen tulokset on esitetty kuviossa.

Näin ollen keksinnössä saadaan aikaan puskuroitu koostumus, jossa levamisoli on stabiilia AP-aktiivisuudel1 e välttämättömässä ai kalisessa pH-arvossa siten, että keksinnössä voidaan käyttää hyväksi levamisolin kykyä inhiboida selektiivisesti muualta kuin suolistosta saatua AP-entsyymiä. Tällöin suolistosta saatua AP-entsyymiä voidaan käyttää immuunimäärityksessä, jonka herkkyys on parantunut, ja jossa voidaan käyttää etukäteen pakattua levamisolia ja AP-substraattia.

Claims (5)

96801

1. Materialförpackning för bestämning av en analyt, som är en antigen, en antikropp eller en hapten, kännetecknad av att den innefattar en antianalyt immobiliserad pä en fast bärare, vilken antianalyt reagerar immunologiskt och specifikt med nämnda analyt, en spärare innehällande intestinal alkalisk fosfatas som är konjugerad tili nämnda analyt eller antianalyt, och ett buffertmedel som innehäller ett substrat för nämnda alkaliska fosfatas, en 2,3,4,5 -tetrahydro-6-fenyl-imi-dazo[1,2-b]tiazol och en amin som är trietanolamin, 2-metyl- 2-amino-1,3-propandiol eller 2-amino-2-metyl-1-propanol.

1. Materiaalipakkaus analyytin, joka on joko antigeeni, vasta-aine tai hapteeni, määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän kantajan pinnalle immobilisoitua antianalyyttia, joka antianalyytti reagoi immunologisesti ja spesifisesti mainitun analyytin kanssa, suoliston alkalista fosfataasia, joka on konjugoitunut mainitun analyytin tai antianalyytin kanssa, sisältävää jäljittäjää, sekä puskuria, joka sisältää mainitun alkalisen fosfataasin substraattia, 2,3,4,5-tetrahydro-6- fenyyli-imidatso[1,2-b]tiatsolia sekä amiinin, joka on joko trietanoliamiini, 2-metyyli-2-amino- 1,3-propaanidioli tai 2-amino-2-metyyli-1-propanoli.

2. Materialförpackning för bestämning av en virusantigen med hjälp av alkalisk fosfatas, kännetecknad av att den inne-fattar ett pä en fast bärare immobiliserat protein som är väsentligen icke-reaktivt med nämnda virusantigen, den i det följande nämnda intestinala alkaliska fosfatasen och den i det följande nämnda antikroppen, en antikropp konjugerad tili en intestinal alkalisk fosfatas och kapabel att bindas specifikt tili nämnda virusantigen, och ett buffertmedel innehällande cirka 50 mM 2-amino-2-metyl-1-propanol, cirka 4-30 mM levamisol, cirka 1-15 mM 3-indolylfosfat och cirka 0,5-1,0 mM magnesiumklorid. 96801

2. Materiaalipakkaus, jota voidaan käyttää virusantigeenin määrittämiseksi alkalista fosfataasia hyväksikäyttäen, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän kantajan pinnalle immobilisoitua inerttiä proteiinia, joka inertti proteiini ei reagoi olennaisesti mainitun virusantigeenin, seuraavassa esitetyn suoliston alkalisen fosfataasin ja seuraavassa esi- • tetyn vasta-aineen kanssa, suoliston alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti mainittuun virusantigeeniin, sekä puskuria, joka sisältää noin 50 mM 2 - amino-2-metyyli-1-propanolia, noin 4-30 mM levamisolia, noin 1-15 mM 3-indolyylifosfaattia ja noin 0,5- 1,0 mM magnesiumkloridia.

3. Förfarande för detektering av en virusantigen, kanne-tecknat av att det innefattar följande steg: (a) en första vätska, som antages innehälla en virusantigen, bringas i kontakt med en fast bärare, varvid nämnda virusantigen fästes vid denna bärare; (b) den pä nämnda bärare befintliga antigenen bringas i kontakt med en spärare innehällande en intestinal alkalisk fosfatas, varvid nämnda antigen fästes vid späraren och bildar en bunden fraktion innehällande nämnda intestinala alkaliska fosfatas pä nämnda bärare; (c) bäraren innehällande den intestinal alkalisk fos-fatasen separeras frän nämnda första vätska; (d) nämnda bärare bringas i kontakt med en komposition innefattande levamisol, ett substrat av nämnda alkaliska fosfatas samt ett buffertmedel innehällande 2-amino-2-metyl-1-propanol, varvid den alkaliska fosfatasen pä den fasta bärarens yta omvandlar sub-stratet tili en färgad produkt; och (e) nämnda antigen pävisas genom uppkomsten av nämnda färgade produkt.

3. Menetelmä virusantigeenin ilmaisemiseksi, tunnettu siitä, että tässä menetelmässä: (a) ensimmäinen neste, jonka oletetaan sisältävän vi-rusantigeenia, saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan kanssa, jolloin mainittu virusantigeeni kiinnittyy tähän kantajaan; (b) mainitun kantajan pinnalla oleva antigeeni saatetaan kosketukseen suoliston alkalista fosfataasia sisältävän jäljittäjän kanssa, jolloin mainittu antigeeni sitoutuu jäljittäjään ja muodostaa sitoutuneen fraktion, joka sisältää mainittua suoliston alkalista fosfataasia mainitun kantajan pinnalla; «I 96801 (c) suoliston alkalista fosfataasia käsittävä kantaja erotetaan mainitusta ensimmäisestä nesteestä; (d) mainittu kantaja saatetaan kosketukseen sellaisen koostumuksen kanssa, joka käsittää levamisolia, mainitun alkalisen fosfataasin substraattia sekä 2-amino-2-metyyli-1-propanolia sisältävää puskuria, jolloin kiinteän kantajan pinnalla oleva alkalinen fosfataasi muuttaa substraatin värilliseksi tuotteeksi; ja (e) mainittu antigeeni ilmaistaan mainitun värillisen tuotteen muodostumisen perusteella.

4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att det dessutom innefattar blockering av nämnda bärare med ett inert protein, som är väsentligen inreaktivt med nämnda virusantigen, intestinala alkalina fosfatas och motkropp.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi mainittu kantaja suojataan inertillä proteiinilla, joka ei reagoi olennaisesti mainitun virusanti-geenin, suoliston alkalisen fosfataasin ja vasta-aineen kanssa.

5. Menetelmä analyytin ilmaisemiseksi, tunnettu siitä, että • (a) ensimmäinen neste, jonka oletetaan sisältävän ana- lyyttia, saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan pinnalle immobilisoidun ensimmäisen antianalyytin kanssa; (b) mainitun kantajan pinnalla mahdollisesti olevat vapaat sitoutumiskohdat suojataan inertillä prote- • iinilla, joka inertti proteiini ei reagoi olennaisesti mainitun ensimmäisen antianalyytin, toisen antianalyytin ja seuraavassa esitetyn suoliston alkalisen fosfataasin kanssa; (c) inertillä proteiinilla suojattu kantaja saatetaan kosketukseen toisen, suoliston alkaliseen fosfataa-siin konjugoidun antianalyytin kanssa, jolloin ensimmäisen ja toisen antianalyytin ja analyytin välillä tapahtuu sitoutumista, ja jolloin saatu sitoutunut fraktio käsittää mainittua suoliston alkalista fosfataasia kantajan pinnalla; (d) suoliston alkalista fosfataasia käsittävä kantaja erotetaan mainitusta ensimmäisestä nesteestä; 96801 (e) mainittu kantaja saatetaan kosketukseen sellaisen koostumuksen kanssa, joka käsittää levamisolia, mainitun alkalisen fosfataasin substraattia sekä 2-amino-2-metyyli-l-propanolia sisältävää puskuria, jolloin kiinteän kantajan pinnalla oleva alkalinen fosfataasi muuttaa substraatin värilliseksi tuotteeksi; ja (f) mainittu analyytti ilmaistaan tämän värillisen tuotteen muodostumisen perusteella, jolloin mainitut ensimmäinen ja toinen antianalyytti reagoivat immunologisesti ja spesifisesti mainitun analyytin kanssa ja ne voivat olla, tai eivät ole, keskenään samoja.

5. Förfarande för pävisning av en analyt, kännetecknat av att (a) en första vätska, som antages innehälla en analyt, bringas i kontakt med en första antianalyt immobi-liserad pä ytan av en fast bärare, (b) de pä bärarens yta eventuellt befintliga reaktiva ställena blockeras med ett inert protein, vilket inte reagerar väsentligt med nämnda första antianalyt, andra antianalyt och den i det följande be-skrivna intestinala alkaliska fosfatasen, 96801 (c) den med det inerta proteinet blockerade bäraren bringas i kontakt med en annan, till en intestinal alkalisk fosfatas konjugerad antianalyt, varvid en bindning uppstär mellan ä ena sidan den forsta och den andra antianalyten och ä andra sidan analyten, varvid den erhallna fraktionen innefattar nämnda intestinala aikaiiskä fosfatas pa bärarens yta; (d) bäraren innefattande den intestinala alkaliska fos-fatasen separeras frän nämnda forsta vätska; (e) nämnda bärare bringas i kontakt med en komposition, som innefattar levamisol, ett substrat av nämnda alkaliska fosfatas samt ett buffertmedel innehäl-lande 2-amino-2-metyl-1-propanol, varvid den alkaliska fosfatasen pä ytan av nämnda fasta bärare omvandlar substratet tili en färgad produkt; och (f) nämnda analyt pävisas genom formation av denna fär-gade produkt, varvid nämnda första och andra antianalyt reagerar immunologiskt och specifikt med nämnda analyt och kan, eller kan icke, vara sins-emellan lika. Il