DE69400022T2

DE69400022T2 - Doppeldunkelfeld-Anfärbeverfahren; Proben, erhalten durch das Verfahren und Verwendung von Enzymmarkern in Doppeldunkelfeldfärbungen.

Info

Publication number: DE69400022T2
Application number: DE1994600022
Authority: DE
Inventors: Anton E Becker; Der Loos Chris Van
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1994-02-24
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2014-02-25
Also published as: DE69400022D1; EP0670496A1; EP0670496B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Doppelanfärbung, insbesondere zum lichtmikroskopischen Analysieren eines Präparats, und Präparate, die durch dieses Verfahren hergestellt wurden. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von enzymatischen Tracern in mikroskopischen Doppel-Dunkelfeld-Verfahren.
Doppelanfärbungstechniken sind entwickelt worden, um zwei oder mehr verschiedene Komponenten, wie Antigene, gleichzeitig zu identifizieren und werden z.B. auf dem Gebiet der Zellbiologie weithin verwendet.
Es ist gezeigt worden, daß Immunoenzym-Doppelanfärbungsverfahren unter Verwendung zweier verschiedener Enzym-Tracer, einer für jede der beiden nachzuweisenden Komponenten geeignet sind, wenn beide Komponenten, in diesem Falle Antigene, in etwa der gleichen Konzentration auftreten. In diesem Fall werden die beiden einzelnen Farben an den Stellen der Kolokalisation einfach und zuverlässig unterschieden. Wenn die beiden Antigene jedoch in weit auseinanderliegenden Konzentrationen auftreten, können feine Mischfarben, die von den Präzipitaten herrühren, die durch die Enzyme erzeugt werden, leicht unbemerkt bleiben.
Doppel-Immunfluoreszenz-Verfahren können bessere Ergebnisse erbringen, weil die Verwendung von traditionellen Fluorochromen eine getrennte Identifizierung von zwei Antigenen erlaubt. Diese Veffahren leiden jedoch im allgemeinen an dem Nachteil, daß die Immunfluoreszenz nicht das vollständige mikroskopische Detail bereitstellt und die Verfahren können nicht bei allen Geweben und bei allen Arten von Fixierungsmitteln angewendet werden. Außerdem verblaßt die Fluoreszenz schnell.
Ein anderes Verfahren zur Doppel-Fluoreszenz-Anfärbung beruht auf der Kombination von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) als Reportermolekäl mit seinem Aktivitätsnachweis der Alkalischen Phosphatase (AP). Die AP- Aktivität, wenn sie mit Naphthol-AS-MX-Phosphat/Fast Red TR (N- ASMX-P/FRTR) nachgewiesen wird, erzeugt ein rotes Reaktionsprodukt, das bei Beobachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Rhodamin-Filtersatz ausgestattet ist, eine rote Fluoreszenz zeigt. Es ist jedoch offensichtlich, daß dieses Verfahren die gleichen Nachteile hat wie die Doppel-Immunfluoreszenz unter Verwendung zweier herkömmlicher Fluorochrome, sogar obwohl die rote Fluoreszenz des N-ASMX-P/FRTR- Reaktionsproduktes kaum irgendein Ausbleichen zeigt.
Bei einer alternativen Vorgehensweise zur Doppelanfärbung ist die Kombination einer immunenzymatischen Technik und der Immun-Gold/Silber-Anfärbungstechnik (immunogold/silver staining (IGSS) technique) verwendet worden, um die Unterscheidung zwischen den Grundfarben zu verbessern. Dies eröffnet die Möglichkeit, beide Reaktionsprodukte mit der Hellfeld-Mikroskopie zu beobachten oder die Silber-verstärkten Goldpartikel mit der Dunkelfeld-Epipolarisations-Mikroskopie sichtbar zu machen. Eine getrennte Beobachtung der beiden Reaktionsprodukte ist jedoch nicht möglich und eine getrennte photographische Schwarz/Weiß- Aufzeichnung kann nicht vorgenommen werden.
Es ist überraschenderweise gemäß der Erfindung festgestellt worden, daß eine Anfärbungstechnik, die ein Fluoreszenzsignal erzeugt, mit einer Anfärbungstechnik kombiniert werden kann, die ein Polarisationssignal erzeugt, um ein Doppel-Dunkelfeld-Verfahren zu bilden, bei dem die signale für die verschiedenen Komponenten sich nicht gegenseitig stören.
Dies erlaubt eine getrennte Beobachtung von zwei Antigenen mit vollem mikroskopischen Detail.
In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wird ein Verfahren zur Doppel-Dunkelfeld-Anfärbung bereitgestellt wie es in den Patentansprüchen definiert ist. Weiterhin wird ein Präparat, das durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt wird und wie es in einem Patentanspruch definiert wird ebenfalls bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Tracer- Enzyms in dem Doppel-Dunkelfeld-Verfahren dieser Erfindung und wie in einem Patentanspruch definiert bereitgestellt. Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden ebenfalls in den Patentansprüchen definiert.
So ist in Übereinstimmung mit den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung für ein Doppel-Dunkelfeld-Anfärbungsverfahren festgestellt worden, daß eine einfache und zuverlässige Anfärbungstechnik, die ein Fluoreszenzsignal erzeugt, eine enzymatische Technik ist, bei der das Enzym, das an der Erzeugung des Fluoreszenzsignals beteiligt ist, spezifisch an mindestens eine nachzuweisende erste Komponente über einen oder mehrere Antikörper gebunden ist. Es wird jedoch in Betracht gezogen, daß das Enzym auch direkt oder indirekt an andere Bindungspartner, die spezifisch für die erste Komponente sind, gebunden werden kann.
Das bevorzugte Enzym ist eine Alkalische Phosphatase (AP). In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Inhibitor der endogenen AP in die Anfärbungsreaktion aufgenommen, um das Signal/Hintergrund-Verhältnis des Präparats zu verbessern. Ein geeigneter Inhibitor ist beispielsweise Levamizol. Um einen allgemeinen unspezifischen Hintergrund zu vermeiden, wird die Sichtbarmachung der AP-Aktivität bei Raumtemperatur für weniger als fünf Minuten, vorzugsweise für zwei bis vier Minuten, durchgeführt.
Wenn ein Rhodamin-Filtersatz in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet wird, wird die Grünlicht-Anregung durch einen Graufilter (25% Transmission) verringert. Dies führt zu einer annehmbaren Abnahme der Fluoreszenzintensität, während das Ausbleichen des Fluoreszenzsignales auf ein Minimum verringert wird.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird mindestens eine zweite Komponente durch ein Polarisationssignal nachgewiesen, das durch die Bindung von ultrakleinen Goldpartikeln an diese Komponente und anschließende Sichtbarmachung des Komplexes erzeugt wird. Die Goldpartikel sind vorzugsweise direkt oder indirekt über spezifische Bindungspartner wie Antikörper an die Komponente gebunden.
Um die Sichtbarmachung der ultrakleinen Goldpartikel zu verbessern, wird eine Silberverstärkung vorzugsweise durchgeführt, nachdem das Anfärben, das das Fluoreszenzsignal erzeugt, beendet ist. Eine mögliche Störung der Anfärbungsreaktion für die mindestens eine erste Komponente durch die Silberpräzipitate wird somit ausgeschlossen.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Präparate Schnitte, wie Cryostat- oder Paraffin-Schnitte von biologischem Material. Das biologische Material umfaßt vorzugsweise zelluläre Objekte, die für mindestens zwei verschiedene Komponenten, d.h. Antigene, angefärbt sind. Der Nachweis der Komponenten in dem angefärbten Präparat kann mit mikroskopischen Standardtechniken durchgeführt werden.
Diese und andere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus dem folgenden Beispiel, den beiliegenden Patentansprüchen und den Zeichnungen ersichtlich.
FIG. 1 Ein Paraffin-Schnitt einer Koronararterie mit artheriosklerotischen Veränderungen, doppelangefärbt für glatte Muskelzellen (1A4-Antikörper) und Makrophagen (HAM56-Antikörper) gemäß dem "Protokoll d" des Beispiels.
FIG. 1A Die Adventitia enthält eine kleine Muskelarterie mit einem Anfärben der glatten Muskelzellen der Media in rot (AP- Fluoreszenzsignal) und der endothelialen Zellen und benachbarten Makrophagen in blau (IGSS-Signal).
Fig. 1B Detail der artheriosklerotischen Läsion, das ein gemischtes Muster von glatten Muskelzellen in rot und Makrophagen in blau zeigt.
FIG. 2 Detail einer sich verzweigenden Intramyocardial-Arterie und benachbarter Myocardialzellen, die ischämische Veränderungen zeigen. Doppelanfärbung eines Cryostat-Schnittes gemäß "Protokoil c" des Beispiels mit zwei Markern für endotheliale Zellen: anti-EN4 und anti-PAL-E. PAL-E in rot (AP- Fluoreszenzsignal) färbt nur einige der endothelialen Zellen der Arterie, während EN4 in blau (IGSS-Signal) die endothelialen Zellen der Arterie und der Kapillaren anfärbt.
FIG. 3 Detail des Myocardiums. Doppelanfärbung eines Paraffin- Schnittes gemäß "Protokoll a" des Beispiels mit anti- Muskelactin (HHF35-Antikörper) und anti-Kollagen Typ IV. Muskelactin in rot (AP-Fluoreszenzsignal) färbt die kontraktilen Fasern und dazwischenliegenden Scheiben. Anti- Kollagen Typ IV in blau (IGSS-Signal) färbt die Basalmembran von Myozyten und Kapillaren.
Die vorstehenden drei Figuren sind Veranschaulichungen von Immundoppelanfärbungen mit einem roten AP-Fluoreszenzsignal und einem blauen IGSS-Epipolarisationssignal. Jede horizontale Reihe zeigt die gleichen Gewebestellen mit einem Rhodamin-Filtersatz (erste Spalte), einem Epipolarisationsfilter (zweite Spalte), und Doppelexpositionen, die beide Signale zeigen (dritte Spalte).
Der Balken in Fig. 1A = 32 um (gilt für alle Figuren).
Die folgenden Antikörper und verwandten Reagenzien und die folgenden Gewebe sind nützlich, um die Erfindung auszuführen:

Antikörper und verwandte Reagenzien

Normales Ziegenserum (normal goat serum, NGS), normales Mausserum (NMS), anti-FITC-Kaninchen-Antikörper, anti-Makrophagen-Maus- Antikörper (Klon HAM56, IgM-Isotyp), anti-Actin(glatter Muskel)-Maus- Antikörper (Klon 1A4, IgG2a-Isotyp), Alkalische Phosphatase-konjugierter anti-Maus-Ziegen-Ig (GAM/AP), Alkalischer Phosphatase-konjugierter anti- Kaninchen-Ziegen-Ig (GAR/AP), biotinylierter anti-Maus-Ziegen-Ig (GAM/bio), Alkalische Phosphatase-konjugiertes Streptavidin (Strep/AP), New Fuchsin Alkalische Phosphatase-Nachweis-Kit und Glyzerin/Gelatine waren von DAKO (Glostrup, Dänemark). Maus-anti-Muskelactin (Klon HHF35, IgG1-Isotyp) war von Enzo Diagnostics (New York, USA). Anti-Endothelium Maus-Antikörper PAL-E (IgG2a-Isotyp) und EN4 (IgG1-Isotyp) waren von MonoSan (Uden, Niederlande). FITC-konjugier ter Maus-anti-Leu 3a (CD4/FITC), Maus-anti-Leu 2a (CD8) und CAS- Red-Alkalische Phosphatase-Nachweis-Kit waren von Becton & Dickenson (Mountain View, Ca, USA). Kaninchen-anti-Kollagen Typ IV war von Organon Teknika (Oss, Niederlande). Ultrakleine Gold-markierte anti- Kaninchen-Ziegen-Ig (GAR/USG), ultrakleine Gold-markierte anti-Maus- Ziegen-Ig (GAM/USG), ultrakleine Gold-markierte anti-Biotin-Ziegen- Antikörper (GABIO/USG), Kaltwasserfisch(cold water fish)-Hautgelatine und der Silberverstärkungs-Kit waren von Aurion (Wageningen, Niederlande). Alkalische Phosphatase-konjugierter anti-Maus-Ziegen-IgG2a (GAM-IgG2a/AP), biotinylierter anti-Maus-Ziegen-IgM (GAM-IgM/bio) und biotinylierter anti-Maus-Ziegen-IgG1 (GAM-IgG1/bio) waren von Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, USA). Naphthol- AS-MX-Phosphat (N-ASMX-P), Naphthol-ASBI-Phosphat (N-ASBI-P), Fast Red TR, Fast Red Violet LB, Polyvinylalkohol (MW 80.000-100.00 Heißwasser-löslich) und Levamizol waren von Sigma (St. Louis, MO, USA). New Fuchsin und Natriumnitrit waren von Merck (Darmstadt, Deutschland).

Gewebe

Hyperplastische menschliche Tonsillen (Mandeln) wurden im Rahmen der Chirurgie erhalten. Menschliches Herzgewebe und Koronararterien wurden durch Autopsie erhalten. Die Herzpräparate zeigen sowohl normale wie ischämische Gebiete. Die Koronararterien-Segmente enthielten artheriosklerotische Läsionen mit glatten Muskelzellen und Makrophagen. Normales menschliches Thymus-Gewebe wurde bei der Autopsie eines drei Monate alten Kleinkindes erhalten.
Tonsille, Thymus und Herzgewebe wurden in Isopentan, gekühlt mit flüssigem Stickstoff, schnellgefroren. Cryostat-Schnitte wurden mit einer Dicke von 5 um geschnitten, auf Organosilan-beschichtete Objektträger aufgebracht, über Nacht getrocknet, in reinem Aceton für 10 min. bei 4 ºC fixiert, in Aluminiumfolie eingepackt und bei -20 ºC gelagert. Die Koronararterien wurden routinemäßig in 4%-gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Schnitte wurden mit einer Dicke von 5 um geschnitten, auf Organosilan-beschichtete Objektträger aufgebracht und über Nacht bei 37 ºC getrocknet. Vor der Immunhistochemie wurden die Schnitte in Xylol entwachst und in Alkohol stufenweise rehydriert.
Antiseren, Antikörper-Enzym-Konjugate und Steptavidin-Reagenzien wurden in Tris/HCl (50 mM, pH 7,8)-gepufferter Salzlösung (TBS) + 1% Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt. Zwischen allen Schritten (3 x 2 min.) wurden TBS-Waschvorgänge durchgeführt, und alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Antikörper/ultrakieines Gold(Ultra Small Gold, USG)-Konjugate wurden in TBS + 0,8% BSA + 0,1% Kaltwasserfisch-Hautgelatine verdünnt. Diese Lösung wurde ebenfalls für das Waschen vor und nach der Inkubation mit dem Antikörper/USG-Konjugat (3 x 10 min.) verwendet.

BEISPIEL

Alkalische Phosphatase-Zytochemie

Bevor mit den Doppel-Anfärbungs-Experimenten begonnen wurde, wurde die optimale Verdünnung des GAM/AP-Konjugats getestet. Drei verschiedene gemeinhin angewendete AP-Sichtbarmachungs-Verfahren und drei im Handel erhältliche Kits, alle mit einem abschließenden roten Reaktionsprodukt, wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften in der Hellfeld- ,Fluoreszenz- und Epipolarisations-Mikroskopie verglichen. Kurz gesagt, es wurden Aceton-fixierte Cryostat-Schnitte der Tonsille nachfolgend mit NGS (15 min.), anti-Leu 14 (unverdünnt, 60 min.) und GAM/AP (1:10- 1:500, 30 min.) inkubiert. Eine negative Kontrolle bestand in einem Experiment mit Auslassung des primären Antikörpers. Der AP-Aktivitätsnachweis wurde mit und ohne Zugabe von 9% Polyvinylalkohol (PVA) (Speel et al.) durchgeführt.
I Fast Red TR ( 1 mg/ml) / N-ASMX-P (0,2 mg/ml), gemäß Speel et al.
II Fast Red Violet LB (0,2 mg/ml), N-ASMX-P (0,2 mg/ml), gemäß Van der Loos et al.
III New Fuchsin/N-ASBI-P, gemäß der Anleitung des DAKO- Laboratoriums.
IV CAS Red Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Becton & Dickinson).
V Fast Red Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (BioGenex).
VI New Fuchsin Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (DAKO).
Sämtliche AP-Aktivitäts-Sichtbarmachungen schlossen die Zugabe von 1 mM Levamizol ein und alle wurden bei Raumtemperatur für entweder 2-4 min. ("kurz") oder 7-10 min. ("lang") (siehe Tabelle 1) durchgeführt. Der Reaktionsprozeß wurde durch Spülen der Präparate in destilliertem Wasser beendet. Die Ergebnisse wurden mit einem Olympus BHS- Photomikroskop untersucht, das mit einer Quecksilberlampe (100 W) und einem 40 x Immersionsöl-Objektiv ausgestattet war. Es wurde sowohl ein Rhodamin-Filtersatz als auch ein Epipolarisationsfilter verwendet. Tabelle 1: Hellfeld-, Fluoreszenz- und Epipolarisations-Mikroskopie von sechs Alkalische Phosphatase-Reaktionen in rot "kurz" "lang" Hellfeld-Mikroskopie Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem Rhodamin-Filtersatz Epipolarisations-Mikroskopie
Anti-Leu 14 wurde als ein primärer Antikörper und GAM/AP zum Nachweis verwendet. - keine Anfärbung, ± schwache Anfärbung, + mäßige Anfärbung, + + starke Anfärbung, + + + + sehr starke Anfärbung.
Die Ergebnisse werden fär "kurze" (2 bis 4 min.) und "lange" (7 bis 10 min.) AP- Aktivitäts-Sichtbarmachungs-Reaktionszeiten wiedergegeben.
Die Ergebnisse der Kontrollexperimente. unter Auslassung des primären Antikörpers, werden in Klammern wiedergegeben.
I = Fast Red TR; II = Fast Red Violet LB; III = New Fuchsin; IV = CAS RED KIT (Becton & Dickinson); V = Fast Red Kit (BioGenex); VI = New Fuchsin Kit (DAKO):

Doppel-Anfärbungs-Protokolle

Vier verschiedene Doppel-Anfärbungs-Protokolle wurden verfolgt, um die Anwendbarkeit des AP/IGSS-Dunkelfeld-Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu testen. Die Schnitte wurden kurz in TBS gespült und mit NGS 10% für 15 min. bedeckt. Nach dem Entfernen (blotting off) von NGS wurde die Inkubation mit dem ersten Antikörper ohne einen TBS- Waschschritt begonnen.
Protokoll a: getestet an Paraffin-Schnitten des menschlichen Herzens:
1. Anti-Muskel-Actin (HHF35), Maus (1:20) + anti-Kollagen IV, Kaninchen (1:400) (als ein Gemisch) 60 min.
2. GAR/USG (1:50) 120 min.
3. GAM/bio (1:200) 30 min.
4. Strep/AP (1:50) 30 min.
Protokoll b: getestet an Cryostat-Schnitten des menschlichen Thymus:
1. Anti-CD8 (Leu 2a), Maus (1:20) 60 min.
2. GAM/USG (1:50) 120 min.
3. NMS (1:10) 15 min.
4. Anti-CD4/FITC (Leu 3a/FITC), Maus (1:50) 60 min.
5. Anti-FITC, Kaninchen (1:1000) 15 min.
6. GAR/AP (1:50) 30 min.
Protokoll c: getestet an Cryostat-Schnitten eines menschlichen ischämischen Herzens:
1. Anti-EN4, Maus IgG1 (1:20) + anti-PAL-E, Maus IgG2a (1:10) (als ein Gemisch) 60 min.
2. GAM/IgG/bio (1:100) + GAM-IgG2a/AP (1:50) (als ein Gemisch) 30 min.
3. GABIO/USG (1:50) 120 min.
Protokoll d: getestet an Paraffin-Schnitten einer menschlichen artherioskierotischen Koronararterie:
1. Anti-Actin (glatter Muskel) (1A4), Maus IgG2a (1:100) + anti-Macrophage (HAM56), Maus IgM (1:50) (als ein Gemisch) 60 min.
2. GAM-IgG2a/AP (1:50) + GAM-IgM/bio (1:100) (als ein Gemisch) 30 min.
3. GABIO/USG (1:50) 120 min.
Nach Durchführung aller Schritte wurde zunächst die AP-Aktivität nachgewiesen. Anschließend wurden die Schnitte gründlich unter laufendem Leitungswasser gespült (15 min.) und mit destilliertem Wasser abgewaschen (5 min.). Als nächstes wurde eine Silber-Verstärkung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Aurion) bei Raumtemperatur für 6-10 min. durchgeführt. Nach einem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Schnitte mit Glyzerin/Gelatine aufgebracht. Einige Präparate wurden mit Hämatoxylin nach der Silberverstärkung gegengefärbt. Fluoreszenz- und Epipolarisations-Signale wurden unter Verwendung von HPS (Ilford) für die Schwarz/Weiß- und Ektachrome EL-400 (Kodak) für die Farbphotographie aufgenommen. Die beiden 400 ASA-Filme wurden bei 3200 ASA exponiert, aber routinemäßig weiterbearbeitet.

Ergebnisse

Die Titration des GAM/AP-Konjugats zeigte eine schwach rote Anfärbung bei einer Verdünnung von 1:50 und einem "kurzen" AP- Aktivitätsnachweis bei Beobachtung mit einem Hellfeld-Mikroskop. Mit dem Rhodamin-Filtersatz wurde bei Grünlicht-Anregung ein intensiv rotes Fluoreszenz-Signal erhalten. Bei einer niedrigeren Verdünnung des GAM/AP-Konjugats trat bei Hellfeld-Beleuchtung eine schrittweise Zunahme des roten Präzipitats auf, aber die Intensität des Fluoreszenz- Signals nahm nicht zu. Deshalb wurde die optimale 1:50-Verdünnung für GAM/AP und GAR/AP während der ganzen Studie verwendet. Eine kurze Kern-Gegenfärbung mit Hämatoxylin die Ergebnisse der Doppel- Anfärbung nicht.
Bei der Einzel-Anfärbung unter Verwendung der sechs AP-Aktivitäts- Sichtbarmachungs-Techniken wurde ein mäßiges (Chromogene III und VI) bis starkes (Chromogen I, II, IV und V) rotes Fluoreszenz-Präzipitat erhalten (Tabelle 1). Drei von diesen (Chromogene I, II und V) zeigten ebenfalls mäßige bis hohe Signalstärken unter Epipolarisations- Beleuchtung mit Bildern, die denen von Silber-verstärkten Goldpartikeln sehr nahe kamen. Nur das rote Reaktionsprodukt, das mit dem CAS Red Kit erhalten wurde, war bei Beobachtung mit der Epipolarisations- Mikroskopie völlig dunkel. Eine "lange" AP-Aktivitäts-Reaktionszeit ergab ein stärkeres Hellfeld-Signal, aber es erschien unabhängig von dem angewendeten AP-Verfahren nicht als ein stärkeres Fluoreszenz-Signal. Präparate, die eine "lange" AP-Aktivitäts-Reaktionszeit durchmachten, zeigten im Vergleich zu "kurzen" Reaktionen eine relativ hohe unspezifische Fluoreszenz aller Gewebeelemente. Die New Fuchsin- Verfahren (Chromogene III und VI) erzeugten trotz der Tatsache, daß die Hellfeld-Mikroskopie deutliche Bilder des Präzipitats ergab, eine hohe unspezifische Hintergrund-Fluoreszenz. Die Zugabe von 9% PVA verbesserte die Schärfe der Präzipitat-Lokalisation geringfügig, aber sie beeinflußte nicht die Charakteristiken der Präzipitate in Hinsicht auf die Epipolarisations-Mikroskopie. Andererseits wurde beim Durchführen der Einzel-IGSS (sogar bis zu einem intensiven schwarzen Hellfeld-Signal) bei Grünlicht-Anregung kein Signal beobachtet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1-3 veranschaulicht, die Schwarz/Weiß- oder Farbphotographie-Aufzeichnungen der Fluoreszenz- und Epipolarisations- Mikroskopie zeigen. Doppelbelichtungen (dritte Spalte) zeigen Beispiele von getrennten und überlappenden Anfärbungsmustern. Im letzteren Falle können die Stellen der Kolokalisation leicht von den beiden Grundfarben unterschieden werden (Fig. 2). Die histologischen Ergebnisse der CD4/CD8-Doppel-Anfärbung des Thymus unter Verwendung des Protokolls b entsprachen den Erwartungen: unreffe Thymozyten in dem Cortex exprimierten doppelte positive Signale, während reife Thymozyten in der Medulla entweder einzeln CD4- oder CD-8-positiv erschienen (nicht gezeigt).

Diskussion

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Doppelanfärbung vor, das Immunfluoreszenz- und Immunenzym-Techniken vereinigt. Das Verfahren beruht auf der Kombination einer im Handel erhältlichen AP-Aktivitätsenthüllenden Technik, in der das Reaktionsprodukt eine intensive rote Fluoreszenz zeigt, aber kein Signal unter Epipolarisations-Beleuchtung, und der IGSS-Technik, die ein deutliches Signal mit der Epipoiarisation erzeugt, aber kein Signal mit dem Fluoreszenz-Filtersatz.
Bisher ist berichtet worden, daß das rote AP-Fluoreszenz-Signal auf Grünlicht-Anregung oder bei der Lagerung der Präparate nicht ausbleicht. Speel et al., die diesen Aspekt ausführlicher untersuchten, beschrieben, daß nur bei stark intensiver Grünlicht-Belichtung, länger als 40 Minuten, etwas Ausbleichen ersichtlich wurde. Unsere Beobachtungen bestätigen diese Daten. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops älteren Typs trat überhaupt kein Ausbleichen auf. Das gleiche Präparat zeigte aber bei Untersuchung mit dem Olympus BHS-Fluoreszenzsystem ein Ausbleichen nach 10 Minuten Grünlicht-Belichtung. Eine Verringerung der Grünlicht-Anregung durch einen Graufilter (25% Transmission) setzte die Fluoreszenz-Intensität um einen Faktor von etwa 2 herab und das Ausbleichen war minimal. Präparate, die abgeschirmt von direktem Licht Monate bei Raumtemperatur gelagert worden waren, zeigten noch helle Fluoreszenz- und Epipolarisationsignale.
Trotz der Tatsache, daß die AP-/Antikörper-Konjugate zwei- bis fünfmal stärker für die Fluoreszenz-Technik als für ein Hellfeld-Verfahren verdünnt worden waren, waren die Anfärbungsleistungen mindestens ähnlich oder sogar zum Vorteil der Fluoreszenz-Technik. Da winzige Mengen der AP-Aktivitäts-Reaktionsprodukt-Reihe eine intensive Fluoreszenz zeigten, wird allgemein angeraten, die AP-Aktivität bis zu dem Moment, an dem sie mit der Hellfeld-Mikroskopie schwach sichtbar wird, anzufärben. Unsere Beobachtung ist, daß ein stärkeres Hellfeld- Signal nicht ein intensiveres Fluoreszenz-Signal ergibt. Um eine allgemeine unspezifische Hintergrund-Fluoreszenz (Tabelle 1) zu vermeiden, sollte der AP-Aktivitäts-Nachweis in weniger als 5 min. abgeschlossen sein. Diese Hintergrund-Fluoreszenz wird fast sicher durch das spontane Binden von Chromogenen an Gewebekomponenten verursacht.
Die Anfärbungsleistung der IGSS-Technik ist überlegen, insbesondere wenn ultrakleine Gold-markierte Anükörper verwendet werden. Wegen der im Vergleich zur Hellfeld-Beleuchtung hohen Sensitivität der Epipolarisation wurden die ultrakleinen Goldpartikel gerade bis zu dem Moment Silber-verstärkt, an dem ein braunes Silberpräzipitat mit der Heilfeld-Mikroskopie sichtbar wurde.
Bei den Doppel-Anfärbungs-Protokollen wurde die AP-Aktivität zuerst sichtbar gemacht, wonach eine Silberverstärkung folgte. Die Reihenfolge der Sichtbarmachung macht jedoch zumindest mit den vier getesteten Antikörper-Kombinationen keinen großen Unterschied. Da die Silberverstärkung nach dem Entfernen aller Puffersalze durchgeführt werden sollte, ist es vom praktischen Gesichtspunkt aus am zweckmäßigsten, die Sichtbarmachung der AP-Aktivität zuerst durchzuführen. Ein anderer Grund, die Silberverstärkung zuletzt durchzuführen ist, daß ein Silberpräzipitat ein Antigen oder sogar einen vollständigen Antikörper-"Baum" während der Doppel-Anfärbung "verstecken/abschirmen" kann. Ein ähnliches Phänomen tritt für das Diaminobenzidinpolymer nach der Peroxidase-Reaktion auf. Bisher sind die abschirmenden Wirkungen von AP-Chromogenen nicht beschrieben worden. Abgesehen davon scheint es im großen Maße unwahrscheinlich, daß die Bildung von nur diskreten Mengen an AP-Reaktionsprodukt ein "Verstecken" des Antigens verursachen kann. Bei den Immunenzym- Doppel-Anfärbungs-Protokollen tritt die Frage auf, welches Antigen angefärbt werden soll und in welcher Farbe; für die vorliegende AP- IGSS-Dunkelfeld-Technik drängt die Wahl weniger, weil die abschließenden Reaktionsprodukte getrennt identifiziert werden. Nur wenn die genaue Lokalisation eines Antigens nötig ist, kann man das genauere IGSS-Verfahren anstelle der AP-Technik in Betracht ziehen.
Zum ersten Male seit der Beschreibung der Doppel-Immunfluoreszenz wird ein Doppelanfärbungs-Verfahren beschrieben, das die getrennte Beobachtung von zwei Antigenen erlaubt. Sein Hauptvorteil gegenüber der herkömmlichen Doppel-Fluoreszenz ist die Tatsache, daß angefärbte Präparate bei Raumtemperatur für eine beträchtliche Zeitdauer ohne ein spontanes Ausbleichen der Fluoreszenz gelagert werden können, während das Bleichen, das durch das Anregungslicht verursacht wird, minimal ist.
Das vorliegende Doppel-Dunkelfeld-Verfahren ist einfach, verwendet im Handel erhältliche Reagenzien und ist mit derzeitigen Immunenzym- Doppelanfärbungsprotokollen vereinbar.
Literatur:
Speel et al.: A novel fluorescence detection method for in situ hybridization, based on the alkaline phosphatase-Fast Red reaction. J. Histochem. Cytochem. 40: 1299, 1992.
Van der Loos et al.: Multiple immunoenzyme staining techniques. Use of fluoresceinated, biotinylated and unlabelled monoclonal antibodies. J. Imm. Meth. 117: 45, 1989.

Claims

1. Doppel-Dunkelfeld-Anfärbungsverfahren zur Analyse von Fluoreszenz- und Polarisationssignalen eines Präparats, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellen eines Präparats für die anschließende Anfärbung;

(b) Anfärben des Präparats für mindestens eine erste Komponente durch ein Anfärbungsverfahren, das das Fluoreszenzsignal erzeugt, aber im wesentlichen kein Polarisationssignal, wenn die Signale mittels eines Fluoreszenzfilter-Satzes bzw. Polarisationsfilters festgestellt werden; und

(c) Anfärben des Präparats für mindestens eine zweite Komponente durch ein Anfärbungsverfahren, das das Polarisationssignal erzeugt, aber im wesentlichen kein Fluoreszenzsignal mit dem Fluoreszenzffiter-Satz.

2. Verfahren nach Anspruch 1. wobei der Polarisationsfilter ein Epipolarisationsfilter ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Anfärbungsverfahren von Schritt (b) ein enzymatisches Verfahren ist, insbesondere ein mimunenzymatisches Verfahren, wobei das Enzym, das an dem Erzeugen des Signals beteiligt ist, an die mindestens eine erste Komponente über einen Antikörper bzw. über Antikörper gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym eine Alkalische Phosphatase (AP) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Anfärben mit AP die Zugabe eines Inhibitors der endogenen AP, z.B. Levamizol, einschließt, und die Sichtbarmachung der AP-Aktivität bei Raumtemperatur für weniger als fünf Minuten, insbesondere für zwei bis vier Minuten, durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzsignal, wenn ein Satz Rhodamin-Filter verwendet wird, eine rote Fluoreszenz nach Anregung mit grünem Licht ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Anregung unter Verwendung von grünem Licht durch einen Graufilter verringert wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anfärbungsverfahren von Schritt (c) das Binden von ultra-kleinen Goidpartikeln an die mindestens ein zweite Komponente unfaßt, insbesondere über einen Antikörper bzw. über Antikörper; vorangehend, gleichzeitig oder anschließend an Schritt (b).

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die ultra-kleinen Goldpartikel Silber-verstärkt sind, insbesondere bis ein Silberpräzipitat sichtbar wird unter Kontrolle mit Hellfeld-Mikroskopie.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die in Schritt (c) inbegriffene Silberverstärkung durchgeführt wird nachdem das Anfärben gemäß Schritt (b) beendet ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Präparate Schnitte sind, z.B. Cryostat- oder Paraffinschnitte, von bioiogischem Material, das insbesondere zelluläre Objekte umfaßt.

12. Präparat, wie es durch das Verfahren nach Ansprüchen 1 - 11 erhältlich ist, zur Verwendung in lichtmikroskopischen Analysen und in Quantifizierungsverfahren.

13. Verwendung eines Tracer-Enzyms, insbesondere von Alkalischer Phosphatase, in einem mikroskopischen Doppel-Dunkelfeld-Verfahren gemäß Ansprüchen 1 - 11.