CN112748243A - 一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括检测卡，稀释处理液和信息卡，其中检测卡包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及任选地吸水垫，并且在硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线，所述结合垫上涂覆有量子点荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1中和抗体和量子点荧光微球标记的人源ACE2，所述检测线上包被有S1抗原，所述质控线上含有抗鼠IgG抗体。本发明提供的试剂盒及其制备方法可精准检测样本中是否存在新型冠状病毒中和抗体，实现现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测试 剂盒及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒发病后症状与感冒类似难分辨，而重症又可致命，风险人 群基数大等这些因素，都是快速控制疫情的难题。目前我国多家企业和机构 都在积极进行着疫苗的研发，并取得了重大突破。因此对于疫苗研发过程中 接种人群是否产生特异性保护性抗体(中和抗体)以及上市后普通大众接种 疫苗后是否产生特异性的中和抗体的检测需求，日益递增。因此，急需更为 简便、快速且可广泛应用的检测产品。
迄今为止，已有两种结构蛋白被用作血清学测定的靶标。一种是丰富的 核蛋白(N蛋白)，可在病毒内部或感染的细胞内发现。但是，由于N蛋白的 生物学功能以及被病毒或细胞膜与抗体隔离的事实，N蛋白抗体不可能直接中 和SARS-CoV-2。通常用作表征SARS-CoV-2免疫应答的靶标的第二种结构蛋白 是刺突蛋白(S蛋白)。刺突是包含受体结合结构域(RBD)的大型三聚体糖 蛋白，病毒利用该结构域将其对接至其细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2) 并用于病毒膜和细胞膜的融合(1)。从其他冠状病毒以及SARS-CoV-2已知， 刺突蛋白是主要的，并且可能是唯一的中和抗体的靶标。国际上已有研究表 明新冠病毒与血管紧张素酶-2(ACE2)的结合是主要依靠S蛋白中的一个功能 亚基S1蛋白上的结构域(RBD)识别的(2)。同时我国科学家也发现S1蛋白上 另一个结构域也承担着重要的中和抗体识别位点NTD结构域，并发表于美国顶 级杂志SICENCE上，表明了中和抗体并不是仅仅是靠阻断ACE2的通路行驶作 用。综上，S1蛋白可能存在多种中和抗体识别位点，中和抗体会靶向S1中特 异位点相互作用，进而使S蛋白与受体相互作用失效。
因荧光免疫层析法检测试剂属于POCT(point-of-care testing，即时检 测或床旁检测)类检测产品，因具有检测方便、快捷、综合成本低等特点， 在临床上得到广泛应用，其检测时间通常为15-20分钟。但现有中和抗体检测 试剂盒主要采用酶联免疫方法，只是利用S蛋白或RBD结构域与ACE2结合的原 理检测，具有检测时间长，准确性低、检测结果不可追溯等缺点，不利于对 患者信息的追溯及整体判断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备 方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
(技术方案)
为实现上述目的，本发明首先供了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂 盒，包括检测卡，所述检测卡包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及任选 地吸水垫。
作为对本发明技术方案的进一步改进，还包括稀释处理液和信息卡。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述硝酸纤维素膜上含有检测线和 质控线。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述检测线为冠状病毒抗原，且质 控线为IgG抗体。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述冠状病毒抗原为冠状病毒S蛋 白抗原，所述IgG抗体为鼠IgG抗体、兔IgG抗体、羊IgG抗体中的任意一 种。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述结合垫上涂覆有量子点荧光微 球标记的冠状病毒抗体和量子点荧光微球标记的人血管紧张素转化酶2，且人 血管紧张素转化酶2和冠状病毒抗体均与示踪物质结合。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述示踪物质为荧光物质、量子点、 地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微 球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金、酶中 的任一种。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述冠状病毒抗体为抗新型冠状病 毒S1中和抗体。
作为对本发明技术方案的进一步改进，所述示踪物质为荧光量子点颗粒， 且荧光量子点颗粒表面修饰有一种或多种功能基团。
本发明还提供了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒制备方法，具体 步骤如下：S1：量子点的标记：取7.5μL量子点荧光微球加入1mL Hepes溶 液中,Hepes溶液pH调为7.4±0.1,分别加入活化剂A、B各20μL,充分混匀震 荡，室温避光反应放置30min后取出，加入10μg和小鼠抗新型冠状病毒S 中和抗体10μg,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入 封闭液A 50μL、封闭液B 200μL,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min,取出放入离心机，转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入 300μL重悬液混匀,放置2-8℃过夜作为标记物1；取7.5μL量子点荧光微球加 入1mL Hepes溶液中，Hepes溶液pH调为7.4±0.1，分别加入活化剂A、B 各20μL，充分混匀震荡，室温避光反应放置30min后取出，加入人源ACE2 10 μg，充分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入封闭液A 50μL、 封闭液B 200μL，充分混匀震荡，室温避光反应放置90min，取出放入离心机， 转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入300μL重悬液混匀， 放置2-8℃过夜作为标记物2；
S2：结合垫的制备：将制备好的荧光标记物1和2等体积混合为600μL喷 涂于玻纤垫上，将制备好的荧光垫置于湿度＜30％的环境中干燥4-6个小时；
S3：包被膜的制备：将新型冠状病毒抗原S1蛋白用包被缓冲液稀释至1mg/mL，作为T线包被液，将抗鼠IgG抗体用包被液稀释至0.25mg/mL，作为 C线包被液；将C线、T线包被液用喷金划膜仪分别在贴有PVC板的硝酸纤维 素膜上进行包被操作，包被完毕后，将反应膜在湿度＜30％的环境中干燥12-24 个小时；
S4：纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸， 其中样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
(有益效果)
本发明以量子点微球作为载体，标记S1蛋白中和抗体和ACE2，采用与待 检样本中中和抗体同时竞争S1蛋白的竞争法原理检测，解决了现有新型冠状 病毒中和抗体检测灵敏度、特异度差的问题，为新型冠状病毒检测提供一种 高灵敏、高特异度、高稳定性的检测产品，实现检测结果可追溯，同时利用 高通量及便携式两大设备，10分钟内完成新冠病毒中和抗体检测，满足不同 级别医院对新型冠状病毒的灵敏、快速和高通量检测需求
具体实施方式
下面将对本发明施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)量子点的标记：取7.5μL量子点荧光微球加入1mL Hepes溶液 中,Hepes溶液pH调为7.4±0.1,分别加入活化剂A、B各20μL,充分混匀震荡， 室温避光反应放置30min后取出，加入10μg和小鼠抗新型冠状病毒S中和 抗体10μg,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入封闭 液A 50μL、封闭液B 200μL,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min,取出放 入离心机，转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入300μL重 悬液混匀,放置2-8℃过夜作为标记物1；取7.5μL量子点荧光微球加入1mL Hepes溶液中，Hepes溶液pH调为7.4±0.1，分别加入活化剂A、B各20μL， 充分混匀震荡，室温避光反应放置30min后取出，加入人源ACE2 10μg，充 分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入封闭液A 50μL、封 闭液B 200μL，充分混匀震荡，室温避光反应放置90min，取出放入离心机， 转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入300μL重悬液混匀， 放置2-8℃过夜作为标记物2；
(2)结合垫的制备：将制备好的荧光标记物1和2等体积混合为600μL 喷涂于玻纤垫(300mm×7mm)上(600μL液体恰好使该玻纤垫饱和)，将制备 好的荧光垫置于湿度＜30％的环境中干燥4-6个小时；
(3)包被膜的制备：将新型冠状病毒抗原S1蛋白用包被缓冲液稀释至 1mg/mL，作为T线包被液，将抗鼠IgG抗体用包被液稀释至0.25mg/mL，作为 C线包被液；将C线、T线包被液用喷金划膜仪分别在贴有PVC板的硝酸纤维 素膜上进行包被操作，包被完毕后，将反应膜在湿度＜30％的环境中干燥12-24 个小时；
(4)将抗红细胞抗体用包被缓冲液(0.05M PBS，pH7.4)稀释到0.8mg/mL， 作为样品垫的包被液，在喷金划膜仪上进行喷涂操作，喷液参数设置为 10μL/cm，速度设置为100mm/秒，包被完毕后，将样品垫在湿度＜30％的环境 中干燥12-24个小时；
(5)纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸， 其中样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
最后配上稀释处理液和信息卡，其中稀释处理液分装量为5mL(规格为 20人份/盒)、1mL(规格为5人份/盒)、7mL(规格为50人份/盒)，其中 信息卡写明加样方式：20μL血清/血浆样本或者30μL全血样本+100μL稀释处 理液上样；检测时反应时间：10分钟。
对比例1
与实施例1区别仅在于结合垫上为仅由ACE2标记的量子点组成。
对比例2
与实施例1区别仅在于结合垫上为仅由新型冠状病毒S1中和抗体1标记 的量子点组成。
对比例3
与实施例1区别仅在于结合垫上为仅由新型冠状病毒S1中和抗体2标记 的量子点组成。
对比例4
与实施例1区别仅在于结合垫上为仅由新型冠状病毒S1中和抗体3标记 的量子点组成。
试验
将实施例1与对比例2-4平行对比测试不同的人血清基质的中和抗体校 准物。
加样方式：20μL血清/血浆样本或者30μL全血样本+100μL稀释处理液上 样；检测时反应时间：10分钟。仪器：量子点荧光免疫分析仪；厂家：南京 美宁康诚生物科技有限公司。人源中和抗体IgA,IgG,IgM：武汉伊莱瑞特生物 科技股份有限公司，人源S1 NTD中和抗体(LT2000)：Leinco Technologies, Inc。
检测结果如下：
结合上述表中数据可知，本发明试剂盒中使用不同类型的标记物，增加 了待测样品灵敏度和准确性，使得本发明制备得到的试剂盒质量更高。
本发明的试剂盒，具有灵活便捷、快速的特点，不受操作地点的限制， 人员要求低，更适用于大范围区域性的人群中和抗体水平监控研究，此外， 本发明提供的试剂盒，只需少量样本，10min内即可显示结果，配套仪器轻便 便捷，可手持式，数据无需人工录入，数据处理分析更便捷。
最后附上实施例中所需主要溶液的配方表如下：
标记缓冲液：Hepes标记缓冲液
| 试剂 | 用量(1000mL) |
| Hepes | 2.38g |
| 纯化水 | 1000mL |
| Tween 20 | 5mL |
活化剂A：
| 物料名称 | 终浓度 | 1mL理论用量 |
| NHS | 30mg/mL | 30mg |
| 标记缓冲液 | -- | 1mL |
活化剂B：
| 物料名称 | 终浓度 | 1mL理论用量 |
| EDC | 10mg/mL | 10mg |
| 标记缓冲液 | -- | 1mL |
封闭液A：
| 物料名称 | 终浓度 | 理论用量 |
| 甘氨酸 | 10mg/mL | 10mg |
| 标记缓冲液 | -- | 1mL |
封闭液B：
重悬液：
| 物料名称 | 配方(升) |
| 标记缓冲液 | 955mL |
| BSA | 30g |
| Casein-Na | 10g |
| 蔗糖 | 100g |
| 甘氨酸 | 5g |
| Tween-20 | 45mL |
| 苋菜红 | 0.02g |
| Proclin300 | 1mL |
包被液缓冲液配制：
| 试剂 | 用量(1000mL) |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O | 14.5g |
| NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 1.48g |
| NaCl | 9g |
| 纯化水 | 1000mL |
稀释处理液：
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限 制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的 技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或 者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的 任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：包括检测卡，所述检测卡包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及任选地吸水垫。
2.根据权利要求1所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释处理液和信息卡。
3.根据权利要求1所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线。
4.根据权利要求3所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述检测线为冠状病毒抗原，且质控线为IgG抗体。
5.根据权利要求4所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述冠状病毒抗原为冠状病毒S蛋白抗原，所述IgG抗体为鼠IgG抗体、兔IgG抗体、羊IgG抗体中的任意一种。
6.根据权利要求1-5中任意一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述结合垫上涂覆有量子点荧光微球标记的冠状病毒抗体和量子点荧光微球标记的人血管紧张素转化酶2，且人血管紧张素转化酶2和冠状病毒抗体均与示踪物质结合。
7.根据权利要求6所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述示踪物质为荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金、酶中的任一种。
8.根据权利要求6所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述冠状病毒抗体为抗新型冠状病毒S1中和抗体。
9.根据权利要求7所述一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述示踪物质为荧光量子点颗粒，且荧光量子点颗粒表面修饰有一种或多种功能基团。
10.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：量子点的标记：取7.5μL量子点荧光微球加入1mL Hepes溶液中,Hepes溶液pH调为7.4±0.1,分别加入活化剂A、B各20μL,充分混匀震荡，室温避光反应放置30min后取出，加入10μg和小鼠抗新型冠状病毒S中和抗体10μg,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入封闭液A 50μL、封闭液B 200μL,充分混匀震荡，室温避光反应放置90min,取出放入离心机，转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入300μL重悬液混匀,放置2-8℃过夜作为标记物1；取7.5μL量子点荧光微球加入1mL Hepes溶液中，Hepes溶液pH调为7.4±0.1，分别加入活化剂A、B各20μL，充分混匀震荡，室温避光反应放置30min后取出，加入人源ACE2 10μg，充分混匀震荡，室温避光反应放置90min后取出，分别加入封闭液A 50μL、封闭液B 200μL，充分混匀震荡，室温避光反应放置90min，取出放入离心机，转速8000r/min，离心30分钟，完全弃上清溶液，加入300μL重悬液混匀，放置2-8℃过夜作为标记物2；
S2：结合垫的制备：将制备好的荧光标记物1和2等体积混合为600μL喷涂于玻纤垫上，将制备好的荧光垫置于湿度＜30％的环境中干燥4-6个小时；
S3：包被膜的制备：将新型冠状病毒抗原S1蛋白用包被缓冲液稀释至1mg/mL，作为T线包被液，将抗鼠IgG抗体用包被液稀释至0.25mg/mL，作为C线包被液；将C线、T线包被液用喷金划膜仪分别在贴有PVC板的硝酸纤维素膜上进行包被操作，包被完毕后，将反应膜在湿度＜30％的环境中干燥12-24个小时；
S4：纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，其中样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210504 |
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