CN113295863A - 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺 - Google Patents

新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN113295863A
CN113295863A CN202110570914.1A CN202110570914A CN113295863A CN 113295863 A CN113295863 A CN 113295863A CN 202110570914 A CN202110570914 A CN 202110570914A CN 113295863 A CN113295863 A CN 113295863A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
gold
neutralizing antibody
drying
colloidal gold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110570914.1A
Other languages
English (en)
Inventor
刘琴
雷瑞斌
刘清竹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Yinuo Weisheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Yinuo Weisheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Yinuo Weisheng Biotechnology Co ltd filed Critical Jiangsu Yinuo Weisheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110570914.1A priority Critical patent/CN113295863A/zh
Publication of CN113295863A publication Critical patent/CN113295863A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，依次包括如下步骤：制金、标记、喷金、划线、贴板及切条、检测卡组装、检验、成品组装等工序。本发明对生产全过程的溶液配制、物料及物耗等工艺参数进行精确把控，极大提高了新冠病毒(SARS‑CoV‑2)感染者、恢复患者和疫苗接种者血清、血浆、全血样本中和抗体水平的检测精度。

Description

新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺。
背景技术：
随着全球多款新冠疫苗获得批准以及疫苗接种逐步普及，疫苗接种后保护性有多好、保护期有多久等问题仍未有定论，因此疫苗效果评价成为关注热点。中和抗体是由病毒最外层的包膜或衣壳抗原刺激机体产生的一类能与病毒结合并使之丧失感染力的抗体。病毒侵入人体后，体内浆细胞会产生病毒特异性抗体，其中只有一部分是中和抗体。中和抗体作为有抗病毒活性的抗体，仅占抗病毒抗体中的少部分，中和抗体可以识别病毒表面蛋白，阻断病毒与细胞表面的特异性受体结合，进而防止病毒继续侵入人体细胞，接种疫苗后人体免疫系统将产生针对病原体的中和抗体以保护人体免受感染，因此中和抗体的检测对于评价疫苗接种后人体免疫应答水平等起到非常重要的作用。
目前传统的中和抗体检测一般繁琐复杂，业界公认的检测方法是利用活病毒进行被感染细胞的蚀斑减少计数来判断中和抗体的水平，但由于必须使用活病毒，实验室的生物安全等级要达到P3以上，试验程序复杂，对操作人员要求高，且检测通量低耗时3天或更长，这些因素导致其检测成本非常高，完全无法做大规模推广。替代活病毒的假病毒检测方法虽然在复杂性上有所改进，但仍然需要使用活细胞，仍不能达到工业化程度。因此开发简便容易操作的中和抗体检测试剂盒将大有所为，可广泛用于接种疫苗人群的中和抗体评估。新冠中和抗体检测试剂盒(胶体金法)检测试剂盒具有操作简单，无需使用活病毒，以RBD-ACE2作用机制为原理进行开发设计，无需使用活病毒，在一般的实验室即可完成检测，检测成本低，易于大规模推广使用，可用于疫苗有效性及保护期限评估，未来将为疫苗的免疫效果评价提供有力支撑。
发明内容：
本发明的目的是针对现有中和抗体检测技术的缺陷，提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺及检测方法，该试剂盒基于胶体金免疫层析平台，采用竞争法的反应原理进行设计开发，对生产全过程的工艺技术、质量控制、关键工序、特殊过程等内容严格把控，保证试剂盒的检测精度和灵敏度。
本发明是通过如下技术方案实现的：
S1，制金
采用柠檬酸三钠溶液及氯金酸溶液按1:1的比例烧制胶体金溶液；
S2，标记
采用S1制备好的胶体金溶液、按照配方量加入0.2M碳酸钾溶液进行pH调节、依次加入新型冠状病毒RBD蛋白Ag28进行标记离心，然后使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液将沉淀物按照50倍浓缩复溶后保存待用；
采用S1制备好的胶体金溶液、按照配方量加入0.2M碳酸钾溶液进行pH调节、依次加入鸡IgY进行标记离心，然后使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液将沉淀物按照50倍浓缩复溶后保存待用；
S3，喷金
将新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液及鸡IgY胶体金标记复合物溶液按10:1混合，在玻纤金标结合垫上喷金，喷金结束后进行干燥处理；
S4，划线
将新型冠状病毒中和抗体T线划线蛋白ACE2-PS-Ag2用划线工作液稀释成2.0mg/mL，振荡混匀后待用；将C线划线蛋白山羊抗鸡IgY用划线工作液稀释成1.0mg/mL，振荡混匀后待用；在PVC板表面贴合NC膜和吸水纸，随后使用三维金标划线仪在相应的管路中吸取上述配置好的C、T线划线液进行划线，划线后进行干燥处理；
S5，贴板及切条
将样品垫、全血过滤垫、喷金干燥后的玻纤金标结合垫、与S4中划线干燥后的NC膜按照顺序依次叠压，贴板后进行切条，得到新冠中和抗体试剂卡条；
S6，检测卡组装
将S5得到的试剂卡条置于卡壳内压装成检测卡，连同干燥剂一同装入铝箔袋封口后成为新冠中和抗体半成品试剂卡；
S7，成品组装
将检测卡、说明书、加样吸管及样品稀释液装入包装盒中，检测合格后入库。
在本发明一较佳实施例中，步骤S1中，
柠檬酸三钠溶液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的离心管中加入工艺用水，按照标准配方准确称取柠檬酸三钠二水倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容并充分混匀，使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中；
氯金酸溶液的制备工艺如下：
取一支四氯金酸，加入适量工艺用水溶解，再反复冲洗将洗液倒入烧杯，直至冲洗液无色后再反复冲洗，倒入洗净并烘干容量瓶中，加入工艺用水定容，使用0.22μm的滤膜过滤；
胶体金溶液的具体制备工艺如下：
用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水倒入洗净并烘干的烧杯中，将烧杯置于电热炉上，加热至烧杯底部有较大气泡产生还未烧开时，一次性倒入定量准备好的1％的氯金酸溶液；加大功率继续加热至沸腾，一次性倒入准备好的1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变黑后开始计时，保持沸腾15分钟；然后停止加热，置于室温冷却；待溶液冷却至室温后，用工艺用水定容，倒入洗净并烘干的锥形瓶中，充分混匀。
在本发明一较佳实施例中，步骤S2中，0.2M碳酸钾溶液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的离心管中加入工艺用水，按照标准配方准确称取碳酸钾倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容并充分混匀，使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中；
新型冠状病毒中和抗体金标重悬液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的烧杯中加入定量工艺用水，按照标准配方的顺序先后加入Tris、氢氧化钠、酪蛋白、PEG20000、PVP K30、柠檬酸、蔗糖、海藻糖、吐温20、Proclin300，并搅拌至完全溶解；溶解后倒入洗净并烘干的容量瓶，用工艺用水定容并充分混匀；
新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液的具体制备工艺如下：
(1)量取配方量3倍胶体金溶液于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀；
(2)调pH：准确量取定量0.2M碳酸钾溶液，在磁力搅拌下逐滴的加入定量的0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
(3)标记：准确量取新型冠状病毒RBD蛋白Ag28，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)的溶液中，磁力搅拌10分钟；
(4)封闭：取定量10％牛血清白蛋白溶液，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(3)的溶液中，磁力搅拌30分钟；
(5)离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
(6)复溶：使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物，混匀配制成新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液；
鸡IgY胶体金标记复合物溶液的具体制备工艺如下：
(1)量取配方量3倍胶体金溶液于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀；
(2)调pH：准确量取定量0.2M碳酸钾溶液，在磁力搅拌下逐滴的加入定量0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
(3)标记：准确量取鸡IgY标记蛋白，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)的溶液中，磁力搅拌10分钟；
(4)封闭：取定量10％牛血清白蛋白溶液，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(3)的溶液中，磁力搅拌30分钟；
(5)离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
(6)复溶：使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物，混匀配制成鸡IgY胶体金标记复合物溶液。
在本发明一较佳实施例中，步骤S3中，喷金工艺具体包括如下步骤：
(1)标记复合物混合：将新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液及鸡IgY胶体金标记复合物溶液按10:1混合，混匀时间在半小时以上；
(2)喷金：进入喷金划线仪程序界面，设置参数；用工艺用水对管路进行多次清洗，用喷金管路的首尾端放置标记复合物中润洗多次，然后排液使标记复合物充满管路待喷金；将玻纤金标结合垫放置于喷金划线仪的台面上，开始喷金；
(3)干燥：喷金后的金标垫放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间干燥过夜。
在本发明一较佳实施例中，玻纤金标结合垫的制作工艺如下：
(1)涂抹：使用铺膜装置进行喷涂，使玻纤处理液均匀涂满整张玻纤；
(2)干燥：温度34±3℃，湿度≤40％，干燥过夜烘干，烘干后密封干燥储存；
(3)耗材准备及切条处理：使用前需将处理好的玻纤干燥过夜，将处理后的玻纤切条，作为玻纤金标结合垫备用；
所述玻纤处理液的制备工艺如下：
先用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方的顺序先后加入Tris、Casein-Na、柠檬酸三钠、PVP-10、S-17、蔗糖、Tween-20、TritonX-100，并搅拌至完全溶解，用量筒定容，充分混匀，然后测其pH值，范围为8.0±0.2。
在本发明一较佳实施例中，步骤S4中，划线工艺具体包括如下步骤：
(1)T线、C线处理：将新型冠状病毒中和抗体T线划线蛋白ACE2-PS-Ag2用划线工作液稀释，将山羊抗鸡IgY C线划线蛋白用划线工作液稀释，混匀时间半小时以上。
(2)一次贴板：将NC膜和吸水纸贴于PVC底板上，其中NC膜对齐标准位置底部，吸水纸对齐PVC底板上端；
(3)划线：进入喷金划线仪程序界面，设置参数；用工艺用水对管路清洗，吸取C、T线抗体对管路进行润洗，随后再吸取C、T线抗体充满管路待划线；将贴完吸水纸和NC膜的PVC底板放置于喷金划线仪工作台面上；开始划线，划线后的PVC板放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间；
(4)干燥：将划完线的NC膜置于干燥间干燥过夜，干燥间温度34±3℃，湿度≤40％；
所述划线工作液的制备工艺如下：
先用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方的顺序先后加入定量Na2HPO4、NaCl、海藻糖，并搅拌至完全溶解，用1％的盐酸调pH至7.4±0.1，用量筒定容，充分混匀，然后加入BSA，溶解搅拌混匀。
本发明新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺的有益效果是：本发明通过对新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒生产全过程的溶液配方、溶液配制方法细节、胶体金蛋白标记、NC膜划线包被等关键工序和特殊过程等环节进行了详细的阐述，并对生产过程中的使用到的仪器参数进行了优化，从而保证试剂盒生产的连续稳定，极大的提高了新型冠状病毒中和抗体的检测灵敏度和重复性。
附图说明
图1为本发明的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺的工艺流程图；
图2为本发明的喷金布局示意图；
图3为本发明的划线布局示意图；
图4为本发明的贴板布局示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1所示，本发明提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，依次包括如下步骤：制金、标记、喷金、划线、贴板及切条、检测卡组装、检验、成品组装等工序，下面对其进行详细说明。
1、溶液配制
1.11％柠檬酸三钠溶液配制
标准配方(按40mL量计)：
Figure BDA0003082571200000071
配制方法：
在洗净并烘干的50mL的离心管中加入30mL的工艺用水，按照标准配方内容准确称取柠檬酸三钠二水倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容至40mL并充分混匀。使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中，贴上试剂签，现配现用。
1.21％氯金酸溶液配制
标准配方(按100mL量计)：
Figure BDA0003082571200000072
Figure BDA0003082571200000081
配制方法：
取一支1g/支的四氯金酸，打开加入适量工艺用水溶解，倒入洗净并烘干的烧杯中。再反复冲洗将洗液倒入烧杯，直至冲洗液无色后再冲洗5遍以上。倒入洗净并烘干容量瓶中，加入工艺用水定容至100mL，使用0.22μm的滤膜过滤至棕色试剂瓶中，贴上标签。保持条件及效期：2-8℃保存，有效期6个月。
1.30.2M碳酸钾溶液配制
标准配方(按40mL量计)：
Figure BDA0003082571200000082
配制方法：
在洗净并烘干的50mL的离心管中加入30mL的工艺用水，按照标准配方内容准确称取碳酸钾倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容至40mL并充分混匀。使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中，贴上标签。保存条件及效期：2-8℃保存，有效期6个月。
1.4新型冠状病毒中和抗体玻纤处理液(1x)配制
标准配方(按1000mL量计)：
Tris 4.0g
Casein-Na 5g
柠檬酸三钠 2.86g
PVP-10 10.0g
S-17 10.0g
蔗糖 20.0g
纯化水 990mL
Tween-20 10mL
TritonX-100 10mL
配制方法：
先用洗净并烘干的量筒量取800mL的工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方内容的顺序先后加入各试剂并搅拌至完全溶解。用量筒定容至1000ml，充分混匀。然后测其pH值，范围为8.0±0.2。现配现用。
1.5划线工作液(1x)配制
标准配方(按1000mL量计)：
Na2HPO4 0.85g
NaCl 8.90g
海藻糖 30g
纯化水 980ml
BSA 10.0g
配制方法：
先用洗净并烘干的量筒量取800mL的工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方内容的顺序先后加入各试剂并搅拌至完全溶解(BSA除外)。用1％的盐酸调pH至7.4±0.1用量筒定容至1000ml，充分混匀。然后加入BSA，溶解搅拌混匀。
1.6新型冠状病毒中和抗体金标重悬液(5x)配制
标准配方(按500mL量计)：
Figure BDA0003082571200000091
Figure BDA0003082571200000101
配制方法：
在洗净并烘干的烧杯中加入300mL左右的工艺用水，按照标准配方内容的顺序先后加入各试剂并搅拌至完全溶解。溶解后倒入洗净并烘干的容量瓶，用工艺用水定容至500mL，并充分混匀。保存条件及效期：-20℃保存，有效期6个月。使用时提前取出放置室温解冻并混匀30分钟以上。
2、胶体金结合垫及样品垫用玻璃纤维处理
2.1标准配方
序号 原料名称 规格型号 用量
1 玻纤处理液 浓度：1x 45-50mL
2 玻纤Ahlstrom8951 30cm*25cm 1张
2.2处理方法
涂抹：使用铺膜装置进行喷涂，使玻纤处理液均匀涂满整张玻纤Ahlstrom8951；
干燥：温度34±3℃，湿度≤40％，干燥过夜(16±1小时)烘干，烘干后密封干燥储存。取样送检，质检合格后使用。
耗材准备及切条处理：使用前需将处理好的玻纤Ahlstrom8951干燥过夜，温度34±3℃，湿度≤40％。
吸水纸：将吸水纸300mm×210mm切成300mm×17mm作为吸水垫备用；
样品垫：将处理后的样品垫切成300mm×14mm备用；
胶体金结合垫：将处理后的玻纤切成300mm×7mm作为金标用垫备用。
3、4倍(1:1)胶体金溶液制备
3.1标准配方(按1000mL量计)：
Figure BDA0003082571200000111
3.2制备方法：
用洗净并烘干的量筒量取1000mL工艺用水倒入洗净并烘干的烧杯中，将烧杯置于电热炉上。加热至烧杯底部有较大气泡产生还未烧开时，一次性倒入40ml准备好的1％的氯金酸溶液；加大功率继续加热至沸腾，计时10s，一次性倒入准备好的1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变黑后开始计时，保持沸腾15分钟，然后停止加热，将圆底烧瓶从电磁加热套中取出，置于室温冷却。此时观察胶体金溶液，溶液应澄清透明，呈酒红色，液面无漂浮物。
待溶液冷却至室温后，用工艺用水定容至1000mL，倒入洗净并烘干的锥形瓶中，充分混匀，取4mL送检。检验合格后贴上标签，2-8℃保存，有效期1年。
3.3工艺要点：
制金使用新鲜配制的工艺用水，工艺用水使用前应用0.22μm的滤膜进行过滤；
制金使用的烧杯必须保持洁净，使用前应超声清洗，并使用工艺用水进行润洗3遍以上，制金使用的枪头必须用工艺用水清洗烘干后使用；
胶体金制备应在避光条件下完成。
4、新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液制备
4.1标准配方(按1000mL量计)：
Figure BDA0003082571200000112
Figure BDA0003082571200000121
4.2制备方法：
量取配方量3倍胶体金溶液1000mL于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀；
调pH：准确量取0.2M碳酸钾溶液10mL，在磁力搅拌(转速不要过快)下逐滴的加入10mL量的0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
标记：准确量取新型冠状病毒RBD蛋白Ag28(浓度：1.0mg/mL)10mL在磁力搅拌下缓慢加入到上述步骤溶液中，磁力搅拌10分钟；
封闭：取10％BSA溶液10mL，在磁力搅拌下缓慢加入到上述步骤溶液中，磁力搅拌30分钟；
离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
复溶：使用金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物(复溶液终浓度为1×复溶液浓度)，混匀配制成金标结合物复溶液，密封避光2-8℃保存；2日内喷膜干燥保存备用。
4.3工艺要点：
标记使用的锥形瓶必须保持洁净，使用前应进行超声清洗，并使用工艺用水进行润洗3遍以上。标记使用的枪头必须用工艺用水清洗烘干后使用。
新型冠状病毒中和抗体金标标记抗体加入时应进行加入量的换算，换算方法为抗体浓度为1.0mg/mL的加入量除以抗体浓度。(举例：加入量为1.0mg/mL时加入100μL，则抗体浓度为5.0mg/mL时加入量为100除以5为20μL)。
5、鸡IgY胶体金标记复合物溶液制备
5.1标准配方(按1000mL量计)：
Figure BDA0003082571200000131
5.2制备方法：
量取配方量3倍胶体金溶液1000mL于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀
调pH：准确量取0.2M碳酸钾溶液6mL，在磁力搅拌(转速不要过快)下逐滴的加入10mL量的0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
标记：准确量取鸡IgY标记蛋白(浓度：1.0mg/mL)10mL在磁力搅拌下缓慢加入到上述步骤溶液中，磁力搅拌10分钟；
封闭：取10％BSA溶液10mL，在磁力搅拌下缓慢加入到上述步骤溶液中，磁力搅拌30分钟；
离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
复溶：使用金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物(复溶液终浓度为1×复溶液浓度)，混匀配制成金标结合物复溶液，密封避光2-8℃保存；2日内喷膜干燥保存备用。
5.3工艺要点：
标记使用的锥形瓶必须保持洁净，使用前应进行超声清洗，并使用工艺用水进行润洗3遍以上。标记使用的枪头必须用工艺用水清洗烘干后使用。
鸡IgY标记蛋白加入时应进行加入量的换算，换算方法为蛋白浓度为1.0mg/mL的加入量除以蛋白浓度。(举例：加入量为1.0mg/mL时加入100μL，则鸡IgY标记蛋白浓度为5.0mg/mL时加入量为100除以5为20μL)。
6、喷金
6.1标记复合物的混合：
将新型冠状病毒RBD蛋白Ag28金与鸡IgY金按10:1混合，混匀时间应在半小时以上。
6.2喷金：
进入喷金划线仪程序界面，设置参数，其中X：5.50mm；Y：83.00mm；Z：15.0mm；长度：288mm；速度：100mm/s；2号泵：喷量1.0-3.0μL/cm(根据最终复溶体积调整)。
用工艺用水对管路进行清洗20次。用喷金管路的首尾端放置标记复合物中润洗5次，然后排液使标记复合物充满管路待喷金。
将300*7mm规格的结合垫放置于喷金划线仪的台面上，下边沿着5.5cm的水平线，左边沿5cm的竖直线，示意图如图2所示。
开始喷金，喷金后的金标结合垫放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间。喷金结束后，先用无水乙醇冲洗管路20次，再用工艺用水冲洗管路20次。
6.3干燥：
将金标垫置于干燥间干燥过夜(16-20小时)。干燥间温度34±3℃，湿度≤40％。干燥结束后，将金标垫保存备用，需双层包装并放入干燥剂。
6.4工艺要点：
空压机补气阶段勿进行喷金操作；
喷金前，将金标垫放入操作间平衡半小时以上；
使用的金标垫应平整无褶皱，否则会影响产品均一性。
7、划线
7.1新型冠状病毒中和抗体划线蛋白ACE2-PS-Ag2(T线)及山羊抗鸡IgY(C线)的处理：
将新型冠状病毒中和抗体T线划线蛋白ACE2-PS-Ag2用1x划线工作液稀释成2.0mg/mL，将C线划线蛋白山羊抗鸡IgY用1x划线工作液稀释成1.0mg/mL，混匀时间半小时以上。
7.2一次贴板：
将NC膜和吸水纸贴于PVC底板上，其中NC膜对齐标准位置底部，吸水纸对齐PVC底板上端；
7.3划线：
进入喷金划线仪程序界面，设置参数，其中X：8.00mm；Y：16.00mm；Z：10.0mm；长度：300mm；速度：100mm/s；1号泵：1.00μL/cm；3号泵：1.00μL/cm。
用工艺用水对管路清洗20次。吸取250μL C、T线抗体对管路进行润洗，随后再吸取C、T线抗体充满管路待划线。
将贴完吸水纸和NC膜的PVC底板放置于喷金划线仪工作台面上，其中PVC板吸水纸朝下，并对齐5.5cm的水平线，左端对齐8.0cm的竖直线。
开始划线，划线后的PVC板放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间。划线结束后，用工艺用水清洗管路20次。
划线布局如图3所示。
7.4干燥：
将划完线的NC膜置于干燥间干燥过夜(16-20小时)。干燥间温度34±3℃，湿度≤40％。干燥结束后，保存备用，需双层包装并放入干燥剂。
7.5工艺要点：
划线前，将NC膜放入操作间平衡半小时以上。
划线后，首尾两端都应去除，用黑色签字笔标记。NC膜上出现残缺处，用铅笔在NC膜上做标记。
划线过程中，测量C、T线上边沿和吸水纸上端的距离，其中C线上边沿和吸水纸上端标准距离为25±0.2mm，T线上边沿和吸水纸上端标准距离为31±0.2mm。
8、贴板及切条
8.1贴板：
粘贴顺序为：金标结合垫(喷完金的结合垫)、全血过滤垫、样品垫。结合垫叠压NC膜1-2mm，全血过滤垫叠压结合垫1-2mm，样品垫叠压全血过滤垫1-2mm。贴板示意图如图4所示。
8.2切条：
参数设置：将自动切条机切条宽度设置为3.0mm，切条速度为中等。
在自动切条机上将贴好的PVC板切成宽3.0mm的测试条用于后续检测卡组装。
8.3工艺要点：
贴板时，吸水纸端和样品垫端不能超出PVC底板的两侧。
贴板完成后，大板需进行双层包装，常温干燥避光保存。
切条时，要及时将有缺陷试剂条挑出，并做好记录。
9、检测卡组装、装袋
将试剂条按顺序置于卡壳预留位置，盖上上盖后，置于压壳机进行压紧处理。
将安装好的检测卡装入铝箔袋中，并加入干燥剂1个，进行封口处理，同时进行批号及失效期等信息喷码，然后进行半成品抽检，检测合格后进行后续成品组装。
10、成品组装
10.1成品组装：
将25人份检测卡、1份说明书、1袋加样吸管、1瓶样品稀释液装入包装盒中。
包装完毕后，送至成品待检区。检测合格后，按照成品放行审核程序进行审核，生产人员凭检验报告单办理成品入库手续。
10.2成品储存：
温度：2-30℃，阴凉干燥处，避免阳光照射，有效期18个月，开封后保存30天。
10.3工艺要点：
将组分装入包装盒中必须称重合格后才能贴签，重量以前几盒为基准，偏差不能大于一个检测卡的重量，重量有疑问时，应该重新计数。
检测卡必须朝同一方向放置。加样吸管放置检测卡左边，样品稀释液放置于检测卡后面，说明书放置于检测卡上面。
外包时必须检查包装盒、铝箔袋批号打印情况，稀释液贴签情况。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1，制金
采用柠檬酸三钠溶液及氯金酸溶液按1:1的比例烧制胶体金溶液；
S2，标记
采用S1制备好的胶体金溶液、按照配方量加入0.2M碳酸钾溶液进行PH调节，加入新型冠状病毒RBD蛋白Ag28溶液进行标记离心，然后使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液将沉淀物按照50倍浓缩复溶后保存待用；
采用S1制备好的胶体金溶液、按照配方量加入0.2M碳酸钾溶液进行pH调节、依次加入鸡IgY进行标记离心，然后使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液将沉淀物按照50倍浓缩复溶后保存待用；
S3，喷金
将新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液及鸡IgY胶体金标记复合物溶液按10:1混合，在玻纤金标结合垫上喷金，喷金结束后进行干燥处理；
S4，划线
将新型冠状病毒中和抗体T线划线蛋白ACE2-PS-Ag2用划线工作液稀释成2.0mg/mL，振荡混匀后待用；将C线划线蛋白山羊抗鸡IgY用划线工作液稀释成1.0mg/mL，振荡混匀后待用；在PVC板表面贴合NC膜和吸水纸，随后使用三维金标划线仪在相应的管路中吸取上述配置好的C、T线划线液进行划线，划线后进行干燥处理；
S5，贴板及切条
将样品垫、全血过滤垫、喷金干燥后的玻纤金标结合垫、与S4中划线后的NC膜按照顺序依次叠压，贴板后进行切条，得到新冠中和抗体试剂卡条；
S6，检测卡组装
将S5中得到的试剂卡条置于卡壳内压装成检测卡，连同干燥剂一同装入铝箔袋封口后成为新冠中和抗体半成品试剂卡；
S7，成品组装
将检测卡、说明书、加样吸管及样品稀释液装入包装盒中，检测合格后入库。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，步骤S1中，
柠檬酸三钠溶液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的离心管中加入工艺用水，按照标准配方准确称取柠檬酸三钠二水倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容并充分混匀，使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中；
氯金酸溶液的制备工艺如下：
取一支四氯金酸，加入适量工艺用水溶解，再反复冲洗将洗液倒入烧杯，直至冲洗液无色后再反复冲洗，倒入洗净并烘干容量瓶中，加入工艺用水定容，使用0.22μm的滤膜过滤；
胶体金溶液的具体制备工艺如下：
用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水倒入洗净并烘干的烧杯中，将烧杯置于电热炉上，加热至烧杯底部有较大气泡产生还未烧开时，一次性倒入定量准备好的1％的氯金酸溶液；加大功率继续加热至沸腾，一次性倒入准备好的1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液变黑后开始计时，保持沸腾15分钟；然后停止加热，置于室温冷却；待溶液冷却至室温后，用工艺用水定容，倒入洗净并烘干的锥形瓶中，充分混匀。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，步骤S2中，0.2M碳酸钾溶液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的离心管中加入工艺用水，按照标准配方准确称取碳酸钾倒入离心管中，搅拌至完全溶解，加入适量工艺用水定容并充分混匀，使用0.22μm的滤膜过滤至试剂瓶中；
新型冠状病毒中和抗体金标重悬液的制备工艺如下：
在洗净并烘干的烧杯中加入定量工艺用水，按照标准配方的顺序先后加入Tris、氢氧化钠、酪蛋白、PEG20000、PVP K30、柠檬酸、蔗糖、海藻糖、吐温20、Proclin300，并搅拌至完全溶解；溶解后倒入洗净并烘干的容量瓶，用工艺用水定容并充分混匀；
新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液的具体制备工艺如下：
(1)量取配方量3倍胶体金溶液于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀；
(2)调pH：准确量取定量0.2M碳酸钾溶液，在磁力搅拌下逐滴的加入定量的0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
(3)标记：准确量取新型冠状病毒RBD蛋白Ag28，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)的溶液中，磁力搅拌10分钟；
(4)封闭：准确量取定量10％牛血清白蛋白溶液，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(3)的溶液中，磁力搅拌30分钟；
(5)离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
(6)复溶：使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物，混匀配制成新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液；
鸡IgY胶体金标记复合物溶液的具体制备工艺如下：
(1)量取配方量3倍胶体金溶液于锥形瓶中，用磁力搅拌子缓慢搅拌均匀；
(2)调pH：准确量取定量0.2M碳酸钾溶液，在磁力搅拌下逐滴的加入定量0.2M碳酸钾溶液，磁力搅拌时间为10分钟；
(3)标记：准确量取鸡IgY标记蛋白，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)的溶液中，磁力搅拌10分钟；
(4)封闭：取定量10％牛血清白蛋白溶液，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(3)的溶液中，磁力搅拌30分钟；
(5)离心：取胶体金标记结合物离心，温度20℃，11000转/分钟，离心25分钟，去尽上清待复溶；
(6)复溶：使用新型冠状病毒中和抗体金标重悬液，按照50倍浓缩体积复溶待复溶物，混匀配制成鸡IgY胶体金标记复合物溶液。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，步骤S3中，喷金工艺具体包括如下步骤：
(1)标记复合物混合：将新型冠状病毒中和抗体胶体金标记复合物溶液及鸡IgY胶体金标记复合物溶液按10:1混合，混匀时间在半小时以上；
(2)喷金：进入喷金划线仪程序界面，设置参数；用工艺用水对管路进行多次清洗，用喷金管路的首尾端放置标记复合物中润洗多次，然后排液使标记复合物充满管路待喷金；将玻纤金标结合垫放置于喷金划线仪的台面上，开始喷金；
(3)干燥：喷金后的金标垫放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间干燥过夜。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，玻纤金标结合垫的处理工艺如下：
(1)涂抹：使用铺膜装置进行喷涂，使玻纤处理液均匀涂满整张玻纤；
(2)干燥：温度34±3℃，湿度≤40％，干燥过夜烘干，烘干后密封干燥储存；
(3)耗材准备及切条处理：使用前需将处理好的玻纤干燥过夜，将处理后的玻纤切条，作为玻纤金标结合垫备用；
所述玻纤处理液的制备工艺如下：
先用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方的顺序先后加入Tris、Casein-Na、柠檬酸三钠、PVP-10、S-17、蔗糖、Tween-20、Triton X-100，并搅拌至完全溶解，用量筒定容，充分混匀，然后测其pH值，范围为8.0±0.2。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，步骤S4中，划线工艺具体包括如下步骤：
(1)T线、C线处理：将新型冠状病毒中和抗体T线划线蛋白ACE2-PS-Ag2用划线工作液稀释，将山羊抗鸡IgY C线划线蛋白用划线工作液稀释，混匀时间半小时以上。
(2)一次贴板：将NC膜和吸水纸贴于PVC底板上，其中NC膜对齐标准位置底部，吸水纸对齐PVC底板上端；
(3)划线：进入喷金划线仪程序界面，设置参数；用工艺用水对管路清洗，吸取C、T线抗体对管路进行润洗，随后再吸取C、T线抗体充满管路待划线；将贴完吸水纸和NC膜的PVC底板放置于喷金划线仪工作台面上；开始划线，划线后的PVC板放置于干燥架上，平衡20分钟以上后放入干燥间；
(4)干燥：将划完线的NC膜置于干燥间干燥过夜，干燥间温度34±3℃，湿度≤40％；
所述划线工作液的制备工艺如下：
先用洗净并烘干的量筒量取定量工艺用水，加入洗净并烘干的烧杯中，按照标准配方的顺序先后加入定量Na2HPO4、NaCl、海藻糖，并搅拌至完全溶解，用1％的盐酸调pH至7.4±0.1，用量筒定容，充分混匀，然后加入BSA，溶解搅拌混匀。
CN202110570914.1A 2021-05-25 2021-05-25 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺 Pending CN113295863A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110570914.1A CN113295863A (zh) 2021-05-25 2021-05-25 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110570914.1A CN113295863A (zh) 2021-05-25 2021-05-25 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113295863A true CN113295863A (zh) 2021-08-24

Family

ID=77324732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110570914.1A Pending CN113295863A (zh) 2021-05-25 2021-05-25 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113295863A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115112888A (zh) * 2022-08-25 2022-09-27 山东博科快速检测技术有限公司 一种新型冠状病毒抗原检测试剂卡的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011057475A1 (zh) * 2009-11-12 2011-05-19 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法
CN112051400A (zh) * 2020-09-03 2020-12-08 江苏美克医学技术有限公司 检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法
CN112485436A (zh) * 2020-11-09 2021-03-12 桂林电子科技大学 检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
CN112748243A (zh) * 2020-12-23 2021-05-04 北京美康基因科学股份有限公司 一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011057475A1 (zh) * 2009-11-12 2011-05-19 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法
CN112051400A (zh) * 2020-09-03 2020-12-08 江苏美克医学技术有限公司 检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法
CN112485436A (zh) * 2020-11-09 2021-03-12 桂林电子科技大学 检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
CN112748243A (zh) * 2020-12-23 2021-05-04 北京美康基因科学股份有限公司 一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115112888A (zh) * 2022-08-25 2022-09-27 山东博科快速检测技术有限公司 一种新型冠状病毒抗原检测试剂卡的制备方法
CN115112888B (zh) * 2022-08-25 2022-12-13 山东博科快速检测技术有限公司 一种新型冠状病毒抗原检测试剂卡的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN211905393U (zh) 新型冠状病毒特异性抗体和中和抗体联合检测试纸及装置
CN111426829A (zh) 一种检测SARS-CoV-2 IgM-IgG抗体总量的量子点微球免疫层析试纸条
CN113533721B (zh) 甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法
CN103018467B (zh) 双酚a的胶体金检测卡及其制备方法
CN107942061A (zh) 一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的试纸卡、制备及其检测方法
CN106932598A (zh) Hcg周期检测试剂盒及其制备方法
CN110456038A (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗原双联检测试剂及其制备方法
CN104655835A (zh) 氯丙嗪的免疫胶体金检测卡及其制备方法
CN113447652A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用
CN113295863A (zh) 新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的生产工艺
CN105044367A (zh) 检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条
CN112557654B (zh) 一种新型冠状病毒抗原检测试纸条
CN208672650U (zh) 用于检测犬冠状病毒抗原的免疫荧光层析检测卡
CN106706908A (zh) 一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法
CN106771123A (zh) 一种登革病毒IgM/IgG抗体检测试纸的制备方法
CN104237512A (zh) 一种免疫胶体金试纸条及制备方法及应用
CN104730248A (zh) 用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法
CN206258465U (zh) 一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸
CN103869063B (zh) 强抗基质干扰型双酚a上转换荧光层析试纸条的制备方法
CN111856008A (zh) 一种多种呼吸道病原体快速检测试纸及其制备方法
CN109395096A (zh) 标记外泌体的方法和aie荧光分子标记的外泌体及其应用
CN101706499A (zh) Flag融合标签胶体金检测试纸条及其制备方法
CN111624336A (zh) 新型冠状病毒IgG/IgM抗体检测试剂盒及其应用方法
CN106290863A (zh) 一种人类丙肝病毒（hcv）唾液/尿液抗体胶体金检测试剂盒及其制备方法
CN106771193A (zh) 一种单纯疱疹病毒II型lgM 抗体的免疫层析检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination