CN114252597A - 一种样品垫封闭剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种样品垫封闭剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种样品垫封闭剂及其制备方法和应用，属于医学检测领域。本发明的目的是降低免疫层析法检测过程中干扰因素产生的影响及保证封闭后的样品垫稳定性良好，具体地，样品垫封闭剂包括缓冲液、蛋白质保护剂、表面活性剂、防腐剂、还原剂、促凝剂及清洁抗体，其中清洁抗体选自HBR‑2、Tru Block‑2、CAB mab‑clon 24中的一种或多种。

Description

一种样品垫封闭剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，主要涉及样品垫封闭剂、其制备方法及应用该封闭剂的免疫层析试纸条或试纸卡。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)在急性心肌梗死(AMI)、心肌炎等疾病中，已作为判断心肌细胞损伤的重要指标，也是公认的协助急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)危险分层和反映其预后的主要标志，所以保证cTnI检测结果的准确度、特异性和稳定性在临床应用上至关重要。
常用的cTnI检测方法之一是免疫层析法，免疫层析(immunochromatography)技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法，其原理是将特异的抗体先固定于高分子膜的某一区带，当该干燥的高分子膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。在免疫层析技术中，用于封闭样品垫的封闭剂不合适的时候，会导致非特异性吸附背景信号偏高或者检测时信号偏低，使检测灵敏度偏低，同时也会影响检测的准确度和稳定性。
免疫层析法检测cTnI时，一些干扰因素会使检测结果带来偏差，干扰因素主要包括以下几种：1、采用全血或血浆标本时的某些抗凝物质(如EDTA)也会对检测产生影响：EDTA螯合全血或血浆标本中的钙离子，导致游离cTnI单体形成增加，从而影响检测值。肝素也可以直接与cTnI结合阻断抗原表位或者导致分子构象的改变而影响检测的免疫反应。2、存在着由于抗原-抗体反应的干扰而引起的假阳性：已有报告显示异嗜性抗体或类风湿因子会对用于检测的商品化试剂产生干扰。
综上所述，免疫层析法检测过程中，一系列干扰因素会对检测结果产生影响，所以样品垫的良好封闭对检测结果的准确性、特异性和稳定性有重要影响，有必要提供一种封闭效果良好的封闭剂。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种样品垫封闭剂，包括缓冲液、蛋白质保护剂、表面活性剂、防腐剂、还原剂、促凝剂和清洁抗体。
在一些实施方案中，缓冲液选自Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。在一些实施方案中，所述缓冲液为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液。在一些实施方案中，使用pH调节剂将所述缓冲液的pH调整至7.00～8.50，优选7.40～7.60，更优选7.48～7.52。在一些实施方案中，所述缓冲液的浓度选自0.01～0.10mol/L，优选0.03～0.07mol/L，更优选0.04～0.06mol/L，更优选0.04mol/L、0.045mol/L、0.05mol/L、0.055mol/L、0.06mol/L，最优选0.05mol/L。
在一些实施方案中，蛋白质保护剂选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯酮、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、甘油。在一些实施方案中，所述蛋白质保护剂为海藻糖。在一些实施方案中，所述蛋白质保护剂浓度选自0.2％(w/v)～10％(w/v)，优选自0.7％(w/v)～8％(w/v)，更优选自1.5％(w/v)～7％(w/v)，更优选自1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)、4.5％(w/v)、5％(w/v)、5.5％(w/v)、6％(w/v)、6.5％(w/v)、7％(w/v)。
在一些实施方案中，表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂，优选自非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为吐温-20(Tween-20)。在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度选自0.1％(v/v)～1％(v/v)，优选自0.1％(v/v)～0.5％(v/v)，更优选自0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)。
在一些实施方案中，防腐剂选自叠氮钠、苯酚、ProClin150、ProClin200、ProClin300或ProClin5000。在一些实施方案中，所述防腐剂为Proclin300。在一些实施方案中，所述防腐剂的浓度选自0.1％(v/v)～1％(v/v)，优选自0.1％(v/v)～0.5％(v/v)，更优选自0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)。
在一些实施方案中，促凝剂为RBC mab-clon7H3。在一些实施方案中，所述促凝剂浓度选自0.05mg/mL～1.0mg/mL，优选自0.05mg/mL～0.5mg/mL，更优选自0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL。在一些实施方案中，所述促凝剂浓度为0.2mg/mL。
在一些实施方案中，还原剂选自二巯基乙醇(2-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。在一些实施方案中，所述还原剂为二巯基乙醇(2-ME)。在一些实施方案中，所述还原剂浓度选自0.2％(v/v)～1.0％(v/v)，优选自0.3％(v/v)～1.0％(v/v)，更优选自0.5％(v/v)～1.0％(v/v)，更优选自0.5％(v/v)、0.55％(v/v)、0.6％(v/v)、0.65％(v/v)、0.7％(v/v)、0.75％(v/v)、0.8％(v/v)、0.85％(v/v)、0.9％(v/v)、0.95％(v/v)、1.0％(v/v)。在一些实施方案中，所述还原剂为2-ME，其浓度为0.5％(v/v)。
在一些实施方案中，清洁抗体选自HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24的一种或多种。在一些实施方案中，所述清洁抗体浓度选自0.1mg/mL～1.0mg/mL，优选自0.1mg/mL～0.5mg/mL，更优选自0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL。在一些实施方案中，清洁抗体选自HBR-2、Tru Block-2和CAB mab-clon 24的一种或多种，其中，清洁抗体的浓度选自0.1mg/mL～1mg/mL，优选自0.1mg/mL～0.5mg/mL，更优选自0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL。在一些实施方案中，清洁抗体选自HBR-2、TruBlock-2和CAB mab-clon 24的一种或多种，其中，各个清洁抗体的浓度均为0.2mg/mL。
在一些实施方案中，所述封闭剂包括：Tris-HCl缓冲液、海藻糖、Tween-20、ProClin300、2-ME、RBC mab-clon7H3和清洁抗体。在一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度选自0.01～0.10mol/L，优选0.03～0.07mol/L，更优选0.04～0.06mol/L，更优选0.04mol/L、0.045mol/L、0.05mol/L、0.055mol/L、0.06mol/L，最优选0.05mol/L。在一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液的pH选自7.00～8.50，优选7.40～7.60，更优选7.48～7.52。在一些实施方案中，所述海藻糖的浓度选自0.2％(w/v)～10％(w/v)，优选自0.7％(w/v)～8％(w/v)，更优选自1.5％(w/v)～7％(w/v)，更优选自1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)、4.5％(w/v)、5％(w/v)、5.5％(w/v)、6％(w/v)、6.5％(w/v)、7％(w/v)。在一些实施方案中，所述Tween-20的浓度选自0.1％(v/v)～1％(v/v)，优选自0.1％(v/v)～0.5％(v/v)，更优选自0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)。在一些实施方案中，所述ProClin300的浓度选自0.1％(v/v)～1％(v/v)，优选自0.1％(v/v)～0.5％(v/v)，更优选自0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)。在一些实施方案中，所述2-ME的浓度为0.2％(v/v)～1.0％(v/v)，优选自0.3％(v/v)～1.0％(v/v)，更优选自0.5％(v/v)～1.0％(v/v)，更优选自0.5％(v/v)、0.55％(v/v)、0.6％(v/v)、0.65％(v/v)、0.7％(v/v)、0.75％(v/v)、0.8％(v/v)、0.85％(v/v)、0.9％(v/v)、0.95％(v/v)、1.0％(v/v)。在一些实施方案中，所述2-ME的浓度是0.5％(v/v)。在一些实施方案中，所述RBC mab-clon7H3的浓度选自0.05mg/mL～1.0mg/mL，优选自0.05mg/mL～0.5mg/mL，更优选自0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL。在一些实施方案中，所述清洁抗体选自HBR-2、Tru Block-2和CAB mab-clon 24的一种或多种。在一些实施方案中，所述清洁抗体的浓度选自0.1mg/mL～1.0mg/mL，优选自0.1mg/mL～0.5mg/mL，更优选自0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL。在一些实施方案中，所述清洁抗体包括HBR-2、Tru Block-2和CAB mab-clon 24。在一些实施方案中，所述清洁抗体的浓度为0.2mg/mL，即HBR-2、TruBlock-2和CAB mab-clon 24的浓度均为0.2mg/mL。在一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，Tris-HCl缓冲液的pH为7.48～7.52，所述海藻糖浓度为5％(w/v)，所述Tween-20浓度为0.2％(v/v)，所述ProClin300的浓度为0.2％(v/v)，所述2-ME的浓度为0.5％(v/v)，所述RBC mab-clon7H3的浓度为0.2mg/mL，所述清洁抗体包括HBR-2、TruBlock-2和CAB mab-clon 24，所述清洁抗体的浓度为0.2mg/mL，即HBR-2、Tru Block-2和CAB mab-clon 24的浓度均为0.2mg/mL。
在第二方面，本发明提供一种第一方面所述封闭剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将一定量的缓冲试剂溶于适量水中，用pH调节剂调节pH至指定值，从而得到缓冲液；
(2)将一定量的蛋白质保护剂、表面活性剂、防腐剂与步骤(1)得到的缓冲液混合，再向其中加入一定量的促凝剂、还原剂和清洁抗体；
(3)加入水至液体中各物质达到指定浓度，从而得到第一方面所述的封闭剂。
在第三方面，本发明提供一种使用第一方面所述封闭剂对免疫层析试纸条样品垫进行封闭的方法，其包括以下步骤：
(1)将样品垫置于上述样品垫封闭剂溶液浸润一定时间；(2)将步骤(1)中的样品垫烘干。
在一些实施方案中，将样品垫置于上述样品垫封闭剂溶液浸润，静置3～10min，优选3～7min，更优选4min、5min、6min；(2)将步骤(1)中的样品垫放入25～40℃烘箱中，优选放入30～37℃烘箱中，更优选放入35～37℃烘箱中，放置15～24h，优选放置15～20h，更优选放置18h。
在第四方面，本发明提供一种免疫层析试纸条或试纸卡，包括吸水垫、结合垫、样品垫、反应膜，其中，所述样品垫包括第一方面所述的封闭剂或者是经过第一方面所述封闭剂处理制备而成的。
在一些实施方案中，第一方面所述的封闭剂是用于制备检测cTnI的免疫层析试纸条或试纸卡。在一些实施方案中，所述免疫层析试纸条或试纸卡，包括吸水垫、结合垫、样品垫、反应膜，其中，所述样品垫包括第一方面所述的封闭剂或者是经过第一方面所述封闭剂处理制备而成的；所述结合垫设有标记化cTnI抗体1；所述反应膜包括定量带和质控带，定量带上设有与标记化cTnI抗体1具有不同抗原决定簇的cTnI抗体2，质控带上设有重组cTnI蛋白或标记化cTnI抗体1的二抗。在一些实施方案中，所述结合垫包括由荧光蛋白、荧光微球或胶体金标记的cTnI抗体1。
本发明中，反应膜可选自硝酸纤维素膜(NC膜)、醋酸纤维素膜(CA膜)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、尼龙膜、混合纤维素膜(NC-CA膜)。
本发明中，非离子型表面活性剂可选自曲拉通X-100、吐温-20(聚山梨酯-20)、吐温-40(聚山梨酯-40)、吐温-60(聚山梨酯-60)、吐温-80(聚山梨酯-80)和乙基苯基聚乙二醇等。阴离子表面活性剂可选自SDS(月桂基硫酸钠)、STS(十三烷基硫酸钠)、NLS(N-月桂酰肌氨酸钠)、十二烷基硫酸锂、十二烷基苯磺酸钠、脱氧胆酸盐等。阳离子表面活性剂可选自二烷基二甲基氯化铵(例如，二癸基二甲基氯化铵)和具有碳原子数为8～18长链烷基的季铵盐表面活性剂，例如苯扎氯铵。
发明的有益效果：
1、封闭剂有效降低免疫层析法检测中干扰因素产生的影响，提高检测过程中的抗干扰能力，从而提升了检测特异性和准确性；
2、封闭后的样品垫稳定性良好。
定义：
本发明使用的术语“RBC mab-clon7H3”是指克隆号为7H3的抗红细胞单克隆抗体单克隆抗体。这是一种促凝剂，用于捕捉红细胞使其聚集成团使其不能层析。
本发明使用的术语“清洁抗体”也可称为“阻断剂”，是指一种与异嗜性抗体先结合形成复合物的抗体，经过去除复合物，使得检测抗体不再被异嗜性抗体干扰。术语“异嗜性抗体”(Heterophilic antibody,HA)是一类缺乏明确的动物血清或动物免疫球蛋白的刺激，由人体免疫系统分泌的与动物免疫球蛋白具有低亲和力的一种内源性干扰抗体，常见的有人抗动物抗体(如人抗鼠抗体)等。
本发明使用的术语“HBR-2”、“CAB mab-clon 24”均属于清洁抗体，可以主动阻断异嗜性抗体，通过位阻原理达到阻断效果，排除假阳；术语“Tru Block-2”也是清洁抗体的一种，它是一种复合型阻断剂，包含活性成分和纯化后的鼠IgG。
本发明使用的术语“异嗜性样本”是指含有异嗜性抗体的样本；术语“梯度样本”是指从一系列cTnI浓度已知的样本中，选择呈现系列梯度浓度的样本作为测试样本，该测试样本即为梯度样本。
附图说明
图1显示了在2-ME不同浓度条件下测定的cTnI浓度与Beckman标准品的临床相关性。横坐标是cTnI浓度，该浓度是基于化学发光法的原理，通过Access 2免疫分析系统，使用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(来自Beckman公司，货号是A98143)测定30个梯度样本获得的。纵坐标是cTnI浓度，是在2-ME不同浓度条件下测定的前述样本中cTnI浓度。
图2显示了在不同的清洁抗体组合方式条件下测定的cTnI浓度与Beckman标准品的临床相关性。横坐标是cTnI浓度，是基于化学发光法的原理，通过Access 2免疫分析系统，使用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(来自Beckman公司，货号是A98143)测定30个梯度样本获得的。纵坐标是cTnI浓度，是在不同的清洁抗体组合方式条件下测定的前述样本中cTnI浓度。
图3显示了在同时使用2-ME和HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24的条件下测定的cTnI浓度与Beckman标准品的临床相关性。横坐标是cTnI浓度，是基于化学发光法的原理，通过Access 2免疫分析系统，使用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(来自Beckman公司，货号是A98143)测定30个梯度样本获得的。纵坐标是cTnI浓度，是在2-ME和HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24配合使用的条件下测定的前述样本中cTnI浓度。
具体实施方式
材料：
缓冲液：Tris-HCl溶液(Tris来自Amresco公司；HCl溶液来自南京化学试剂有限公司)
蛋白质保护剂：海藻糖(来自TCIAMERICA)
非表面活性剂：Tween-20，防腐剂：Proclin300(均来自SigmaAIdrich)
还原剂：2-ME(来自SigmaAIdrich，货号是M6160)
促凝剂：RBC mab-clon7H3(来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号是E1201B)
清洁抗体：Tru Block-2(来自Scantibodies Laboratory，货号是A66802H)，CABmab-clon24(来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号是3104)，HBR-2(来自宝德康体，货号是3KC535)
鼠抗人心肌肌钙蛋白I抗体量子点结合物(来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号是E4203Q)
鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体2(来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号是AB0701)
重组人心肌肌钙蛋白I(来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号是AG0701)
样本：异嗜性样本是非心肌细胞损伤患者的血浆样本；梯度样本是心肌细胞损伤患者的血浆样本。
仪器：
QD-S600量子点免疫分析仪(来自南京诺唯赞医疗科技有限公司)
实施例1：在不添加清洁抗体组合物情况下，封闭剂中2-ME不同浓度的比较
(1)配制100mL 0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液：称取6.057g Tris，用70mL纯化水溶解完全，然后用5mol/L的HCl溶液调节pH至7.48-7.52，充分混匀，用纯化水定容到100mL静置待用；
(2)取一个洁净烧杯，向其中添加纯化水60mL、0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液32mL、海藻糖16g、Tween-200.64mL、Procilin3000.64mL，加纯化水至160mL，后均分成4份，向其中分别加入16mg的RBC mab-clon7H3，再向其中分别加入0mL、0.16mL、0.4mL、0.8mL的2-ME，充分混匀后，分别加入纯化水至80mL，4份液体分别简称0％(v/v)2-ME、0.2％(v/v)2-ME、0.5％(v/v)2-ME、1％(v/v)2-ME；
(3)步骤(2)的4份液体各取45mL分别浸润4份样品垫，静置5min；
(4)将步骤(3)浸润后的样品垫放入温度设置37℃的烘箱中，放置18h；
(5)将步骤(4)烘干的样品垫取出，使用斩切机裁切成10mm*300mm的规格。
(6)将1mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I抗体量子点结合物稀释至0.4mg/mL，用喷金仪以0.4μl/mm的喷量包被在抗体量子点结合物垫上。
(7)将0.5mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体2和1mg/mL重组人心肌肌钙蛋白I用划膜仪以1μl/cm的喷量包被在硝酸纤维素膜上，分别为T线(检测线)、C线(质控线)。
(8)在PVC底板上先后贴上吸水垫、步骤(7)中已包被的硝酸纤维素膜、步骤(6)中已包被的结合物垫、步骤(5)中的样品垫。切割成3.5mm宽，装入试剂卡中，可用于检测cTnI的试剂卡组装完成。
测试例1：对比本发明中不同浓度的2-ME效果
特异性和准确度的测试方法：
标准品：即基于化学发光法的原理，通过Access 2免疫分析系统，使用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(来自Beckman公司，货号是A98143)测定各样本获得的cTnI浓度。此类cTnI浓度，全文统称为“Beckman标准品”。
使用实施例1中组装完成的试剂卡检测，通过使用QD-S600量子点荧光免疫分析仪测定cTnI的浓度：
样品垫加样量：80微升
检测(反应)时间：8分钟
测试样品垫稳定性的测试方法：
(1)将实施例1中步骤(5)的样品垫切割成6份10mm*45mm的小段，放入37℃烘箱中；
(2)在第0天、第1天、第3天、第5天、第7天和第10天分别拿出一份样品垫，按照实施例1的实验步骤组装试剂卡；
(3)使用步骤(2)的组装完成的试剂卡检测，通过使用QD-S600量子点荧光免疫分析仪测定cTnI的浓度：
样品垫加样量：80微升
检测(反应)时间：8分钟
(4)通过与第0天测定出来的cTnI的浓度相比较，观测cTnI的浓度变化幅度，从而判断样品垫的稳定性。
测试例1.1：2-ME的不同浓度对特异性的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例1中组装完成的试剂卡检测10例异嗜性样本中cTnI的浓度结果进行比较，从而进行特异性评测，结果如表1所示，其中，2-ME浓度的不同对特异性产生了明显的影响，添加了2-ME的检测体系的特异性要显著高于不添加2-ME的检测体系，2-ME浓度为0.5％(v/v)、1％(v/v)的检测体系的特异性优于2-ME浓度为0.2％(v/v)的检测体系。通过与Beckman标准品相比较，并根据特异性的变化可以优选出2-ME的浓度，2-ME的浓度优选值为0.5％(v/v)、1％(v/v)，最优选浓度为0.5％(v/v)。
表1 2-ME的浓度对特异性的影响
Figure BDA0003399547660000081
测试例1.2：2-ME的浓度对准确度的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例1中组装完成的试剂卡检测30例梯度样本中cTnI的浓度结果相比较，从而进行准确度评测，结果如表2所示。其中，2-ME浓度的不同对准确度产生了明显的影响，通过比较不同的2-ME浓度条件下相同样本中cTnI的浓度，并与Beckman标准品相对照，根据准确度的变化优选出2-ME的浓度。在2-ME不同浓度条件下测定的cTnI浓度与Beckman标准品的临床相关性的结果如图1所示，2-ME浓度的不同对临床相关性有影响，且当2-ME浓度不同时，检测出的cTnI浓度与Beckman标准品均具有较好的临床相关性。结合评测准确度时观测出来的结果，2-ME的浓度优选为0.5％(v/v)、1％(v/v)，最优选浓度为0.5％(v/v)。
表2 2-ME的浓度对准确度的影响
Figure BDA0003399547660000091
Figure BDA0003399547660000101
测试例1.3：2-ME的浓度对样品垫稳定性的影响
使用测试例1的方法观测样品垫的稳定性，结果如表3所示，2-ME添加浓度的不同会影响到样品垫的稳定性。根据稳定性的变化，可以优选出2-ME的浓度，浓度优选为0.5％(v/v)和1％(v/v)，最优选浓度为0.5％(v/v)。
表3 2-ME的浓度对样品垫稳定性的影响
Figure BDA0003399547660000102
实施例2：清洁抗体组合的比较
(1)配制100mL 0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液：称取6.057g Tris，用70mL纯化水溶解完全，然后用5mol/L的HCl溶液调节pH至7.48-7.52，充分混匀，用纯化水定容到100mL静置待用；
(2)在烧杯中添加100mL的纯化水，向其中添加步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液56mL，海藻糖28g，Tween-201.12mL，Procilin3001.12mL，加纯化水至280mL，后均分成7份，向每份中加入0.4mL 2-ME、16mg RBC mab-clon7H3，再分别加入16mg HBR-2、16mg Tru Block-2、16mg CAB mab-clon 24、16mg HBR-2+16mg Tru Block-2、16mg HBR-2+16mg CAB mab-clon24、16mg Tru Block 2+16mg CAB mab-clon 24、16mg HBR-2+16mg Tru Block-2+16mgCAB mab-clon 24，充分混匀后均加纯化水至80mL，7份液体分别简称H、T、24、H+T、H+24、T+24、H+T+24；
(3)步骤(2)的7份液体各取45mL分别浸润7份样品垫，静置5min；
(4)将步骤(3)浸润后的样品垫放入温度设置为37℃的烘箱中，放置18h；
(5)将步骤(4)烘干的样品垫取出，使用斩切机裁切成10mm*300mm的规格；
(6)将1mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I抗体量子点结合物稀释至0.4mg/mL，用喷金仪以0.4μl/mm的喷量包被在抗体量子点结合物垫上；
(7)将0.5mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体2和1mg/mL重组人心肌肌钙蛋白I用划膜仪以1μl/cm的喷量包被在硝酸纤维素膜上，分别为T线(检测线)、C线(质控线)。(8)在PVC底板上先后贴上吸水垫、步骤(7)中已包被的硝酸纤维素膜、步骤(6)中已包被的结合物垫、步骤(5)中的样品垫。切割成3.5mm宽，装入试剂卡中，可用于检测cTnI的试剂卡组装完成。
测试例2：不同清洁抗体组合方式的效果
测试特异性和准确度及样品垫稳定性的方法测试例1相同。
测试例2.1：清洁抗体组合方式对特异性的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例2中组装完成的试剂卡检测10例异嗜性样本中cTnI浓度的结果进行比较，从而进行特异性评测，结果如表4所示，其中，清洁抗体组合方式的不同对特异性产生明显影响。通过与Beckman标准品相比，以及根据特异性的变化优选出清洁抗体的组合，清洁抗体的组合物最优组合方式为H+T+24的组合方式，即HBR-2、TruBlock-2和CAB mab-clon 24的组合方式。
表4清洁抗体组合方式对特异性的影响
Figure BDA0003399547660000111
测试例2.2：清洁抗体组合方式对准确度的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例2中组装完成的试剂卡检测30例梯度样本中cTnI浓度结果进行比较，从而进行准确度评测，结果如表5所示，其中，清洁抗体组合方式的不同对准确度产生影响。通过与Beckman标准品相比较，并根据准确度的变化优选出清洁抗体的组合方式。在不同的清洁抗体组合方式条件下测定的cTnI浓度与Beckman标准品的临床相关性的结果如图2所示，清洁抗体组合方式的不同对临床相关性影响不大，且当清洁抗体的组合方式不同时，检测出来的cTnI的浓度与Beckman标准品均呈现良好的临床相关性。通过结合评测准确度时观测出来的结果，我们可以选择更为合适的清洁抗体组合方式，则清洁抗体最优组合方式为H+T+24的组合方式，即HBR-2、Tru Block-2与CAB mab-clon 24的组合方式。
表5清洁抗体组合方式对准确度的影响
Figure BDA0003399547660000121
Figure BDA0003399547660000131
测试例2.3：清洁抗体组合物稳定性测试
使用测试例1的方法观测样品垫的稳定性，结果如表6所示，在不同条件下，清洁抗体组合方式的不同对样品垫稳定性的影响不大，可以灵活选择更为合适的清洁抗体组合方式。
表6清洁抗体组合方式对样品垫稳定性的影响
Figure BDA0003399547660000132
Figure BDA0003399547660000141
实施例3：还原剂和清洁抗体的相互作用评测
(1)配制100mL 0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液：称取6.057g Tris，用70mL纯化水溶解完全，然后用5mol/L的HCl溶液调节pH至7.48-7.52，充分混匀，用纯化水定容到100mL静置待用；
(2)在烧杯中添加100mL的纯化水，向其中添加步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液8mL，海藻糖4g，Tween-200.16mL，Procilin3000.16mL，加纯化水至40mL，混匀后加入0.4mL 2-ME、16mg RBC mab-clon7H3，再加入16mg HBR-2+16mg Tru Block-2+16mg CAB mab-clon24，充分混匀后均加纯化水至80mL，简称2-H+T+24；
(3)步骤(2)的液体取45mL浸润1份样品垫，静置5min；
(4)将步骤(3)浸润后的样品垫放入温度设置为37℃的烘箱中，放置18h；
(5)将步骤(4)烘干的样品垫取出，使用斩切机裁切成10mm*300mm的规格；
(6)将1mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I抗体量子点结合物稀释至0.4mg/mL，用喷金仪以0.4μl/mm的喷量包被在抗体量子点结合物垫上；
(7)将0.5mg/mL的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体2和1mg/mL重组人心肌肌钙蛋白I用划膜仪以1μl/cm的喷量包被在硝酸纤维素膜上，分别为T线(检测线)、C线(质控线)。
(8)在PVC底板上先后贴上吸水垫、步骤(7)中已包被的硝酸纤维素膜、步骤(6)中已包被的结合物垫、步骤(5)中的样品垫。切割成3.5mm宽，装入试剂卡中，可用于检测cTnI的试剂卡组装完成。
测试例3：还原剂和清洁抗体相互作用的效果
测试特异性和准确度及样品垫稳定性的方法测试例1相同。
测试例3.1：还原剂和清洁抗体相互作用对特异性的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例3中组装完成的试剂卡检测10例异嗜性样本中cTnI的浓度结果进行比较，从而进行特异性评测，结果如表7所示，还原剂和清洁抗体搭配使用时特异性良好。与实施例1、实施例2中特异性结果相比较，联合使用还原剂和清洁抗体可以提升检测的特异性，说明还原剂与清洁抗体之间形成了协同作用，且2-ME与HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24的配合使用可以显著提升检测的特异性。
表7还原剂和清洁抗体相互作用对特异性的影响
Figure BDA0003399547660000151
测试例3.2：还原剂和清洁抗体相互作用对准确度的影响
本测试例将Beckman标准品与实施例3中组装完成的试剂卡检测30例梯度样本中cTnI浓度结果进行比较，从而进行准确度评测，结果如表8所示，还原剂和清洁抗体搭配使用时，检测的准确度良好。与实施例1、实施例2的准确度结果相比较，联合使用还原剂和清洁抗体可以使检测的准确度更高，说明还原剂和清洁抗体之间形成了协同作用。如图3所示，检测出来的cTnI的浓度与Beckman标准品呈现良好的临床相关性。所以，2-ME与HBR-2、Tru Block-2与CAB mab-clon 24的配合使用可以显著提升检测的准确度。
表8还原剂和清洁抗体相互作用对准确度的影响
Figure BDA0003399547660000152
Figure BDA0003399547660000161
测试例3.3：还原剂和清洁抗体相互作用对稳定性的影响
使用测试例1的方法观测样品垫的稳定性，结果如表9所示，还原剂和清洁抗体搭配使用稳定性良好，且与实施例1、实施例2的样品垫稳定性结果相比，还原剂和清洁抗体的配合使用可以提升样品垫的稳定性，说明还原剂和清洁抗体之间形成了协同作用，且2-ME与HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24的配合使用可以显著提升样品垫的稳定性。
表9还原剂和清洁抗体相互作用对样品垫稳定性的影响
Figure BDA0003399547660000162

Claims (16)

1.一种样品垫封闭剂，包括缓冲液、蛋白质保护剂、表面活性剂、防腐剂、还原剂、促凝剂、清洁抗体，其特征在于，所述清洁抗体选自HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、HEPES缓冲液，其pH选自7.00～8.50，优选自7.40～7.60，更优选自7.48～7.52，所述缓冲液浓度选自0.01～0.10mol/L。
3.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述蛋白质保护剂选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯酮、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、甘油，所述蛋白质保护剂的浓度选自0.2w/v％～10w/v％。
4.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂，优选自非离子型表面活性剂，所述表面活性剂的浓度选自0.1v/v％～1v/v％。
5.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、ProClin150、ProClin200、ProClin300或ProClin5000，所述防腐剂浓度选自0.1v/v％～1v/v％。
6.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述促凝剂为RBC mab-clon7H3，所述促凝剂浓度选自0.05mg/mL～1.0mg/mL。
7.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述还原剂选自2-ME、DTT、TCEP，所述还原剂浓度选自0.2v/v％～1.0v/v％。
8.根据权利要求1所述的样品垫封闭剂，其特征在于，所述清洁抗体的浓度选自0.1mg/mL～1.0mg/mL。
9.根据权利要求1-8任一项的样品垫封闭剂，其特征在于，所述还原剂为0.5v/v％的2-ME，清洁抗体为浓度是0.2mg/mL的选自HBR-2、Tru Block-2、CAB mab-clon 24中的一种或多种。
10.根据权利要求1的样品垫封闭剂，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，蛋白质保护剂为海藻糖，表面活性剂为Tween-20，防腐剂为Proclin300，促凝剂为RBC mab-clon7H3。
11.根据权利要求10的样品垫封闭剂，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，Tris-HCl缓冲液pH为7.48～7.52，海藻糖浓度为5w/v％，Tween-20浓度为0.2v/v％，ProClin300浓度为0.2v/v％，RBC mab-clon7H3浓度为0.2mg/mL，还原剂为浓度为0.5v/v％的2-ME，清洁抗体包括HBR-2、Tru Block-2和CAB mab-clon 24，所述清洁抗体的浓度为0.2mg/mL。
12.一种制备权利要求1所述样品垫封闭剂的方法，包括如下步骤：
(1)将一定量的缓冲试剂溶于适量水中，用pH调节剂调节pH至指定值，从而得到缓冲液；
(2)将一定量的蛋白质保护剂、表面活性剂、防腐剂与步骤(1)得到的缓冲液混合，再向其中加入一定量的还原剂、促凝剂和清洁抗体；
(3)加入水至液体中各物质达到指定浓度，从而得到所述封闭剂。
13.一种对免疫层析试纸条样品垫进行封闭的方法，包括以下步骤：(1)将样品垫置于权利要求1所述的样品垫封闭剂溶液中浸润一定时间；(2)将步骤(1)中的样品垫烘干。
14.一种免疫层析试纸条或试纸卡，包括吸水垫、结合垫、样品垫、反应膜，其特征在于，所述样品垫包括权利要求1所述的封闭剂或者是经权利要求1所述封闭剂处理制备而成的。
15.根据权利要求14所述的免疫层析试纸条或试纸卡，其特征在于，所述结合垫设有标记化cTnI抗体1；所述反应膜包括定量带和质控带，定量带上设有与标记化cTnI抗体1具有不同抗原决定簇的cTnI抗体2，质控带上设有重组cTnI蛋白或标记化cTnI抗体1的二抗。
16.根据权利要求15所述的免疫层析试纸条或试纸卡，其特征在于，所述结合垫包括由荧光蛋白、荧光微球或胶体金标记的cTnI抗体1。
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