CZ300997A3

CZ300997A3 - Způsob rychlého zjištění stavu orgánu, založený na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy

Info

Publication number: CZ300997A3
Application number: CZ973009A
Authority: CZ
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty
Original assignee: Biotrin Intellectual Properties Limited
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1996-04-02
Publication date: 1998-06-17
Also published as: PL322593A1; KR19980703302A; RU2154832C2; DE69605294T2; AU696996B2; CA2217296C; CA2217296A1; CN1100994C; WO1996031778A1; DE69605294D1; AU5286896A; CN1180411A; NO974565L; NO974565D0; US6080551A; ES2139347T3; AU2147295A; BR9604836A; EP0819252B1; WO1996031779A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká analytického postupu pro rychlou detekci a/nebo. stanovení glutathion S-transferáz za účelem zjištění stavu orgánu.

Dosavadní stav techniky

Glutathion S-transferázy (GSTs) představují muitigenní rodinu proteinů, která většinou obsahuje proteinové izoformy alfa, mí, omikron a pí. Tyto proteiny umožňují v organizmu deloxikáci řady xenobiotik (pro organizmus cizorodých látek) a to většinou tak, že dochází ke konjugaci na giutathión. Alfa-GST je hlavní jatemí formou a je v játrech rovnoměrně distribuován. Pí-GST se naopak nachází převážně v epitelámích buňkách, víoubících žlučovody. Podobnou distribucí GSTs můžeme nalézt také v rénální oblasti, kde alfa-GST je lokalizován v proximálních tubulech a výskyt pí-GST je v nefronu omezen na distální oblast tubulů. Z toho je možno vyvozovat, že ^ měření, úrovně jak plazmoyého, takurmámího GST umožnímonitoroyat^ ; ' individuální sbiv jater i ledvin. Áž dosud mnozí autoři skutečně používají ^w měření G ST k vyhodnocení stupně poškození jater i ledvin u pacientů, kteří podstoupili transplantaci nebo kteří trpí orgánovým poškozením následkem _: * - ' · . · ' · expozice nepatickým nebo renátoím toxinům. (Viz například Truíl, A. K. et al., Transplantation (1994) 58,1345-1351).

radioimunologických stanovení (RIA). V poslední době je však komerčně dostupná řada mikrotítračních desek, umožňujících enzymové imunostánovení (EIAs). Tyto desky pocházejí od firmy Biotrin International Limited, Mount Merrion, Countý Dublin, Irsko a umožňují měření úrovně alfa- a pí-GST v biologických tekutinách. Tato enzymová imunostánovení doznala nyní mezi odborníky širokého uznání a to i pres určitou počáteční skepsi (c.f. Beckett, G. J. and Hayes, J. D., Adyanced in Clinical Chemistry 1993, (30) str. 325). V současnosti RIA ledy představuje pro mnoho pracovníků v oboru metodu volby. Uvedené dvě metody jsou do určité mhy limitovány, neboť obě vyžadují jak specializované vybavení, tak špičkově zaškolený a odpovědný personál, aby získané výsledky byly směrodatné a správné. Přitom jsou obě metody relativně pomalé, neboť jejich provedení od počátku do konce trvá v

44.44 44 4 44 44 ·* »4 44 444«

4··« 4 *- 4, 4 4 · · · ( ··· 4 4 4 4444 4 ····»»□ 4*4

4*44 44 44 4·· ·« 44 průměru 2 hodiny nebo i více. Proto byla požadována rychlejší metoda stanovení GST. '

Metody pro detekci jednotlivých GST izoenzymů jsou obecně znatelně složitější, jak je zřejmé při použití časově závislého imunofluorometrického stanovení (TR-IFMA). Tiainen P. et al. Clin. Chem.

(1996) 42 2,334-335 porovnání EIA (použit Hepkit, obchodní značka fy Biotrin Internát. Dublin) a TR-IFMA pro alfa-GST. Zjistilo se, že přesnost samotné metody byla větší u Hepkitu než u TR-IFMA. Metoda TR-IFMA je , zřejmě vhodnější pro výzkumné práce, protože pro ukončení stanovení je nutno více opakování (4) a více cyklů vymývání. Je proto jasné, že běžný výzkum v oblasti detekce a stanovení množství GST byl zaměřen na vývoj náročnějších a složitějších detekčních systémů jako je TR-IFMA.

Lidé, kteří se podrobili transplantaci orgánu nebo kteří utrpěli poškození orgánu jako následek expozice hepatitickým či renálnůn toxinům, . musí být pozorně sledováni. To platí zvláště pro osoby po transplantaci orgánu, které se nacházejí v dlouhodobém posttransplantačním léčení imunosupresivy, konkrétně cyklosporinem. Jakmile jsou takové osoby propuštěny z nemocničního ošetřování, musí být trvale sledovány, což v současnosti znamená nutnost častých a pravidelných návštěv příslušné nemocnice, ve které mohou být prováděny potřebné GST a další testy. Proto ' by bylo nanejvýš žádoucí, aby tyto osoby měli prostředky pro kontrolu svého * * * . . - . ·· . . . „ , . * jI* *, stáviii což bý. umožnilo^ nejen snížit frekvenci jejich návštěv nemocnice,ale, a . ío je důíežilější,ly to prostředky bypři zvýšení úrovněGST pč^kýllý T” pacientovi i lékaři včasnější indikaci pro rozhodnutí, zda je nutný lékařský zásah. · ‘ . ' ·

Metoda, umožňující rychlejší a jednodušší provedení detekce GST v plazmě, moči a dalších biologických kápalinách jako je nápř. žluč by tedy * představovala zřetelnou výhodu tím, že by lékaři umožnila monitorovat jak stav jater, tak stav ledvin postižené osoby bez potřeby časově náročných a drahých nemocničních testů.

Další oblastí, kde je požadováno rychlé provedení testu je vyhodnocení orgánů před transplantací nebo při experimentech ex vivo. V současnosti neexistuje obecně přijatelná metoda pro vyhodnocování dárcovského orgánu před jeho transplantací pacientovi. V důsledku toho je doposavad nemožné na základě znalosti kvality dárcovského orgánu věrohodně předvídat úspěšnost transplantace. Jakákoliv metoda, která by přispěla k předtransplantačňímu vyšetření dárcovského orgánu by výrazně pomohla při zvýšení úspěšnosti transplantace a umožnila by předejít ztrátě transplantovaného orgánu v důsledku jeho nízké původní kvality nebo ·»

A A A

Á A A A

AAA A A ·

AAAA AA « A A A AAA A A AAA AAA

A A AAA A· ·* nepřijetí tohoto orgánu hostitelským organizmem tím, že by lékaři umožnila včasnější podpůrnou posttransplantační terapii.

Součástí běžných oživovacích pochodů dárcovského orgánu je jeho nasycení nebo proniknutí speciálními reagenciemi (např. pufr Univerzita Wiskonsin), které jsou po určité době z tohoto orgánu odstraněny. Tyto reagencie mají za úkol udržet při nízké teplotě (4-10 °C) integritu orgánu ex vivo mimo hostitelský organismus a současně umožnit před jeho chirurgickým vnesením do hostitelského organizmu zahřátí na tělesnou teplotu (37 °C). Je jasné, že kvalita dárcovského orgánu závisí na radě faktorů. Takovými faktory je zdravotní slav dárcovského orgánu, délka a teplota ex vivo skladování, způsob zacházení a kvalita obsluhy a kvalita použitých konzervačních reagencíí. Poškození dárcovského orgánu, způsobené kterýmkoliv výše uvedeným faktorem by tedy mohlo být zjištěno vyhodnocením úniku enzymu z orgánu.

Rychlá stanovení jsou známá. Například EP 291194 Bl popisuje a chrání analytické testovací zařízení a analytickou metodu používající toto zařízení, které je použitelné v domácnostech, klinicky nebo při chirurgické praxí a které je určeno pro získání rychlé analýzy, přičemž vyžaduje jen minimální zběhlost a svědomitost uživatele. Toto zařízení je zvláště vhodné pro testování gravidity. O možnosti využití GSTs zde však není žádná zmínka. Koncentrace sledovaných hormonů u gravidních žen, jako například lidského chorionického gonadotropinu (HCG) mávíce stoupající charakter a tedy snadnější dětekovalěínůst; něž koncentrace GSTs ú výše uvedeného typu pacientů, pro které je zvýšená úroveň GST kritická, nebo dokonce předznamenává klinické ohroženi života.

Obtíže při měření enzymové aktivity ve smyslu rozlišení jednotlivých izoforem GSTs jsou dobře popsány (Beckett G. J. a Hayes J. D. 1993 supra). Jak je výše uvedeno, další výzkumníci využívají pro stanovení GSTs RIA (Howie A. F. et al. Clinica Chimica Acta, 1989,184,269-278) a TR-IFMA (Tiainen P. a Karhi K, K. Clin. Chem. 1994,40-2,184-189). U každé z těchto technik jde o velice citlivou detekci biomolekul. Ovšem tyto techniky vyžadují specializované vybavení a dobře zaškolený personál. Například pro provádění TR-IFMA je zapotřebí fluorometr s časovou funkcí.

Je tedy požadována taková technika, která bude vhodná pro laické provedení a dostatečně snadná a rychlá pro použití v kritické situaci. Takovou kritickou situací může být posttransplantační poškození jater nebo ledvin, nebo potenciální selhání jater v důsledku předávkování paracetamolu.

• 4 44 • 4 · · · 4 4 · 4

4 4

4«·· 44

4

4 44 ♦ 4 · • · ·

4 *

4· ·44

44 « 4

4 4 4 4

4« 44

Podstata vynálezu

Vynález řeší způsob rychlého určení stavu orgánu u subjektu a je založen na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy + I (GST) v biologických tekutinách. Tento způsob zahrnuje kontaktování částicemi značené protilátky anti-GST specifické pró izoenzym se vzorkem biologické tekutiny, obsahující tento izoenzym, přičemž použitá protilátka má dostatečnou specifickou citlivost pro detekci alespoň pikomolámího množství izoenzymů, načež se komplex částicemi značená protilátka-izoenzym zachytí í

na imobilizované protilátce za vzniku vizuálně detekovatelného signálu.

Výrazem rychlého je zde míněno, že detekce nebo určení izoenzymů GŠT jezpravidla dokončeno v době do 30 minul od počátku kontaktu s částicemi, značenými anti-GST protilátkou.

' . ?

,:.· · Význam formulace stav orgáiiu zahrnuje poškození orgánu jako následek imunologické nebo toxikologické příhody.

ř’ : , · · , ·

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že jednou z největších výhod řešení podle vynálezu spočívá v jeho jednoduchosti, takže může být použito osobami s žádným nebo jen malým zaškolením, které tak mohou sledovat svůj zdravotní stav a/nebo získat rychlou informaci ve výše uvedených kritických situacích. ^;’ . . .... r, 2,( ________ ťr '; <·; : Je zřejmé, že-pro prováděnítohotostanovení nebo pro vyhodnocení a_ interpretaci získaných výsledků není nutno používat komplikovaná zařízení nebo speciální laboratorní postupy. Tato jednoduchost provedení a interpretace výsledků vyplývá z řady variantních stanovení GST.

GSTjes výhodou alfa-GST, pí-GST nebo mí-GST hepatitického nebo renalního původu. ' Zvlášť výhodně je GST alfa-GST nebo pí-GST hepatitického nebo renalního původu. .

i ' a ¹

Zvláštním požadavkem jakéhokoliv rychlého stanovení GST je použití protilátky s požadovanou afinitou vůči GST.

Pto alfa-GST se použije polyklonální protilátka s takovou afinitou, aby bylo dosaženo detegovateíňé koncentrace alespoň 6(5 ng/ml, což přispívá významně k citlivosti způsobu, jak bude dále popsáno.

Obecně jsou pro provádění způsobu podle vynálezu výhodné jak monoklonální, tak polyklonální protilátky s takovou afinitou, aby detekovaly koncentrace GST izoenzymů alespoň 5 ng/ml.

4*4» 4 4' · * » · 44 *.

♦ <4444 4 4 444 « 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4

4444 44 4 · 44« 44 «4

Protilátkou anti-GST, zachycenou na pevnou-fázi je výhodně polyklonální protilátka, obzvláště polyklonální IgG. V určitých případech, například u pí-GST je protilátkou zachycenou na pevné fázi výhodně protilátka monoklonáiní.

Výhodně je protilátka anti-GST vázána na nitrocelulózovou membránu známého typu, např, od fy Schleicher a Schuell GmbH - Německo.

Tyto membrány mají přirozenou schopnost vázat proteiny, včetně imunogtobulinů. Přesto bude dále uvedeno, že řada pevných nosičů známých per se může být použito jako nosičů pro zachycení protilátky. Takové nosiče jsou v léto přihlášce obecně označovány jako pevná fáze.

Nitrocelulózová membrána má velikost pórů výhodně v rozmezí 5 až lO^im.

Je výhodné, jsou-li místa nespecifického vázání na nitrocelulózové membráně obsazena - blokována, a to v závislosti na konkrétním charakteru stanovení, jak bude dále popsáno. S výhodou můžě být blokování nespecifických míst na membráně dosaženo jejím ošetřením bovinním sérovým albuminem nebo mléčným proteinem nebo pomocí polymeru jako je polyvinylpyrrolidon, a to o sobě známým způsobem.

Pevná fáze může mít řadu variantních uspořádání a může zahrnovat i takové typy, které jsou pokryty výše uvedeným patentem EP 0 291 194 za

- předpokladu, že použitá protilátka anti-GST má požadovanou.specifitu. ......- .,

V- - ' tí. . τ' Λ*,» -,··™- “ ” „Jr; í Γτ,!!·.' - ,tí. \·4' . UT. ’-._f. . .· sledovanému typu GST. Tato afinita je spíše vyjádřena v podobě detekovatelné ' koncentrace analytu, nikoliv v podobě specifické afinity Ka při dané konkrétní koncentraci.

Pevná fáze může být umístěna v krytu z plastického materiálu a může být na jednom nebo obou koncích opatřena knotem, který umožňuje chromatografické přesouvání jednotlivých složek v průběhu stanovení.

Biologickou tekutinou podle vynálezu je výhodně žluč, plazma,* sérum nebo moč, zvláště výhodně plazma, sérum nebo žluč.

Biologická tekutina může být ve zředěném nebo nezředěném stavu.

Biologickou tekutinou může být také tkáňový mok, takže způsob podle vynálezu může být použit pro vyhodnocení stavu orgánu před jeho transplantací nebo pro experimentování ex vivo.

Jakje výše uvedeno, žádný takový obecně uznávaný postup pro vyhodnocení stavu dárcovského orgánu dosud neexistuje. Zde je ukázáno, že rychlá detekce GST v tkáňovém moku v provedení podle vynálezu umožňuje • 0 0« 0 · , .0 . 00 . 00 • 0 0. « 0 ·0 0000

0.00 0 0 » 0 0 00

V 00 *»·0 0a 00000 • 00000 0 · * 0000 00 00 000 00 00 zjištění a sledování stavu ex vivo orgánu. Rychlost a kvalita stanovení je nezbytná za takových situací, kdy dárcovský orgán podléhá nepřímé a trvalé ex vivo hypoxii, která je ve svých důsledcích příčinou takového irreversíbilního poškození orgánu, které znemožní použití tohoto orgánu pro transplantaci. Proto každý testovací postup, který umožní zjištění stavu orgánu, bude pro lékaře velkým přínosem.

Biologická tekutina je kontaktována s částicemi značenou protilátkou anti-GST, čímž jsou příslušné GST izoenzymy vázány na tuto částicemi značenou protilátku a to dříve, než jsou kontaktovány s protilátkou, mobilizovanou na pevné fázi. Částice, použitelné pro označení protilátky zahrnují koloidní částice, Částice latexové a částice kovového sólu. Částicemi kovového sólu jsou výhodně částice zlata se středním průměrem v rozmezí 15 až 40 nm. Takovéto částice zlata jsou komerčně k dispozici a jsou nabízeny například fy Janssen Life Sciences Products.

částicemi značená protilátka anli-GST také může být nedílnou součástí vzorkovače jakéhokoliv zařízení pro kontaktování s biologickou tekutinou v souladu s vynálezem.

Použití částicemi značené protilátky anti-GST eliminuje nutnost · · · zesilování signálu. V případě detekce izoenzymů GST pomocí částicemi značené protilátky anti-GST je tedy lato detekce jednoduše založena na přímé interakci protilátka-antigen. Interakcí antigenu s příslušnými částicemi ; ϊ značenými protilátíaimk:popřípadě_sjdžúalÍKicí t^ó^ntCTakcěi je4ošaženo ye^ j výše uvedených situacích pro obsluhu výhodných charakteristik detekce.

Toto vše je dost překvapující, uvážíme-li, že z literatury vyznívá určitá skepse příslušné odborné komunity, dokonce i pokud jde o použití metody

EIAs k detekci GST, a to přesto, že součástí této metody je zesilovací systém, který zlepšuje citlivost detekce.

Jak je výše popsáno je zvláště výhodné při použití částicemi ^rznačených anti-GST IgG, je-li alespoň jedem z obou konců pevné fáze opatřen knotem, neboť tím je umožněno chromalograíicke přesouvání značkovaného IgG. Například při použití nitrocelulózové membrány, která je opatřena knotem jak na vzorkovacím konci tak i na konci horním, bude po nástřiku na membránu umožněno chromatografické přesouvání částicemi zlata značených IgG. Navíc vložení přečištěného GST na membránu nad na membráně imobilizovaný anti-GST IgG by mohlo posloužit jako vnitřní kontrola funkčnosti konjugátu částic zlata, značených anti-GST IgG.

V této spojitosti potom kapalina, která je součástí biologického vzorku resuspenduje částicemi zlata značené anti-GST IgG, přičemž jakýkoliv přítomný izoenzym GST je vázán na značkovanou IgG. Tento komplex ·* «. · · ·· ··^r• » « r Φ · · · V**· • · · * b « ♦ b b ·· ·' · r · · « · · · ·· · · · • · · « * 4 9 9 9 potom migruje ve směru membrány nahoru, kde je nasáván horním kiiotem. Je-li ve vzorku dostatečná koncentrace izoenzymů GST, potom komplex GST-částicemi zlata značená anti-GST IgG je imobilizován na membráně, na které je také vazebný anti-GST IgG. Výsledkem je pozitivní signál, znamenající, že ve vzorku je GST přítomen. Přebytek konjugálu částicemi zlata značených anti-GST a IgG je vázán průběžně (GST) na membránu.

Ukázalo se také, že při použití částicemi značené protilátky pro vázání antigenu v biologickém vzorku je možno stanovení vázaného GST provádět jednoduchým postupem, který je možno stručně popsat jako stanovení typu jediná nádobka.

Vynález také zahrnuje soupravu pro provádění výše popsaného a definovaného způsobu detekce GST, který obsahuje protilátku anti-GST, která je specifická pro určitý GST izoenzym, jak je výše popsáno. , ^v

Λ - i

Zde popsaný způsob stanovení se odlišuje od dříve zmíněných EIAa RIA typů imunostanovení ve dvou hlavních aspektech. Zaprvé do značné míry. pořadím detekce antigenu, neboť ve způsobu podle vynálezu je antigen nejprve navázán na částice značené protilátkou (PL A) a poté je komplex antigen-PL A zachycen imobilizovanou protilátkou za vzniku pozitivního signálů. Nevzniká tedy požadavek na zařazení dalších intermediálních kroků jako je promývání membrány za účelem odstranění nenavázaných složek vzorku (další komponenty moče, .krve nebo perťuzátu), nebo přídavek zesilující reagencie yy^přoušnadněnídtáekcey^ totiž detekován jako takový. , « ' ·

Táto skutečnost ostře kontrastuje s běžnými imunodetekčními \ metodami pro detekci GST (EIA/RIA).Pri těchto metodách je antigen nejprve * kontaktován s imobilizovanou zakotvenou protilátkou a po četných intenzivních promývacích krocích, jejichž účelem je odstranění nenavázaných rušivých složek je konjugát protilátky (enzymem nebo radioaktivním izotopem značená protilátka) přidán ke komplexu antigen-protilátka, což umožňuje detekci vázaného antigenu. Vždy, je-li používán konjugát protilátky s enzymem je nutno přidávat substrát, který umožní detekci vázaného enzymu tím, že se vytvoří barevný produkt.

.*V7Í.y,'—

Jak metodologie imunostanovení, tak metodologie radioimunostanovení vyžaduje drahé a složité zařízení, umožňující vědeckým pracovníkům i technikům v laboratoři interpretovat analytický význam experimentálních dat. Pokud se pro imunodetekci GST použije rychlá metoda v souladu s vynálezem, je konečný výsledek na základě přítomností nebo nepřítomnosti barvy (páska) jednoduše zjistitelný a laiky snadno inťerpretovatelný. . * .

«4 · ·· * ♦ * 4 4 · ·♦ • 4 4 · · *

4 4 9 · · * »44·· ··

4444 44 44 444

Druhý důležitý rozdíl mezi metodou podle vynálezu a známými systémy stanovení již byl zmíněn výše. Jeho podstatou je to, že systém podle vynálezu nevyžaduje pro imunodetekční stanovení GST, na rozdíl od dosavadních metod, zesílení signálu. Citlivost detekce, požadovaná pro rychlé stanovení GST podle vynálezu, vyplývá ze samotného charakteru provedení. Mimo částic značených protilátkou a zakotvené protilátky není požadována žádná další zesilovací reagencie. Všechna ostatní provedení imunodetekce GST využívají nějaký způsob zesílení signálu, a to včetně enzymaticky získaného zabarvení (EIA), fluorescentnťho zesílení za použití Ευ^⁺označených protilátek (TR-IFMA) a široce využívaný způsob zesílení signálu pomocí emise částic z atomových jader (radioaktivní detekce, RIA).

Popis obrázků _t .

Obr. í schematicky znázorňuje rychlý způsob stanovení podle vynálezu za použití částicemi zlata značených anti-alfa-GST IgG a na membráně zakotveného anti-alfa-GST IgG, jak je popsán v příkladech 2 a 3.

Obr. 2 schematicky znázorňuje rychlý způsob stanovení podle vynálezu za použití částicemi žlata značených aňti-alfa-GST IgG a na membráně zakotvené anti-alfa-GST IgG jak je popsán v příkladu 4.

^Příklady provedení vynálezu ; <

Vynález je dále ilustrován na následujících příkladech.'

Příklad 1 ► _:

Čistění alfa-GST a získávání antisera za použití přečištěného alfa-GST •3.

Čistění alfa-GST

Autopsií byla získána lidská játra. Jejich homogenizace byla provedena přidáním 113,2 g jater ke 400 mí homogenizačního pufru při hodnotě pH 7,2, přičemž pufr měl následující složení:

mM fosforečnanu sodného

250 mM cukrosy lmMÉDTA

Následovalo rozrušování buněk pó dobu 2 minul při teplotě 4 °C ve směšovací (Waring). Takto získaný homogenát byl centrifugován při 11 500 g pó dobu 10 ·«' λλ < · » ^r »· ’ΐΛΒΙΛΗίίίΛ • · · · ··· φ · · »·

ΦΦΦΦ Φ * * ΦΦΦΦ;

φ Φφ* Φ · · ΦΦΦΦ · ·**»'·· *· .* •ΦΦΦ Φ· ·* Φ·Φ Φ* *· minut, poté byl supernatant odstraněn a opět centrifugován při 48 000 g po dobu 45 minut. Získaný supernatant (380 ml) byl dialyzován oproti 20 mM Tris-HCl hodnotě při pH 7,8 a teplotě 4 °C. Ihned po skončení dialýzy byl dialyzát vnesen na absorpční kolonu s S-hexyl GSH Sepharosou. Alfa-GST se specificky váže v léto koloně a je posléze eluován 0,3 mM S-hexyl GSH roztokem.

Kontrola kvality byla potom provedena následujícím způsobem:

——·—1* Přečištěný álfa-GST'odpovídá kvalitou’ —-U, ’ < .

2. Přečištěný alfa-GST reagoval s anti-alfa-GST antisérem, nikoliv s anti-píGST nebo anti-mí-GST antisérem.

· ' · . *·

3. Izoelektrická fokusace vykazovala dva pásy při pí 8,5 a 7,8 (izoelektrické body). Přečištěný BjBj (alfa-GST) jeden pás při 8,5. Proto bylo vyvozeno, že , pás s pí 7,8 může být B2, obsahující dimer alfa-GST, ‘ · Ji. _t ^- , r' ' ;·» .

, · ' . . . . 4. _Λ . ' ,· .7 . . _ ®

Příprava antisera proti lidskému alfa-GST

Příprava antisera proti lidskému alfa-GST byla provedena v optimální . , časové periodě u králíků (vnitřní I.D.: Syncor G a H) podle následujícího protokolu, den 1 č? jvi T-'.'? dovedení krevního testu s 5 ml prvotního sera zuchakrálíkarpoté- -····· - _.

smíchání 0,5 ml lidského alfa-GST (100 ugýjako antigenu se stejným objemem úplného Freundova adjuvans. Homogenizace antigenu a adjuvans pro zajištění dokonalé émulgace. Směs byla potom subkutánně mnóhačetně injíkována do předem odchlupených zad králíka.

den 28 ; >

Provedení krevního testu s 5 ml prvotního, sera z ucha králíka, poté smíchání 0,5 ml Udského alfa-GST jako antigenu i(l 00 um) se stejným objemem úplného Freundova adjuvans. Následovala homogenizace antigenu a adjuvans pro zajištění dokonalé emulgace. Směs byla potom subkutánně mnóhačetně injíkována do zad králíka. *, ·;·· '· den 42 ' '.*·-'·

Krevní test u 10 ml krve, odebrané z ucha králíka.

den 56

Aplikace druhé série injekcí králíku jak je popsáno u dne 28. ,

Krevní lesí 10 ml krve králíka, odebrané z ucha. Při dostatečně vysokém litru protilátky byl králík usmrcen a odebráno co největší množství krve.

• · · · · 9 9 9 ' 9 9 99

9·· 9 . 9' 9

9 9 · 9 · 9

9 9 « 9 9

9 « ♦ · 99 den 70

Čistění protilátky ml králičího antisera. bylo uvedeno na kolonu o objemu, 10 mL . naplněnou Protein A Sepharosou, která byla předtím upravena solným pufrovacím roztokem (PBS). Králičí IgG (celkový) se váže na Protein A a je eluován roztokem 0,1 M glycinu při pH 3,0; Čistota IgG se zjistí pomocí SDSPAGE a jeho anti-GST aktivita se stanoví pomocí mikrotitrační destičky, dotblot nebo Western blot analýzou a přímou konjugací na peroxidasu křenu (HRP). . .

Při použití lenkovrslvé mikrotitrační destičky byla koncentrace anti-alfa-GST l^im/ml v 0,1 M roztoku uhličitanu sodného jako pufru při pH 9,6. ' .

Koncentrace konjugátu antůalfa-GST IgG-HRP pro enzymové imunostanovení alfa-GST s jeho detekoyatelností v rozsahu 0 až 50 ng/ml byla nalezena při 77 ng/ml. Tato hodnota naznačuje v ýsokou citlivost protilátky, neboť pro tato enzymová imunostanovení (například EIA pod -obchodníznámkouMukitodíy BiotrinIntemationaiymited_>MountMerrion,_:County Dublin, Ireland a EIAš od jiných firem) by byla běžně pro ostatní konjugáty králičích IgG-HRP požadována jejich koncentrace větší než 700 až 7 000 ng/ml. '

Příklad 2

Stanovení alfa<3ST na principu značení částic

Anti-alfa-GST IgG (0,5 mg/ml v PBS) bylo nasprayováno na proužky nitrocělulózové membrány (3mm x 80mm). Membrána nebyla předem upravena zablokováním aktivních míst, ačkoliv zařazení blokovací procedury by mohlo zlepšil stabilitu pásky a omezil nespecifické vázání.

Protilátky anti-alfa-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 15 a 40 nm) na základě dohody s jejich výrobcem a byly skladovány vé zředovadle, sestávajícím z 0,1 % (hmotn/objem) azidu sodného v 2mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

X

» 9 9 99 » Mil B ♦ . 4» * ·

Ml B · BB ''' ~ ' «« ' ·» -r'·* ti .

9 9 '9 9

9 99.. 9 9

9.9 Β · B b • Β » · ···· 99 99

Stanovení

1. Vzorky obsahující alfa-GST byly smíchány se stanoveným množstvím r

zlatém označeného anti-alfa-CST IgC při použití následujícího zředovadla.

% (hmotn/objem) bovinního sérového albuminu 1 % (hmotn/vol) TWEEN-20 v PBS o hodnotě pH 7,2 —Λ—· —a potom testováno následujícím' Způsobem.^™”................

2., Nitrocelulózová membrána, předupravená pokrytím anti-alfa-GST IgG (v šíři 1-3 mm) byla ponořena do směsi a ponechána zde po dobu 3 až 5 minut. , .

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky (vzorky laž 5): · · vzorek č. 1. alfa-GST o koncentraci 25^ug/ml (25 mg/1) vzorek č. 2. Tři zředěné vzorky moče se známou koncentrací alfa-GST: a) 6,01, b) 18,34 a c) 1,03 ng/ml, popřípadě s pětinásobným předcházejícím zředěním.

* ^vzorek č.3. jtouíte žředóvádló.

vzorekč.4. pí-GST.

vzorek Č. 5. alfa-GST o koncentraci 50 ng/ml (50<úg/l).

Výsledky:

vzorek č. 1. Ke vzniku signálu dochází u roztoku s obsahem 25^im/ml, což znamená, že dokonce při koncentracích 1000 x větších než je běžná koncentrace alfa-GST v močí nedochází ke křížovému efektu (falešně pozitivní stanovení).

vzorky č. 2a-2c. Byl detekován alfa-GST, obsažený ve všech třech vzorcích moče (zředěné 1/5 ve zřeďovacfm pufru), přičemž velikost signálu byla úměrná původní koncentraci alfa-GST, což bylo zjištěno třemi nezávislými pozorovateli.

% , vzorek č. 3. Bylo-li testováno pouze zředovadlo, nedošlo ke vzniku žádného signálu. ·· · · vzorek Č. 4. Nezískán žádný signál.

* 4 ’ “Σ < 4 '44 4 ♦ · 4 «4 4·

4 4 4 · 4 4 < 4 » 4 4 4 · · 4 4 4 .

49*4 44 44 444 vzorek č. 5.

Tento roztok poskytl při stanovení jasný detekovatelný signál.

4.

444 4 4

*. 4 *4 «4

Příklad 3

Stanovení alía-GST na principu značení částic

1. Anti-alfa-GST IgG (monoklonální, Img/ml v PBS) byl imobilizován na proužky nitrocelulózové membrány (0,5 x 4cm).

-*—«•2?» Aktivní místa na membráně byla blokovánainkubacf proužků podobu^O*****^-*“ minut při pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn/objem) mléka zbaveného tuku a 2% (hmotn/objem) polyvinylpyťrolidonú v Trisem pufrovaném solném roztoku o pH 7,4, obsahujícím dále 0,5 % (hmotn/objem) Tweenu 20..

3. Proužky byly vyprány destilovanou vodou a sušeny 1 hodinu při pokojové teplotě. .

. ¹ I

4. Protilátky aňti-alfa-GST byly označeny částicemi zlatá (průměr 40 nm) u t li * , * ‘ . . ¹ jejich výrobce na základě dohody a byly skladovány ve zředovadlě, _:sestávajícím z 0,1% (hmotn/objem) azídu sodného v 2 mM roztoku * tetraborilanu sodného o pH 72·

1*1.

Stanovení / -S V . ' ,ζý?Jzorky obsahující alfa-GST byly smíchány se stanoveným množstvím- —· ΐ ^:;u' Ll zlatém označeného anti-alfa-GST IgO-^zapoužití-Trisem pufrovahého --· solného roztoku o hodnotě pH 7,4, obsahujícího dále 0,5 % (hmotn/objem) Tween20.

' > * ' ' ^ř *

2. Proužek nitrocelulózové membrány, pokrytý anti-alfa-GST IgG byl ponořen do směsi a ponechán zde po dobu 5 minut.

Testování . .

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků:

vzorek č. i alfa-GST v koncentraci 250 ng/ml. vzorek č. 2 pouze zředovadlo.

Výsledky vzorek č.l získán jasně detekovatelný signál vzorek č. 2 u samotného zředovadlo nebyl získán žádný signál ♦ « Φ · i

*' Φ·τ « ♦ φ «φ φ ·- ·► ·, «' . Φ> Φ Φ ·

- · « ·· ·· ··

Principy provedení a interpretace výsledků u příkladů 2 a 3 ; / ’ ’ * , r *

Zlatém označený anli-alfa-GST IgG migruje membránou. Je-li ve směsi obsažen alfa-GST, váže se zlatém označený IgG/alfa-GST komplex na imobilizovaný anti-alfa-GST IgG a vytváří přitom růžově červenou linii (sraženina); Není-li alfá-GST ve směsi obsažen, potom zlatém označený ántialfa-GST IgG migruje k hornímu konci membrány aniž by na ní vytvořil í < ' pozorovatelnou linii (sraženinu). , •Provedeníje takéilustrováno obrázkemďrNatomto obrázkujéObecně je proužek nitrocelulózové membrány označen značkou IQ, přičemž je ponořen do vzorku biologické kapaliny v nádobce H, která obsahuje zlatém označený anti-alfa-GST IgG. Pás (1-3 mm) s imobilizovaným anti-alfá-GST IgG je zobrazen dvojím náčrtem jako 12. Směr proudění Vzórku proužkem IQ ’ nitrocelulózové membrány znázorňuje šipka. Zlatém, označený anti-alfa-GST . · ·. · . -····.·* \· ¹, ·· .ií¹ ’·. .·.··'

IgG se váže na alfá-GST je-li přítomen, migruje meinbránou a je zachycen ;.

imobilizovaným IgG v pásu*i2. Proužek JQ nilróčelůlózové membrány je \ ^:; ponechán v kontaktu še vzorkem 3 až 5 mírnit a poté je vyjmut, což znázorňují:

proužky A a B. Je-li alfa-GST přítomen (kladný výsledek), je možno pozorovat růžovočervenou linii (linie préčipitátu), ják je ukázáno na proužku A; Není-li alfa-GST přítomen (záporný výsledek), nevytvoří se žádná růžovóčervéná linie, což ukazuje proužek B. Zařízení ňa obrázku 1 je Čistě ilustrativní a u komerčního vytvoření by zlatém označený aiiti-álfa-GST býl obeeně upraven “ jako mobilní fáze ná nitrocelulózové membráně v blízkosti jejího konče13 pro nánášeňívzorkú. “ ·,Λ •v~>' ; Mimořádná výhodnost tohoto ry chlého stanovení je zřejmá, neboť celý. postup zahrnuje pouze jediný krok. Přes tuto jednoduchost rychlého stanovení jé nutno zdůraznit, že vynález představuje významné zlepšení oproti _£ konvenčním imunostanovením, založených na použití mikrotitračních . * ;

^J ’ . · *' .......

destiček , . ,

Příklad 4 ;

Stanovení alfa-GST na principu značení částic '

1. Anli-alfa-GSŤ IgG (monoklonální, 1 mg/mlv PBS) byl imobiíizován na proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm) asi 1 cm od koncé proužku.

' “ř^v. > ^s ' 5

2. Vazebná místa proužků byla blokována jejich inkubací po dobu 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn/objem) mléka zbaveného tuku a 2% (hmotn/objem) polyvinylpýrrolidonu v Trisem pufrovaném solném roztoku o hodnotě pH 7,4, Obsahujícím dále 0,5% (hmotn/objem) Twěen 207 ‘ ' • * ·. * • · ·· ««* · ·

3, Proužky byly opláchnuty destilovanou vodou a sušeny 1 hodinu při pokojové teplotě.

·«·' ' «· ·* • · · * * • «·* * · • * · * · · • * * ·. · ···« «· ·« «·· ·· *·

4. Protilátky anti-alfa-CST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u výrobce těchto částic na základě dohody a skladovány ve zředovadle, tvořeném 0,1 % (hmotn/objem) azidu sodného ve 2 mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

5. Zlatém označené protilátky anti-alfa-GST byly naneseny na proužky ~nitrocelulózové membrány přibližně 3 cm od konce proužku?který byl v těchto místech před nanesením zlatém označených protilátek opatřen podkladovou vrstvou, sestávající z 30% (hmotn/objem) cukrózy v destilované vodě.

Stanovení

1. Vzorky obsahující alfa-GST byly. naneseny na proužky nitrocelulózové membrány.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků:

vzorek č. 1: alfa-GST v koncentraci 250 ng/ml za použití Trisem pilířovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zředbvadla a obsahujícím dále 0,5 %. Oúňotň/objem)',Tween20.,. ·.... „- -. - .«>~ vzorek č. 2: alfa-GST v koncentraci 25 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zředbvadla a obsahujícím dále 0,5% (hmotn/objem) Tween 20 vzorek č. 3: pouze zředovadlo vzorek č. 4: dva zředěné vzorky tkáňového moku se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 6716 a b) 29295 ng/ml vzorek č. 5: tři zředěné vzorky sera se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 26,62 b) 119,34 a c) 251,86 ng/mí vzorek č. 6: tři zředěné vzorky žluče se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 7,26 b) 31,93 a c) 68,12 ng/ml.

vzorek č. 7: zředěný vzorek moče se známou koncentrací 88,07 ng/ml alfa-GST před zředěním 1/20.

Výsledky vzorek č. 1: byl získán jasný detekovatelný signál ·© >. ©«© · ©' • * *· ©♦· ♦ b bř ·« © ’ ©« ' ‘ ·« ©i v · b »··' • · « « * ·©·· ·· e · © ¹ © © ·© b »·. ' ·' b » b « b © ·©© ©·· vzorek č. 2: byl získán jasný detekovatelný signál vzorek č. 3: pokud bylo testováno samotné zředovadlo, nebyl získán žádný signál vzorek Č. 4 · v obou vzorcích perfusátu byla detekována přítomnost atfa-GST vzorek č. 5: bez signálu byl vzorek sera, který obsahoval před zředěním 26,62 ng/ml alfa-GST což znamená, že tento způsob není schopen detekovat ***** **«ll '«ll alfa-GST v koncentracích, které odpovídají koncentraci v noímálnfm seru. Byl — - ·· ·· mbf^g-··tUť- -^J- ·- i»·ιίΖίι _ivšak detekován ve vzorcích, obsahujících před zředěním 119,34 a 251,86 ng/ml alfa-GST.

vzorek č, 6: nebyl získán žádný signál u vzorků žluče, které obsahovaly před zředěním 7,26 a 31,93 ng/ml alfa-GST což znamená, že tento způsob není schopen v těchto koncentracích alfa-GSŤ detekovat. U vzorku obsahujícího ' před zředěním 68,12 ng/ml alfa-GST byl tento detekován.

vzorek č. 7: u vzorku moče byl alfa-GST detekován.

♦ .

7Γ ' * >í

Principy provedení a interpretace výsledku u příkladu 4

Během migrace proužkem nitrocelulózové membrány se vzorek směšuje sě zlatém označenými anti-alfa-GST protilátkami, nanesenými na proužek. Je-li ve vzorku přítomen alfa-GST, značené anti-alfa-GST protilátky : sě Vážou na tento alfa-GST, vytvářejíc ta komplex prótilátka-antígěn. Ťěntó / ' komplex polofifmigrujě~priTůžkěm*á Váže seTiááníiTalIřGSTIgGj^ imobílizovaný na proužku, přičemž dochází ke vzniku růžověčervené linie. Není-li alfa-GST ve vzorku obsažen, označené anti-alfa-GST protilátky migrují proužkem, aniž by došlo ke vzniku linie.

Provedení je také schematicky ilustrováno na obrázku 2. Proužek nitrocelulózové membrány je obecně označen 20. Poblíž jeho konce 21 se nachází plocha 22, nesoucí zlatém označené anti-alfa-GST protilátky. Dále je na proužku 2Q plocha 23 ve tvaru pruhu s imobilizovanými anti-alfa-GST IgG protilátkami. Vzorek je na proužek nanesen u konce 21 a migruje proužkem směrem ke konci 24· Tím se vzorek na ploše 22 směšuje se zlatém značenými anti-alfa-GST protilátkami, přičemž se alfa-GST, je-li ve vzorku obsažen, váže na zlatém Značené protilátky za vzniku komplexu protilátka-antigen. Tento komplex se posléze váže na anti-alfa-GST IgG, imobílizovaný na ploše 23, za vzniku růžověčerveného pruhu. Není-li alfa-GST ve vzorku obsažen, nevznikne na ploše 23 žádné zbarvení.

• ·; ; · *jí φ 4γΓ-»Ρ · Φ ‘Φ· ···’],· f ’2l· •l> ‘ tli i · *, ·^: »i »'f· · ·. · ···;· • ·' ») .····' »

Příklad 5

«...

Stanovení pí-GSŤ na principu značení částic .

^{r 11} ’ ^1,1

1. Anti-pf~GST IgG (monoklonální^ 0,6 mg/ml v PBS) byl nakapkován na proužky nitrocělulózové membrány (l_<ul/kapku=0,6_ťAig). Při přípravě membrány nebylo provedeno blokování vazebných míst, přestože zařazení takového kroku by zlepšilostabilitu proužku a omezilo nespecifické vázání.

2. Anti-pí-GST protilátky (králičí pólyklonální) bylý označeny částicemi zlata ^f(pruměF40nm)^ zředovadle, tvořeném 0,1 % (hmotn/objem) azidu sodného ve 2mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2. '

Stanovení ' ;

1. Vzorky obsahující pkGST (každý lO^ul, koncehtracel-SOO^Aig/ml) byly ? smíchány se stanoveným objemem (50 ^1) zlatém žnačené anti-pí-GST IgG a sé140 jíl následujícího zředovádla: > ’ ^Ύ \ / _r · u , \·«, · ϊ’¹·. I * * .» · ' · ' ? t

1% (hmotn/objem) bovinníhó sérového albuminu , \ 1 % (hmoth/objem) Tween 20 J v PBSopH7,2 \ \ •ifi&fcřÉftJ-bs» ;5^=e?«aiťpe5»!S:

ti-¹—

- -fj

2.Na nilrocelulózovOuínembřánubýTňějprvěnánéséhanti-pí-GST IgG⁷(0,6 Jig/kapku), načež byla membrána ponořena ďo směsi a ponechána zde po dobu 3až 15 minut. . / ^; <

Testování » * ·>··' • ’ , Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky.

' . ' ^!1 ¹ * ( Ť t, vzorek č. l 4:· , pouze pí-GST v pufru , vzorekč.5: pouzepufr \ . .

vzorek č. 6-15: moč, žluč a plazma, obsahující pí-GST podle tabulky 1.

Vzorky č. 7 á 8 (moč) a 12 a 13 (plazma) byly dopovány přečištěným pí-GST, vzorky žluče však obsahují přirozený pí-GST.^r '

	v _ ._ ·..' .·. . t	-....... r · -** 'TWT ry . 10 -·ι ·. ' ·Ί · 17 ,* * • ·00	™ >· ,.-»r , ·· -»»--· 0’ í ·“?♦,/·· 0 · 0 ' • · »l · .. * «Vv ♦ » * •, »«.·<.- «ι ς ·' i · ♦ · · 0' , 0 0· . . 0 Λ ·11 0 ' .«Φ 00 , ·0· ·0
Tabulka 1	1		. * Γ·
vzorek č.	počáteční končen.	i- konečná končen.'	obsažené množst. *
	(ng/ml)	(ng/ml) .	(ng) ^:
1	500000	25 000	5 000
2	50000	.2 500	500

llWll.il lil ........IU 50wW«^ ι·ί'»!ΐΙΗΤΗ^4>*ί*Τ ς ·„» .^.,^ťc_.·

4 . ,	1000	50	to
5	0	0	⁰
6 (moč)	30	v	0,3
7 (moč)	1000	, 50 t	io.
8 (moč) ; ·..	.5 000· '	250	·'· :. -50;
I(* tl· -ť t . ' 9 (žiuč)\ <	y. i5o · ···· z	, 7,5 ^{; 7}	• .^:í7l,5'
10 (žluč) 7	>5 000'	>25>Ó7	>50
11 (žluč) ' , 4' ¥ ‘ ·	* 3 730	186,5	37,2
12 (plazma),^: ·	1 000 /	50	10
k „ _k · '1. 13 (plazma) _;	5 000	•250	, 50 -
-T4(plazma)*'^r’^r	íSJ-	'-2567	a, ; '7 ' “* “ *7
15 (plazma) . *	* , ; r.vj .-.:7 no·'	„ 6 :	7' 7i , ' · ψ f ' · j/SX 1,2

y

-:i—ůMř.

t , Λι (50 ^ul vzorek + 50 £il zlatém značený anti-pí-GST IgG a IOO^aiI zředovadlo) ‘

Výsledky * ,T, Výsledky jsou sestaveny do tabulky 2.

-st i' ·

-- v?--,

	- »» #· i »» -Γ, ·- »» · ·;··· · · · · .····. ·“·.· · · ’ · * 1$ ····»»>·· ··· · · »··· »·. · · · »«♦« »» ·· ··· · ·· ·
Tabulka 2
vzorek číslo	výsledek
1	ano ,
2	ano
3	ano
	ano
5	ne
6	ne
•7	ano
8	ano i·»..
9	- - - - ·.·..... ......... ne ' .
10	ano
n	ano
12	ano
13	ano
- , . . Μ ť <ll·	. . ano ...... . .„ .ů . ja...·« -i, ,ri..w* - -'ΐΛίΙ* ·*5··Λ,· ' » né ¹ · T
:· ·-· ''τ ---ít;--· - --¾¹ λ ,7 ⁼ —Ί· ~ J5~ - . -—·
. · * v . _r J i Z výše uvedených výsledků je zřejmé, že pí-GST je ve vzorcích moče, žluče a plazmy detekovatelné. Ukazuje se, že citlivost metody leží okolo koncentrace 50 ng/ml, přičemž je pravděpodobně možné tuto citlivost optimalizací podmínek stanovení zlepšit. Tato koncentrace pí-GST již byla v biologických vzorcích (žluč, tkáňový mok) nalezena.
Bylo zjištěno, že vytvoření komplexu monoklonální-polyklonální protilátka je pro detekci pí-GSTu tohoto stanovení nezbytné. Přesto je možné, že pokud by měla polyklonální protilátka dostatečnou citlivost, dosahoval by ' , tento IgG stejné citlivosti, jako u výše popsaného stanovení alfa-GST. Mimoto

vykazuje stanovení s využitím komplexu monokJonální-monoklonální protilátka také uspokojující citlivost.

.# ·

0« ·* • 0 0

0 00

0 0 • 00 •000 «0 ·« *

,0 *0 -00 00 0 · 0 0 • 0 0 0«

0 0000 ·

0 0 0 • 00 00 00

Přfldad 6

Stanovení pí-GST na principu značení částic

1. Anti-pí-GST IgG (monoklonální, 0,6 mg/ml v PBS) byl imobilizován na proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm) rttfMUb

2. Vazebná místa na proužcích membrány byla blokována inkubací proužků 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn/objem) mléka zbaveného tuku a 2% (hmotn/objem) polyvinylpyrrolidonu v Trisem pufrovaném solném . .......... . MT· -~Γ.-ιί·ιιι roztoku o pH 7,4 a obsahujícím 0,5% (hmotn/objem) Tween 20.

3. Proužky byly opláchnuty destilovanou vodou a vysušeny 1 hodinu při pokojové teplotě.

4. Protilátky anti-pí-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u jejich výrobce na základě dohody a skladovány ve zředovadle, obsahujícím 0,1 % (hmotn/objem) azidu sodného ve 2mM roztoku tetraboritanu sodného o hodnotě pH 7,2.

Stanovení

1. Vzorky obsahující pí-GST byly smíchány se stanoveným objemem zlatém značeného anti-pí-GST IgG za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zředovadla, dále obsahující 0,5 % (hmotn/objem) Tween 20.

2-, Proužek nitrocelulózové membrány s předem naneseným anti-pí-GSTIgG byl ponořen do směsi a ponechán zde 30 minut

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky. vzorek č. 1: pí-GST v koncentraci 250 ng/ml . vzorek č. 2: pouze zředovadlo

Výsledky vzorek č. 1: byl získán jasný detekovatelný signál vzorek č.2: při použití samotného zředovadla nebyl získán žádný signál

Princip stanovení a interpretace výsledků u příkladů 5 a 6

Zlatém značený anti-pí-GST IgG migruje membránou. Je-li ve směsi přítomen pí-GST, váže se zlatém značený IgG/pí-GST komplex na anti-píGST IgG monoklonální, imobilizovaný na membráně za vzniku růžověčervené linie (sraženina). Není-li pí-GST ve vzorku obsažen, potom zlatěn značený anti-pí-GST IgG migruje, menibránou, aniž by vznikla

L ’ ' pozorovatelná barevná linie. t Je zřejmé, že tento způsob stanoveni představuje při srovnání s konvenčními stanoveními pomocí mikrotitrační destičky (nebo membrány)

I významný pokrok, protože zahrnuje pouze jediný krok.

*'· a · ·'- a^,y .··

A , A · . Aγ A.' A fc A j, A ‘ · AAAA'·

A ' · ’ · ·,·*· · A' A A

AAA AA nWM Μ*ιί~Ιι

Příklad Ί

Stanovení pí-GST na principu značení částic

1. Anti-pí-GST IgG (monoklonální, 0,6 mg/ml v PBS) byl tmobilizován ná proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm) ve vzdálenosti přibližně 1 cm od konce proužku. - j v '' . ...... V . ... ... . -7„: ... / . . .... ; ' . \ . .. .

‘ . , ' ., /. ’ . . ,-.· '.,.-' - &

_s . 2.' «Vazebná místa membrány byla blokována inkubací proužků 30 minut pří pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn/objem) mléka zbaveného tuku. a 2% (hmotn/objem) polyviny lpyrrolidonuv Trisem pufrovaném solném roztoku o pH 7,4, obsahujícím dále 0,5 (Hmotn/objem) Tween 20. ' * AT <« ' · ’ ^P , ' ‘ ' '‘τ . ί ' .

3. Proužky byly opláchnuty destilovanou vodou a sušeny 1 hodinu při pokojové teplotě. — .^:·^ ’ ,

-^{5 /}· 4.: -Protilátky anti-pí-GST. byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u jejichvýf obce nazákládéúohodyá by ryskládovánývěžřédovadleý tvořeném ·, 0,1 % (hmotn/objem) azidu sodného v 2 mM roztoků tetraboritanu sodného o ;pH7,2. - .· ''/ -/ . / ·, ..V'.·· . /.,·

5.^ Zlatém značené anti-pí-GST protilátky byly naneseny na proužky nitrocelulózové membrány vé vzdáleností přibližně 3 cm ód konče membrány. Před nanesením zlatém značených protilátek byla lato část proužku opatřena podkladovou vrstvou, tvořenou 30% (hmotn/objem) roztokem cukrózy v destilované vodě. ‘

Stanovení ·

1. Vzorky obsahující pí-GST byly naneseny na proužek nitrocelulózové membrány. ’

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků.

»4- 4 4

4/ · 4' 4 4 »' \> 44 ••4 4 j4,

4 4 ·· 44

5,..,

4¹· 4,»' ff ♦.·♦·' 4· ♦·* i·? · · • '. 4 4 4;, 4 ‘ ·

·. 4 ’» 4 ·: 4 4 4

4444' ·· ·· 4·* vzorek č. 1: Pl-GST v koncentraci 250 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o hodnotě pH 7,4 jako zredovadla, obsahujícím 0,5%< (hmotn/objem) Tween 20.

vzorek č. 2: Pí-GST v koncentraci 25 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o hodnotě pH 7,4 jako zředovadla, obsahujícím 0,5% (hmotn/objem) Tween 20.

.vzorek č. 3: pouze zředbvadlo

Výsledky . . . <

vzorek č. 1 a 2: u obou vzorků byl získán jasný detekovatelnýsignál, přičemž intenzita signálu byla proporciálně závislá na koncentraci pí-GST ve vzorku, vzorek č. 3: u samotného zreďovadla nebyl získán žádný signál l ·,<;·· ? Princip stanoveni a interpretace výsledků u příkladu 7 ' ť , . ' · )l j . . t ' ' ' . · . .· : . ř . . '·** v ,·.* ... ť*

Při migraci nitrocelúíóžovou membránou dochází ke směšování ^Γ »’ φ '* I. ,1 '« > ,-_kf,· -i ' ' , .

testovaného vzorku se zlatém značenými protilátkami anti-pí-GST, které byly naneseny na proužek, je-li ve vzorku přítomen púGST, váže se na značené protilátky anlí-pí-GST za vzniku komplexu protilátka-anligen. Tento komplex se_:poslézevážena anti-pí-GST IgG, imobilizovaný na proužku membrány, za„.

.vznikurůžověčervenéWďN^fíi-pLGST.v^v^rkiLobs^^^igrajeý^^^^g^: značená protilátk3anti-pí-GST proužkem membrány, aniž bý bylo možno ;

* . ' » * « ' *'* - ' ’ --¹. Λ > i f-i·*' <.

pozorovat vznik jakékoliv barevné linie. Princip stanovení tedy odpovídá stanonovení; popsanému ve spojitosti š příkladem 4, jak je ilustrováno na obrázku 2.· ⁴ ... ’ · .

Claims

PATENTOVÉ.NÁROKY

1. Způsob rychlého zjištění stavu orgánu u subjektu, založený na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy (GST) v biologické tekutině, která tyto izoenzymy obsahuje, zahrnuje kontaktování částicemi značené protilátky anti-GST specifické pro uvedený izoenzym se vzorkem biologické tekutiny, přičemž citlivost protilátky je dostačující pro detekci pikomolátních množství izoenzymů a zachycení komplexu částicemi značená protílátka-izoenzym na imobilizované protilátce za vzniku vizuálně detekovatelného signálu. .

MM

Způsob podle nároku 1, ve kterém GST je alfa-GST.

Způsob podle nároku 1, ve kterém GST je pí-GST.
4. Způsob podle nároku 1 až 3, ve kterém protilátka anti-GST je . ’ polyklonální protilátka.
5. Způsob podle nároku 4, ve kterém protilátka anti-GST je anti-alfa- GST protilátka s afinitou dostatečnou pro detekci koncentrací alfa-GST okolo
6,5 ng/ml. * ’ '· ' *

.. ‘

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, ve kterém zakotvená protilátka je vázána na nitrocělulózovou membránu.
7. Způsob podle nároku 6, ve kterém jsou místa nespecifického vázání na nitrocelulózové membráně blokována.
8, Způsob podlé některého z předcházejících nároků, při kterém je biologická tekutina zředěna.

ί qwnri.w—tftwiw '»wyw.;iwi .utru

-55 φ _33.

a ' ·» • ··, , · *. » * · · » • a · · » .« · · »·* « ’ a · · a ·',·.„’ · · · aa·* aa aa ·*· ·» ··
9. Způsob podle některého z nřě<lcházj»jťefnh ηΜΓηΙΓκ vr. IclaarÁm jm .

i, sérum a moč.
10. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, ve kterém je biologickou tekutinou tkáňový mok a způsob je použit pro vyhodnocení stavu dárcovskél orgánu před transpantačí nebo pro experimentování ex vivo.

i i^biíi 111'alaii^MWWWaióYiiiijiiMi . a i.ii.wi 'nnjii ji:

částice zlata se středním průměrem v rozsahu 15 až 40 nm.
12. Souprava pro provádění způsobu podlé některého z nároků 1 až 11, · ' . Ί '' í ^; ’ í ·;*·* · ~.

příslušný izoenzym..