CZ287467B6

CZ287467B6 - Method of quick determination of an organ state based on detection one or more isoenzymes of glutathione S-transferase and apparatus for making the same

Info

Publication number: CZ287467B6
Application number: CZ19973009A
Authority: CZ
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty
Original assignee: Biotrin Intellectual Pty Ltd
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1996-04-02
Publication date: 2000-12-13
Also published as: ES2139347T3; KR19980703302A; CA2217296A1; NO974565L; PL322593A1; EP0819252B1; CN1180411A; HUP9903485A2; CN1100994C; DE69605294T2; RU2154832C2; WO1996031779A1; DE69605294D1; US6080551A; NZ304977A; CA2217296C; CZ300997A3; WO1996031778A1; ATE186986T1; AU696996B2

Description

Vynález se týká analytického postupu pro rychlou detekci a/nebo stanovení glutathion S-transferáz za účelem zjištění stavu orgánu a zařízení k provádění způsobu.

Dosavadní stav techniky

Glutathion S-transferázy (GST) představují multigenní rodinu proteinů, která většinou obsahuje proteinové izoformy alfa, mí, omikron a pí. Tyto proteiny umožňují v organizmu detoxikaci řady xenobiotik (pro organizmus cizorodých látek), a to většinou tak, že dochází ke konjugaci na glutathion. Alfa-GST je hlavní jatemí formou a je v játrech rovnoměrně distribuován. Pí-GST se naopak nachází převážně v epitelámích buňkách, vroubících žlučovody. Podobnou distribuci GST můžeme nalézt také v renální oblasti, kde alfa-GST je lokalizován v proximálních tubulech a výskyt pí-GST je v nefronu omezen na distální oblast tubulů. Z toho je možno vyvozovat, že měření úrovně jak plazmového, tak urinámího GST umožní monitorovat individuální stav jater i ledvin. Až dosud mnozí autoři skutečně používají měření GST k vyhodnocování stupně poškození jater i ledvin u pacientů, kteří podstoupili transplantaci, nebo kteří trpí orgánovým poškozením následkem expozice hepatickým nebo renálním toxinům. (Viz například Trull, A. K. et al., Transplantion (1994) 58, 1345-1351).

Běžně jsou taková měření nejčastěji prováděna za použití radioimunologických stanovení (RIA). V poslední době je však komerčně dostupná řada mikrotitračních desek, umožňujících enzymové imunostanovení (EIAs). Tyto desky pocházejí od firmy Biotrin Intemational Limited, Mount Merrion, County Dublin, Irsko a umožňují měření úrovně alfa- a pí-GST v biologických tekutinách. Tato enzymová imunostanovení doznala nyní mezi odborníky širokého uznání, a to i přes určitou počáteční skepsi (c.f. Beckett, G. J. and Hayes, J. D., Advanced in Clinical Chemistry 1993, (30) str. 325). V současnosti RIA tedy představuje pro mnoho pracovníků v oboru metodu volby. Uvedené dvě metody jsou do určité míry limitovány, neboť obě vyžadují jak specializované vybavení, tak špičkově zaškolený a odpovědný personál, aby získané výsledky byly směrodatné a správné. Přitom jsou obě metody relativně pomalé, neboť jejich provedení od počátku do konce trvá v průměru 2 hodiny nebo i více. Proto byla požadována rychlejší metoda stanovení GST.

Metody pro detekci jednotlivých GST izoenzymů jsou obecně znatelně složitější, jak je zřejmé při použití časově závislého imunofluorometrického stanovení (TR-IFMA). Tiainen P. et al. Clin. Chem. (1996) 42 2, 334-335, porovnání EIA (použit Hepkit, obchodní značka fy Biotrin Internát. Dublin) a TR-IFMA pro alfa-GST. Zjistilo se, že přesnost samotné metody byla větší u Hepkitu než u TR-IFMA. Metoda TR-IFMA je zřejmě vhodnější pro výzkumné práce, protože pro ukončení stanovení je nutno více opakování (4) a více cyklů vymývání. Je proto jasné, že běžný výzkum v oblasti detekce a stanovení množství GST byl zaměřen na vývoj náročnějších a složitějších detekčních systémů, jako je TR-IFMA.

Lidé, kteří se podrobili transplantaci orgánu nebo kteří utrpěli poškození orgánu jako následek expozice hepatitickým či renálním toxinům, musí být pozorně sledováni. To platí zvláště pro osoby po transplantaci orgánu, které se nacházejí v dlouhodobém posttransplantačním léčení imunosupresivy, konkrétně cyklosporinem. Jakmile jsou takové osoby propuštěny z nemocničního ošetřování, musí být trvale sledovány, což v současnosti znamená nutnost častých a pravidelných návštěv příslušné nemocnice, ve které mohou být prováděny potřebné GST a další testy. Proto by bylo nanejvýš žádoucí, aby tyto osoby měli prostředky pro kontrolu svého stavu, což by umožnilo nejen snížit frekvenci jejich návštěv nemocnice, ale, a to je důležitější, tyto

-1CZ 287467 B6 prostředky by při zvýšení úrovně GST poskytly pacientovi i lékaři včasnější indikaci pro rozhodnutí, zdaje nutný lékařský zásah.

Metoda, umožňující rychlejší a jednodušší provedení detekce GST v plazmě, moči a dalších biologických kapalinách, jako je např. žluč, by tedy představovala zřetelnou výhodu tím, že by lékaři umožnila monitorovat jak stav jater, tak stav ledvin postižené osoby bez potřeby časově náročných a drahých nemocničních testů.

Další oblastí, kde je požadováno rychlé provedení testu, je vyhodnocení orgánů před transplantací nebo při experimentech „ex vivo“. V současnosti neexistuje obecně přijatelná metoda pro vyhodnocování dárcovského orgánu před jeho transplantací pacientovi. V důsledku toho je doposavad nemožné na základě znalosti kvality dárcovského orgánu věrohodně předvídat úspěšnost transplantace. Jakákoliv metoda, která by přispěla k předtransplantačnímu vyšetření dárcovského orgánu, by výrazně pomohla při zvýšení úspěšnosti transplantace a umožnila by předejít ztrátě transplantovaného orgánu v důsledku jeho nízké původní kvality nebo nepřijetí tohoto orgánu hostitelským organizmem tím, že by lékaři umožnila včasnější podpůrnou posttransplantační terapii.

Součástí běžných oživovacích pochodů dárcovského orgánu je jeho nasycení nebo proniknutí speciálními reagenciemi (např. pufr „Univerzita Wiskonsin“), které jsou po určité době z tohoto orgánu odstraněny. Tyto reagencie mají za úkol udržet při nízké teplotě (4- 10°C) integritu orgánu „ex vivo“ mimo hostitelský organizmus a současně umožnit před jeho chirurgickým vnesením do hostitelského organizmu zahřátí na tělesnou teplotu (37 °C). Je jasné, že kvalita dárcovského orgánu závisí na řadě faktorů. Takovými faktory je zdravotní stav dárcovského orgánu, délka a teplota „ex vivo“ skladování, způsob zacházení a kvalita obsluhy a kvalita použitých konzervačních reagencií. Poškození dárcovského orgánu, způsobené kterýmkoliv výše uvedeným faktorem, by tedy mohlo být zjištěno vyhodnocením úniku enzymu z orgánu.

Rychlá stanovení jsou známá. Například EP291194B1 popisuje a chrání analytické testovací zařízení a analytickou metodu, používající toto zařízení, které je použitelné v domácnostech, klinicky nebo při chirurgické praxi a které je určeno pro získání rychlé analýzy, přičemž vyžaduje jen minimální zběhlost a svědomitost uživatele. Toto zařízení je zvláště vhodné pro testování gravidity. O možnosti využití GST zde však není žádná zmínka. Koncentrace sledovaných hormonů u gravidních žen, jako například lidského chronického gonádotropinu (HCG), má více stoupající charakter a tedy snadnější detekovatelnost, než koncentrace GST u výše uvedeného typu pacientů, pro které je zvýšená úroveň GST kritická, nebo dokonce předznamenává klinické ohrožení života.

Obtíže při měření enzymové aktivity ve smyslu rozlišení jednotlivých izoforem GST jsou dobře popsány (Beckett G. J. a Hayes, J. D. 1993 supra). Jak je výše uvedeno, další výzkumníci využívají pro stanovení GST RIA (Howie A. F. et al. Clinical Chimica Acta, 1989, 184, 269278) a TR-IFMA (Tiainen P. a Karhi K. K. Clin. Chem. 1994, 40-2,184-189). U každé z těchto technik jde o velice citlivou detekci biomolekul. Ovšem tyto techniky vyžadují specializované vybavení a dobře zaškolený personál. Například pro provádění TR-IFMA je zapotřebí fluorometr s časovou funkcí.

Je tedy požadována taková technika, která bude vhodná pro laické provedení a dostatečně snadná a rychlá pro použití v kritické situaci. Takovou kritickou situací může být posttransplantační poškození jater nebo ledvin, nebo potenciální selhání jater v důsledku předávkování paracetamolu.

-2CZ 287467 B6

Podstata vynálezu

Vynález řeší způsob rychlého určení stavu orgánu u subjektu a je založen na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy (GST) v biologických tekutinách. Tento způsob zahrnuje kontaktování částicemi značené protilátky anti-GST, specifické pro izoenzym, se vzorkem biologické tekutiny, obsahující tento izoenzym, přičemž použitá protilátka má dostatečnou specifickou citlivost pro detekci alespoň pikomolámího množství izoenzymů, načež se komplex částicemi značená protilátka-izoenzym zachytí na imobilizované protilátce za vzniku vizuálně detekovatelného signálu.

Výrazem „rychlého“ je zde míněno, že detekce nebo určení izoenzymů GST je zpravidla dokončeno v době do 30 minut od počátku kontaktu s částicemi značenou anti-GST protilátkou.

Význam formulace „stav orgánu“ zahrnuje poškození orgánu jako následek imunologické nebo toxikologické příhody.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že jedna z největších výhod řešení podle vynálezu spočívá v jeho jednoduchosti, takže může být použito osobami s žádným nebo jen malým zaškolením, které tak mohou sledovat svůj zdravotní stav a/nebo získat rychlou informaci ve výše uvedených kritických situacích.

Je zřejmé, že pro provádění tohoto stanovení nebo pro vyhodnocování a interpretaci získaných výsledků není nutno používat komplikovaná zařízení nebo speciální laboratorní postupy. Tato jednoduchost provedení a interpretace výsledků vyplývá z řady variantních stanovení GST.

GST je s výhodou alfa-GST, pí-GST nebo mí-GST hepatitického nebo renálního původu.

Zvlášť výhodně je GST alfa-GST nebo pí-GST hepatitického nebo renálního původu.

Zvláštním požadavkem jakéhokoliv rychlého stanovení GST je použití protilátky s požadovanou afinitou vůči GST.

Pro alfa-GST se použije polyklonální protilátka s takovou afinitou, aby bylo dosaženo detekovatelné koncentrace alespoň 6,5 ng/ml, což přispívá významně k citlivosti způsobu, jak bude dále popsáno.

Obecně jsou pro provádění způsobu podle vynálezu výhodné jak monoklonální, tak polyklonální protilátky s takovou afinitou, aby detekovaly koncentrace GST izoenzymů alespoň 5 ng/ml.

Protilátkou anti-GST, zachycenou na pevnou fázi, je výhodně polyklonální protilátka, obzvláště polyklonální IgG. V určitých případech, například u pí-GST, je protilátkou, zachycenou na pevné fázi, výhodně protilátka monoklonální.

Výhodně je protilátka anti-GST vázána na nitrocelulózovou membránu známého typu, např. od fy Schleicher a Schuell GmbH - Německo. Tyto membrány mají přirozenou schopnost vázat proteiny, včetně imunoglobulinů. Přesto bude dále uvedeno, že řada pevných nosičů známých „per se“, může být použita jako nosiče pro zachycení protilátky. Takové nosiče jsou v této přihlášce obecně označovány jako pevná fáze.

Nitrocelulózová membrána má velikost pórů výhodně v rozmezí 5 až 10 pm.

Je výhodné, jsou-li místa nespecifického vázání na nitrocelulózové membráně blokována, a to v závislosti na konkrétním charakteru stanovení, jak bude dále popsáno. S výhodou může být blokování nespecifických míst na membráně dosaženo jejím ošetřením bovinním sérovým

-3CZ 287467 B6 albuminem nebo mléčným proteinem, nebo pomocí polymeru, jako je polyvinylpyrrolidon, a to o sobě známým způsobem.

Pevná fáze může mít řadu variantních uspořádání a může zahrnovat i takové typy, které jsou pokryty výše uvedeným patentem EP 0 291 194 za předpokladu, že použitá protilátka anti-GST má požadovanou specifitu.

Specifitou protilátky anti-GST je zde myšlena afinita protilátky ke sledovanému typu GST. Tato afinita je spíše vyjádřena v podobě detekovatelné koncentrace analytu, nikoliv v podobě specifické afinity Ka při dané konkrétní koncentraci.

Pevná fáze může být umístěna v krytu z plastického materiálu a může být na jednom nebo obou koncích opatřena knotem, který umožňuje chromatografícké přesouvání jednotlivých složek v průběhu stanovení.

Biologickou tekutinou podle vynálezu je výhodně žluč, plazma, sérum nebo moč, zvláště výhodně plazma, sérum nebo žluč.

Biologická tekutina může být ve zředěném nebo v nezředěném stavu.

Biologickou tekutinou může být také tkáňový mok, takže způsob podle vynálezu může být použit pro vyhodnocení stavu orgánu před jeho transplantací nebo pro experimentování „ex vivo“.

Jak je výše uvedeno, žádný takový obecně uznávaný postup pro vyhodnocení stavu dárcovského orgánu dosud neexistuje. Zde je ukázáno, že rychlá detekce GST v tkáňovém moku v provedení podle vynálezu umožňuje zjištění a sledování stavu „ex vivo“ orgánu. Rychlost a kvalita stanovení je nezbytná za takových situací, kdy dárcovský orgán podléhá nepřímé a trvalé „ex vivo“ hypoxii, která je ve svých důsledcích příčinou takového irreverzibilního poškození orgánu, které znemožní použití tohoto orgánu pro transplantaci. Proto každý testovací postup, který umožní zjištění stavu orgánu, bude pro lékaře velkým přínosem.

Biologická tekutina je kontaktována s částicemi značenou protilátkou anti-GST, čímž jsou příslušné GST izoenzymy vázány na tuto částicemi značenou protilátku, a to dříve, než jsou kontaktovány s protilátkou, imobilizovanou na pevné fázi. Částice použitelné pro označení protilátky, zahrnují koloidní částice, částice latexové a částice kovového sólu. Částicemi kovového sólu jsou výhodně částice zlata se středním průměrem v rozmezí 15 až 40 nm. Takovéto částice zlata jsou komerčně k dispozici a jsou nabízeny například firmou Janssen Life Sciences Products.

Částicemi značená protilátka anti-GST také může být nedílnou součástí vzorkovače jakéhokoliv zařízení pro kontaktování s biologickou tekutinou v souladu s vynálezem.

Použití částicemi značené protilátky anti-GST eliminuje nutnost zesilování signálu. V případě detekce izoenzymů GST pomocí částicemi značené protilátky anti-GST je tedy tato detekce jednoduše založena na přímé interakci protilátka - antigen. Interakcí antigenu s příslušnými částicemi značenými protilátkami, popřípadě s vizualizací této interakce, je dosaženo ve výše uvedených situacích pro obsluhu výhodných charakteristik detekce.

Toto vše je dost překvapující, uvážíme-li, že z literatury vyznívá určitá skepse příslušné odborné komunity, dokonce i pokud jde o použití metody EIAs k detekci GST, a to přesto, že součástí této metody ne zesilovací systém, který zlepšuje citlivost detekce.

Jak je výše popsáno, je zvláště výhodné při použití částicemi značených anti-GST IgG, je-li alespoň jeden z obou konců pevné fáze opatřen knotem, neboť tím je umožněno chromatografické přesouvání značkovaného IgG. Například při použití nitrocelulózové membrány, která je

-4CZ 287467 B6 opatřena knotem jak na vzorkovacím konci, tak i na konci horním, bude po nástřiku na membránu umožněno chromatografické přesouvání částicemi zlata značených IgG. Navíc vložení přečištěného GST na membránu nad na membráně imobilizovaný anti-GST IgG by mohlo posloužit jako vnitřní kontrola funkčnosti konjugátu částic zlata označujících anti-GST IgG.

V této spojitosti potom kapalina, která je součástí biologického vzorku, resuspenduje částicemi zlata značené anti-GST IgG, přičemž jakýkoliv přítomný izoenzym GST je vázán na značkovanou IgG. Tento komplex potom migruje ve směru membrány nahoru, kde je nasáván horním knotem. Je-li ve vzorku dostatečná koncentrace izoenzymů GST, potom komplex GST-částicemi zlata značená anti-GST IgG je imobilizován na membráně, na které je také vazebný anti-GST IgG. Výsledkem je pozitivní signál, znamenající, že ve vzorku je GST přítomen. Přebytek konjugátu částicemi zlata značených anti-GST a IgG je vázán průběžně (GST) na membránu.

Ukázalo se také, že při použití částicemi značené protilátky pro vázání antigenu v biologickém vzorku je možno stanovení vázaného GST provádět jednoduchým postupem, který je možno stručně popsat jako stanovení typu Jediná nádobka“.

Vynález také zahrnuje soupravu pro provádění výše popsaného a definovaného způsobu detekce GST s pevným nosičem, opatřeným částicemi značenou anti-GST protilátkou, která je specifická pro určitý GST izoenzym, jak je výše popsáno.

Zde popsaný způsob stanovení se odlišuje od dříve zmíněných EIA a RIA typů imunostanovení ve dvou hlavních aspektech. Za prvé do značné míry pořadím detekce antigenu, neboť ve způsobu podle vynálezu je antigen nejprve navázán na částice značené protilátky (PLA) a poté je komplex antigen-PLA zachycen imobilizovanou protilátkou za vzniku pozitivního signálu. Nevzniká tedy požadavek na zařazení dalších intermediálních kroků jako je promývání membrány za účelem odstranění nenavázaných složek vzorku (další komponenty moče, krve nebo perfuzátu), nebo přídavek zesilující reagencie pro usnadnění detekce vázaného komplexu antigen-PLA: tento komplex je totiž detekován jako takový.

Tato skutečnost ostře kontrastuje s běžnými imunodetekčními metodami pro detekci GST (EIA/RIA). Při těchto metodách je antigen nejprve kontaktován s imobilizovanou zakotvenou protilátkou a po četných intenzivních promývacích krocích, jejichž účelem je odstranění nenavázaných rušivých složek, je konjugát protilátky (enzymem nebo radioaktivním izotopem značená protilátka) přidán ke komplexu antigen-protilátka, což umožňuje detekci vázaného antigenu. Vždy, je-li používán konjugát protilátky s enzymem, je nutno přidávat substrát, který umožní detekci vázaného enzymu tím, že se vytvoří barevný produkt.

Jak metodologie imunostanovení, tak metodologie radioimunostanovení vyžaduje drahé a složité zařízení, umožňující vědeckých pracovníkům i technikům v laboratoři interpretovat analytický význam experimentálních dat. Pokud se pro imunodetekci GST použije rychlá metoda v souladu s vynálezem, je konečný výsledek na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti barvy (páska) jednoduše zjistitelný a laiky snadno interpretovatelný.

Druhý důležitý rozdíl mezi metodou podle vynálezu a známými systémy stanovení již byl zmíněn výše. Jeho podstatou je to, že systém podle vynálezu nevyžaduje pro imunodetekční stanovení GST, na rozdíl od dosavadních metod, zesílení signálu. Citlivost detekce, požadovaná pro rychlé stanovení GST podle vynálezu, vyplývá ze samotného charakteru provedení. Mimo částic označujících protilátku a zakotvené protilátky není požadována žádná další zesilovací reagencie. Všechna ostatní provedení imunodetekce GST využívají nějaký způsob zesílení signálu, a to včetně enzymaticky získaného zabarvení (EIA), fluorescenčního zesílení za použití Eu³⁺ označených protilátek (TR-IFMA) a široce využívaný způsob zesílení signálu pomocí emise částic z atomových jader (radioaktivní detekce, RIA).

-5CZ 287467 B6

Popis obrázků

Obr. 1 schematicky znázorňuje rychlý způsob stanovení podle vynálezu za použití částicemi zlata značených anti-alfa-GST IgG a na membráně zakotveného anti-alfa-GST IgG, jak je popsán v příkladech 2 a 3.

Obr. 2 schematicky znázorňuje rychlý způsob stanovení podle vynálezu za použití částicemi zlata značených anti-alfa-GST IgG a na membráně zakotvené anti-alfa-GST IgG, jak je popsán v příkladu 4.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále ilustrován na následujících příkladech.

Příklad 1

Čištění alfa-GST a získávání antiséra za použití přečištěného alfa-GST

Čištění alfa-GST

Autopsií byla získána lidská játra. Jejich homogenizace byla provedena přidáním 113,2 g jater ke 400 ml homogenizačního pufru při hodnotě pH 7,2, přičemž pufr měl následující složení:

mM fosforečnanu sodného,

250 mM cukrózy, mM EDTA.

Následovalo rozrušování buněk po dobu 2 minut při teplotě 4 °C ve směšovači (Waring). Takto získaný homogenát byl centrifugován při 11 500 g po dobu 10 minut, poté byl supematant odstraněn a opět centrifugován při 48 000 g po dobu 45 minut. Získaný supematant (380 ml) byl dialyzován oproti 20 mM Tris-HCl při pH 7,8 a teplotě 4 °C. Ihned po skončení dialýzy byl dialyzát vnesen na absorpční kolonu s S-hexyl GSH Sepharosou. Alfa-GST se specificky váže v této koloně a je posléze eluován 0,3 mM S-hexyl GSH roztokem.

Kontrola kvality byla potom provedena následujícím způsobem:

1. Přečištěný alfa-GST odpovídá kvalitou SDS-PAGE.

2. Přečištěný alfa-GST reagoval s anti-alfa-GST antisérem, nikoliv s anti-pí-GST nebo antimí-GST antisérem.

3. Izoelektrická fokusace vykazovala dva pásy při pl 8,5 a 7,8 (izoelektrické body). Přečištěný BjBi (alfa-GST) jeden pás při 8,5. Proto bylo vyvozeno, že pás s pl 7,8 může být B₂, obsahující dimer alfa-GST.

Příprava antiséra proti lidskému alfa-GST

Příprava antiséra proti lidskému alfa-GST byla provedena v optimální časové periodě u králíků (vnitřní I.D.: Syncor G a H) podle následujícího protokolu.

-6CZ 287467 B6 den 1

Provedení krevního testu s 5 ml prvotního séra z ucha králíka, poté smíchání 0,5 ml lidského alfa-GST (100 pg) jako antigenu se stejným objemem úplného Freundova adjuvans. Homogenizace antigenu a adjuvans pro zajištění dokonalé emulgace. Směs byla potom subkutánně mnohočetně injikována do předem odchlupených zad králíka.

den 28

Provedení krevního testu s 5 ml prvotního séra z ucha králíka, poté smíchání 0,5 ml lidského alfa-GST jako antigenu (100 pm) se stejným objemem úplného Freundova adjuvans. Následovala homogenizace antigenu a adjuvans pro zajištění dokonalé emulgace. Směs byla potom subkutánně mnohačetně injikována do zad králíka.

den 42

Krevní test u 10 ml krve, odebrané z ucha králíka.

den 56

Aplikace druhé série injekcí králíku, jak je popsáno u dne 28.

den 70

Krevní test 10 ml krve králíka, odebrané z ucha. Při dostatečně vysokém titru protilátky byl králík usmrcen a odebráno co největší množství krve.

Čištění protilátky ml králičího antiséra bylo uvedeno na kolonu o objemu 10 ml, naplněnou Protein A Sepharosou, která byla předtím upravena solným pufrovacím roztokem (PBS). Králičí IgG (celkový) se váže na Protein A a je eluován roztokem 0,1 M glycinu při pH 3,0. Čistota IgG se zjistí pomocí SDS-PAGE a jeho anti-GST aktivita se stanoví pomocí mikrotitrační destičky, „dot-blot“ nebo „Western blot“ analýzou a přímou konjugací na peroxidázu křenu (HRP).

Při použití tenkovrstvé mikrotitrační destičky byla koncentrace anti-alfa-GST 1 pm/ml v 0,1 M roztoku uhličitanu sodného jako pufru při pH 9,6.

Koncentrace konjugátu anti-alfa-GST IgG-HRP pro enzymové imunostanovení alfa-GST s jeho detekovatelností v rozsahu 0 až 50 ng/ml byla nalezena při 77 ng/ml. Tato hodnota naznačuje vysokou citlivost protilátky, neboť pro tato enzymová imunostanovení (například EIA pod obchodní známkou Mukit od fy Biotrin Intemational Limited, Mount Merrion, County Dublin, Ireland a EIAs od jiných firem) by byla běžně pro ostatní konjugáty králičích IgG-HRP požadována jejich koncentrace větší než 700 až 7000 ng/ml.

Příklad 2

Stanovení alfa-GST na principu značení částic

Anti-alfa-GST IgG (0,5 mg/ml v PBS) bylo nasprejováno na proužky nitrocelulózové membrány (3 mm x 80 mm). Membrána nebyla předem upravena zablokováním aktivních míst, ačkoliv zařazení blokovací procedury by mohlo zlepšit stabilitu pásky a omezit nespecifické vázání.

-7CZ 287467 B6

Protilátky anti-alfa-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 15 a 40 nm) na základě dohody s výrobcem sólu zlata a byly skladovány ve zřeďovadle, sestávajícím z 0,1% (hmotn./objem) azidu sodného v 2mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující alfa-GST, byly smíchány se stanoveným množstvím zlatém označeného anti-alfa-GST IgG při použití následujícího zřeďovadla.

% (hmotn./objem) bovinního sérového albuminu, % (hmotn./objem) TWEEN-20 v PBS o hodnotě pH 7,2, a potom testováno následujícím způsobem.

2. Nitrocelulózová membrána, předupravená pokrytím anti-alfa-GST IgG (v šíři 1-3) byla ponořena do směsi a ponechána zde po dobu 3 až 5 minut.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky (vzorky 1 až 5):

vzorek č. 1. alfa-GST o koncentraci 25 pg/ml (25 mg/1).

vzorek č. 2. Tři zředěné vzorky moče se známou koncentrací alfa-GST:

a) 6,01, b) 18,34 a c) 1,03 ng/ml, popřípadě s pětinásobným předcházejícím zředěním.

vzorek č. 3. pouze zřeďovadlo.

vzorek č. 4. pí-GST.

vzorek č. 5. alfa-GST o koncentraci 50 ng/ml (50 pig/l).

Výsledky:

vzorek č. 1. Ke vzniku signálu dochází u roztoku s obsahem 25 pm/ml, což znamená, že dokonce při koncentracích 1000 x větších než je běžná koncentrace alfa-GST v moči nedochází ke křížovému efektu (falešně pozitivní stanovení).

vzorky č. 2a-2c. Byl detekován alfa-GST, obsažený ve všech třech vzorcích moče (zředěné 1/5 ve zřeďovacím pufřu), přičemž velikost signálu byl úměrná původní koncentraci alfa-GST, což bylo zjištěno třemi nezávislými pozorovateli.

vzorek č. 3. Bylo-li testováno pouze zřeďovadlo, nedošlo ke vzniku žádného signálu.

vzorek č. 4. Nezískán žádný signál.

vzorek č. 5. Tento vzorek poskytl při stanovení jasný detekovatelný signál.

-8CZ 287467 B6

Příklad 3

Stanovení alfa-GST na principu značení částic

1. Anti-alfa-GST IgG (monoklonální, 1 mg/ml v PBS) byl imobilizován na proužky nitrocelulózové membrány (0,5 x 4cm).

2. Aktivní místa na membráně byla blokována inkubací proužků po dobu 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn./objem) mléka, zbaveného tuku, a 2% (hmotn./objem) polyvinylpyrrolidonu v Trisem pufrovaném solném roztoku o pH 7,4, obsahujícím dále 0,5% (hmotn./objem) Tweenu 20.

3. Proužky byly vyprány destilovanou vodou a sušeny 1 hodinu při pokojové teplotě.

4. Protilátky anti-alfa-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u výrobce sólu zlata na základě dohody a byly skladovány ve zřeďovadle, sestávajícím z 0,1 % (hmotn./objem) azidu sodného v 2 mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující alfa-GST, byly smíchány se stanoveným množstvím zlatém označeného anti-alfa-GST IgG za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o hodnotě pH 7,4, obsahujícího dále 0,5% (hmotn./objem) Tween 20.

2. Proužek nitrocelulózové membrány, pokrytý anti-alfa-GST IgG, ponořen do směsi a ponechán zde po dobu 5 minut.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků:

vzorek č. 1 alfa-GST v koncentraci 250 ng/ml.

vzorek č. 2 pouze zřeďovadlo.

Výsledky vzorek č. 1 získán jasně detekovatelný signál, vzorek č. 2 u samotného zřeďovadla nebyl získán žádný signál.

Principy provedení a interpretace výsledků u příkladů 2 a 3

Zlatém označený anti-alfa-GST IgG migruje membránou. Je-li ve směsi obsažen alfa-GST, váže se zlatém označený IgG/alfa-GST komplex na imobilizovaný anti-alfa-GST IgG a vytváří přitom růžově červenou linii (sraženina). Není-li alfa-GST ve směsi obsažen, potom zlatém označený anti-alfa-GST IgG migruje k hornímu konci membrány, aniž byl na ní vytvořil pozorovatelnou linii (sraženinu).

Provedení je také ilustrováno obrázkem 1. Na tomto obrázku obecně je proužek nitrocelulózové membrány označen značkou 10. přičemž je ponořen do vzorku biologické kapaliny v nádobce 11 která obsahuje zlatém označený anti-alfa-GST IgG. Pás (1-3 mm) s imobilizovaným anti-alfaGST IgG je zobrazen dvojím náčrtem jako 12. Směr proudění vzorku proužkem _10 nitrocelulózové membrány znázorňuje šipka. Zlatém označený anti-alfa-GST IgG se váže na alfa-GST, jeli přítomen, migruje membránou a je zachycen imobilizovaným IgG v pásu 12. Proužek JO

-9CZ 287467 B6 nitrocelulózové membrány je ponechán v kontaktu se vzorkem 3 až 5 minut a poté je vyjmut, což znázorňují proužky A a B. Je-li alfa-GST přítomen (kladný výsledek), je možno pozorovat růžovočervenou linii (linie precipitátu), jak je ukázáno na proužku A. Není-li alfa-GST přítomen (záporný výsledek), nevytvoří se žádná růžovočervená linie, což ukazuje proužek_B. Zařízení na obrázku 1 je čistě ilustrativní a u komerčního vytvoření by zlatém označený anti-alfa-GST byl obecně upraven jako mobilní fáze na nitrocelulózové membráně v blízkosti jejího konce 13 pro nanášení vzorku.

Mimořádná výhodnost tohoto rychlého stanovení je zřejmá, neboť celý postup zahrnuje pouze jediný krok. Přes tuto jednoduchost rychlého stanovení je nutno zdůraznit, že vynález představuje významné zlepšení oproti konvenčním imunostanovením, založeným na použití mikrotitračních destiček.

Příklad 4

Stanovení alfa-GST na principu značení částic

1. Anti-alfa-GST IgG (monoklonální, 1 mg/ml v PBS) byl imobilizován na proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm) asi 1 cm od konce proužku.

2. Vazebná místa proužků byla blokována jejich inkubací po dobu 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2% (hmotn./objem) mléka, zbaveného toku, a 2% (hmotn./objem) polyvinylpyrrolidonu v Trisem pufrovaném solném roztoku o hodnotě pH 7,4, obsahujícím dále 0,5% (hmotn./objem) Tween 20.

3. Proužky byly opláchnuty destilovanou vodou a sušeny 1 hodinu při pokojové teplotě.

4. Protilátky anti-alfa-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u výrobce těchto částic na základě dohody a skladovány ve zřeďovadle, tvořeném 0,1% (hmotn./objem) azidu sodného ve 2 mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

5. Zlatém označené protilátky anti-alfa-GST byly naneseny na proužky nitrocelulózové membrány přibližně 3 cm od konce proužku, který byl v těchto místech před nanesením zlatém označených protilátek opatřen podkladovou vrstvou, sestávající z 30% (hmotn./objem) roztoku cukrózy v destilované vodě.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující alfa-GST, byly naneseny na proužky nitrocelulózové membrány.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků:

vzorek č. 1: alfa-GST v koncentraci 250 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zřeďovadla a obsahujícím dále 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20, vzorek č. 2: alfa-GST v koncentraci 25 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zřeďovadla a obsahujícím dále 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20, vzorek č. 3: pouze zřeďovadlo, vzorek č. 4: dva zředěné vzorky tkáňového moku se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 6716 a b) 29295 ng/ml,

-10CZ 287467 B6 vzorek č. 5: tři zředěné vzorky séra se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 26,62 b) 119,34 a c) 251,86 ng/ml, vzorek č. 6: tři zředěné vzorky žluče se známou koncentrací alfa-GST před zředěním 1/20 a) 7,26 b) 31,93 a c) 68,12 ng/ml, vzorek č. 7: zředěný vzorek moče se známou koncentrací 88,07 ng/ml alfa-GST před zředěním 1/20.

Výsledky vzorek č. 1: byl získán jasný detekovatelný signál, vzorek č. 2: byl získán jasný detekovatelný signál, vzorek č. 3: pokud bylo testováno samotné zřeďovadlo, nebyl získán žádný signál, vzorek č. 4: v obou vzorcích perfusátu byla detekována přítomnost alfa-GST, vzorek č. 5: bez signálu byl vzorek séra, kteiý obsahoval před zředěním 26,62 ng/ml alfa-GST, což znamená, že tento způsob není schopen detekovat alfa-GST v koncentracích, které odpovídají koncentraci v normálním séru. Byl však detekován ve vzorcích, obsahujících před zředěním 119,34 a 251,86 ng/ml alfa-GST, vzorek č. 6: nebyl získán žádný signál u vzorků žluče, které obsahovaly před zředěním 7,26 a 31,93 ng/ml alfa-GST, což znamená, že tento způsob není schopen v těchto koncentracích alfaGST detekovat. U vzorku, obsahujícího před zředěním 68,12 ng/ml alfa-GST, byl tento detekován, vzorek č. 7: u vzorku moče byl alfa-GST detekován.

Principy provedení a interpretace výsledků u příkladu 4

Během migrace proužkem nitrocelulózové membrány se vzorek směšuje se zlatém označenými anti-alfa-GST protilátkami, nanesenými na proužek. Je-li ve vzorku přítomen alfa-GST, značené anti-alfa-GST protilátky se vážou na tento alfa-GST, vytvářejíc tak komplex protilátka-antigen. Tento komplex potom migruje proužkem a váže se na anti-alfa-GST IgG, imobilizovaný na proužku, přičemž dochází ke vzniku růžovočervené linie. Není-li alfa-GST ve vzorku obsažen, označené anti-alfa-GST protilátky migrují proužkem, aniž by došlo ke vzniku linie.

Provedení je také schematicky ilustrováno na obrázku 2. Proužek nitrocelulózové membrány je obecně označen 20. Poblíž jeho konce 21 se nachází plocha 22, nesoucí zlatém označené antialfa-GST protilátky. Dále je na proužku 20 plocha 23 ve tvaru pruhu s imobilizovanými antialfa-GST IgG protilátkami. Vzorek je na proužek nanesen u konce 21 a migruje proužkem směrem ke konci 24. Tím se vzorek na ploše 22 směšuje se zlatém značenými anti-alfa-GST protilátkami, přičemž se alfa-GST, je-li ve vzorku obsažen, váže na zlatém značené protilátky za vzniku komplexu protilátka-antigen. Tento komplex se posléze váže na anti-alfa-GST IgG, imobilizovaný na ploše 23, za vzniku růžovočerveného pruhu. Není-li alfa-GST ve vzorku obsažen, nevznikne na ploše 23 žádné zbarvení.

-11CZ 287467 B6

Příklad 5

Stanovení pí-GST na principu značení částic

1. Anti-pí-GST IgG (monoklonální, 0,6 mg/ml v PBS) byl nakapkován na proužky nitrocelulózové membrány (1 pl/kapku=0,6 μg). Při přípravě membrány nebylo provedeno blokování vazebných míst, přestože zařazení takového kroku by zlepšilo stabilitu proužku a omezilo nespecifické vázání.

2. Anti-pí-GST protilátky (králičí polyklonální) byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u výrobce sólu zlata na základě dohody a byly skladovány ve zřeďovadle, tvořeném 0,1 % (hmotn./objem) azidu sodného ve 2mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující pí-GST (každý 10 μΐ, koncentrace 1-500 μg/ml), byly smíchány se stanoveným objemem (50 μΐ) zlatém značené anti-pí-GST IgG a se 140 μΐ následujícího zřeďovadla:

1% (hmotn./objem) bovinního sérového albuminu,

1% (hmotn./objem) Tween 20, v PBS o pH 7,2, a bylo testováno podle dále popsaného způsobu.

2. Na nitrocelulózovou membránu byl nejprve nanesen anti-pí-GST IgG (0,6 pg/kapku), načež byla membrána ponořena do směsi a ponechána zde po dobu 3 až 15 minut.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky.

vzorek č. 1-4: pouze pí-GST v pufru, vzorek č. 5: pouze pufr, vzorek č. 6-15: moč, žluč a plazma, obsahující pí-GST podle tabulky 1.

Vzorky č. 7 a 8 (moč) a 12 a 13 (plazma) byly dopovány přečištěným pí-GST, vzorky žluče však obsahují přirozený pí-GST.

Tabulka 1

vzorek č.	počáteční končen, (ng/ml)	konečná končen, (ng/ml)	obsažené množst. (ng)
1	500 000	25 000	5000
2	50 000	2500	500
3	5000	250	50
4	1000	50	10
5	0	0	0
6 (moč)	30	1,5	0,3
7 (moč)	1000	50	10
8 (moč)	5000	250	50
9 (žluč)	150	7,5	1,5

-12CZ 287467 B6

Tabulka 1 - pokračování

vzorek č.	počáteční končen, (ng/ml)	konečná končen, (ng/ml)	obsažené množst. (ng)
10 (žluč)	>5000	>250	>50
11 (žluč)	3730	186,5	37,2
12 (plazma)	1000	50	10
13 (plazma)	5000	250	50
14 (plazma)’	1000	250	50
15 (plazma)	120	6	1,2

* (50 μΐ vzorek + 50 μΐ zlatém značený anti-pí-GST IgG a 100 μΐ zřeďovadlo).

Výsledky

Výsledky jsou sestaveny do tabulky 2.

Tabulka 2

vzorek číslo	výsledek
1	ano
2	ano
3	ano
4	ano
5	ne
6	ne
7	ano
8	ano
9	ne
10	ano
11	ano
12	ano
13	ano
14	ano
15	ne

Z výše uvedených výsledků je zřejmé, že pí-GST je ve vzorcích moče, žluče a plazmy detekovatelné. Ukazuje se, že citlivost metody leží okolo koncentrace 50 ng/ml, přičemž je pravděpodobně možné tuto citlivost optimalizací podmínek stanovení zlepšit. Tato koncentrace pí-GST již byla v biologických vzorcích (žluč, tkáňový mok) nalezena.

Bylo zjištěno, že vytvoření komplexu monoklonální-polyklonální protilátka je pro detekci píGST u tohoto stanovení nezbytné. Přesto je možné, že pokud by měla polyklonální protilátka dostatečnou citlivost, dosahoval by tento IgG stejné citlivosti, jako u výše popsaného stanovení alfa-GST. Mimoto vykazuje stanovení s využitím komplexu monoklonální-monoklonální protilátka také uspokojující citlivost.

Příklad 6

Stanovení pí-GST na principu značení částic

1. Anti-pí-GST IgG (monoklonální, 0,6 mg/ml v PBS) byl imobilizován na proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm).

-13CZ 287467 B6

2. Vazebná místa na proužcích membrány byla blokována inkubací proužků 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2 % (hmotn./objem) mléka, zbaveného tuku, a 2 % (hmotn./objem) polyvinylpyrrolidonu v Trisem pufrovaném solném roztoku o pH 7,4 a obsahujícím 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20.

3. Proužky byly opláchnuty destilovanou vodou a vysušeny 1 hodinu při pokojové teplotě.

4. Protilátky anti-pí-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u jejich výrobce na základě dohody a skladovány ve zřeďovadle, obsahujícím 0,1 % (hmotn./objem) azidu sodného ve 2mM roztoku tetraboritanu sodného o hodnotě pH 7,2.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující pí-GST, byly smíchány se stanoveným objemem zlatém značeného antipí-GST IgG za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o pH 7,4 jako zřeďovadla, dále obsahující 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20.

2. Proužek nitrocelulózové membrány s předem naneseným anti-pí-GST IgG byl ponořen do směsi a ponechán zde 30 minut.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden s následujícími vzorky.

vzorek č. 1: pí-GST v koncentraci 250 ng/ml, vzorek č. 2: pouze zřeďovadlo.

Výsledky vzorek č. 1: byl získán jasný detekovatelný signál, vzorek č. 2: při použití samotného zřeďovadla nebyl získán žádný signál.

Princip stanovení a interpretace výsledků u příkladů 5 a 6

Zlatém značený anti-pí-GST IgG migruje membránou. Je-li ve směsi přítomen pí-GST, váže se zlatém značený IgG/pí-GST komplex na anti-pí-GST IgG monoklonální, imobilizovaný na membráně, za vzniku růžověčervené linie (sraženina). Není-li pí-GST ve vzorku obsažen, potom zlatém značený anti-pí-GST IgG migruje membránou, aniž by vznikla pozorovatelná barevná linie.

Je zřejmé, že tento způsob stanovení představuje při srovnání s konvenčními stanoveními pomocí mikrotitrační destičky (nebo membrány) významný pokrok, protože zahrnuje pouze jediný krok.

Příklad 7

Stanovení pí-GST na principu značení částic

1. Anti-pí-GST IgG (monoklonální, 0,6 mg/ml v PBS) byl imobilizován na proužcích nitrocelulózové membrány (0,5 x 4 cm) ve vzdálenosti přibližně 1 cm od konce proužku.

-14CZ 287467 B6

2. Vazebná místa membrány byla blokována inkubací proužků 30 minut při pokojové teplotě v roztoku 2 % (hmotn./objem) mléka, zbaveného tuku, a 2 % (hmotn./objem) polyvinylpyrrolidonu v Trisem pufrovaném solném roztoku o pH 7,4, obsahujícím dále 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20.

4. Protilátky anti-pí-GST byly označeny částicemi zlata (průměr 40 nm) u jejich výrobce na základě dohody a byly skladovány ve zřeďovadle, tvořeném 0,1 % (hmotn./objem) azidu sodného v 2 mM roztoku tetraboritanu sodného o pH 7,2.

5. Zlatém značené anti-pí-GST protilátky byly naneseny na proužky nitrocelulózové membrány ve vzdálenosti přibližně 3 cm od konce membrány. Před nanesením zlatém značených protilátek byla tato část proužku opatřena podkladovou vrstvou, tvořenou 30 % (hmotn./objem) roztokem cukrózy v destilované vodě.

Stanovení

1. Vzorky, obsahující pí-GST, byly naneseny na proužek nitrocelulózové membrány.

Testování

Rychlý způsob stanovení byl proveden u následujících vzorků.

vzorek č. 1: Pí-GST v koncentraci 250 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o hodnotě pH 7,4 jako zřeďovadla, obsahujícím 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20.

vzorek č. 2: Pí-GST v koncentraci 25 ng/ml za použití Trisem pufrovaného solného roztoku o hodnotě pH 7,4 jako zřeďovadla, obsahujícím 0,5 % (hmotn./objem) Tween 20.

vzorek č. 3: pouze zřeďovadlo.

Výsledky vzorek č. 1 a 2: u obou vzorků byl získán jasný detekovatelný signál, přičemž intenzita signálu byla proporciálně závislá na koncentraci pí-GST ve vzorku, vzorek č. 3: u samotného zřeďovadla nebyl získán žádný signál.

Princip stanovení a interpretace výsledků u příkladu 7

Při migraci nitrocelulózovou membránou dochází ke směšování testovaného vzorku se zlatém značenými protilátkami anti-pí-GST, které byly naneseny na proužek. Je-li ve vzorku přítomen pí-GST, váže se na značené protilátky anti-pí-GST za vzniku komplexu protilátka-antigen. Tento komplex se posléze váže na anti-pí-GST IgG, imobilizovaný na proužku membrány, za vzniku růžověčervené linie. Není-li pí-GST ve vzorku obsažen, migruje značená protilátka antipí-GST proužkem membrány, aniž by bylo možno pozorovat vznik jakékoliv barevné linie. Princip stanovení tedy odpovídá stanovení, popsanému ve spojitosti s příkladem 4, jak je ilustrováno na obrázku 2.

Claims

1. Způsob rychlého zjištění stavu orgánu u subjektu, založený na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy (GST) v biologické tekutině, která tyto izoenzymy obsahuje, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování částicemi značené protilátky anti-GST, specifické pro uvedený enzym, se vzorkem biologické tekutiny, která může obsahovat tento izoenzym, přičemž citlivost protilátky je dostačující pro detekci alespoň pikomolámích množství izoenzymů a zachycení částicemi značeného komplexu protilátka - izoenzym na imobilizované protilátce za vzniku vizuálně detekovatelného signálu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že GST je tvořeno alfa-GST (aGST).

3. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se t í m , že GST je tvořeno pí-GST (kGST).

4. Způsob podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, že protilátkou antiGST je polyklonální protilátka.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že protilátkou anti-GST je antiaGST protilátka s afinitou, dostatečnou pro detekci koncentrací aGST v rozsahu až do 6,5 ng/ml.

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zakotvená protilátka je vázána na nitrocelulózovou membránu.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že místa nespecifického vázání na nitrocelulózové membráně jsou blokována.

8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že biologická tekutina je zředěna.

9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím , že biologická tekutina je vybrána ze skupiny, zahrnující žluč, plazmu, sérum a moč.

10. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačující se tím, že pro vyhodnocení stavu dárcovského orgánu před transplantací nebo pro experimentování ex vivo je biologickou tekutinou tkáňový mok.

11. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že částicemi jsou částice zlata se středním průměrem v rozsahu 15 až 40 nm.

12. Zařízení pro provádění způsobu podle některého z předcházejících nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že je tvořeno soupravou s pevným nosičem, opatřeným částicemi značenou anti-GST protilátkou, která je specifická pro příslušný GST izoenzym.