CN106596940A - 一种肿瘤标记物及其在血液中联合检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤标记物及其在血液中联合检测方法，该肿瘤标记物包括MFG‑E8、CA153和CEA；联合检测方法包括：MFG‑E8、CA153和CEA血清水平检测、临界值设定、统计学分析、MFG‑E8、CA153和CEA血清水平三项指标的检测进行比较、阳性率进行比较；MFG‑E8、CA153、CEA血清水平联合检测。目前大多数标记物敏感性较高特异性较低，而特异性较高者敏感性较低，不能很好对肿瘤作出早期诊断和鉴别诊断，本发明为弥补单一肿瘤标志物在临床检测中敏感性和特异性不足，选择MFG‑E8、CA153和CEA联合检测，提高其检测的敏感性、特异性和准确性。

Description

一种肿瘤标记物及其在血液中联合检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种肿瘤标记物及其在血液中联合检测方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性健康，其发病率呈逐年上升趋势。乳腺癌患者的生存率与癌症分期密切相关。资料显示,Ⅰ期患者5年和10年生存率分别为90.9％和83.7％；Ⅱ期分别为78.0％和65.8％；Ⅲ期分别为53.5％和43.0％，而乳腺癌远处转移患者(Ⅳ期)5年生存率(23％)明显低于Ⅲ期乳腺癌患者(79％)和Ⅰ-Ⅱ乳腺癌患者(97％)。因此，早期诊断和发现是提高乳腺癌患者生存率和降低死亡率的关键。乳腺癌的早期诊断是一项包括临床体检、自我检查、影像学检查以及分子生物学检查等多学科的联合诊断。多种诊断方法的适当选择和联合应用可提高乳腺癌的早期诊断率，并对复发监测和评价预后起到重要作用。乳腺癌肿瘤标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性，对指导治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。目前发现与乳腺癌相关的标志物有CEA、CA125、CA153、P53、TPS、乳清蛋白等。这些标志物被广泛应用于乳腺癌的早期诊断和预后评估。但目前大多标志物敏感性高者特异性较低，而特异性高者敏感性较低。使用单一的肿瘤标志物进行评估可能灵敏度、准确性不够高，器官特异性不够强，联合检测常常可弥补单项指标检测的不足。选择对MFG-E8、CEA和CA153进行联合检测来诊断乳腺癌，同时与使用单一肿瘤标志物检测进行比较，以探讨联合检测MFG-E8、CEA和CA153诊断乳腺癌的价值。MFG-E8是一种乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白，乳脂由分化的乳腺上皮细胞合成，然后经膜包被分泌入乳导管腔，包被于脂滴表面的这层膜称为乳脂肪球膜，主要由糖蛋白、蛋白、胆固醇、磷脂构成。乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)又称lactadherin(乳黏素)或SED1，是乳脂肪球膜主要的糖蛋白之一，由乳腺上皮细胞、巨噬细胞、不成熟树突状细胞分泌。MFG-E8有两个功能结构域，一个是氨基末端结构域中有两个表皮生长因子(EGF)样结构域，在第二个的EGF样结构域中包含一个RGD(Arg-Gly-Asp，即精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)整合素结合基序，以外延环形式暴露于EGF样结构域表面。RGD基序可连接αvβ3、αvβ5异二聚体整合素，利于细胞粘附及整合素介导的信号转导；另一个是羧基端的两个与凝血因子V和VIII结构域同源的C样结构域，能结合细胞膜的阴离子磷脂双层。另外，第二个C结构域含有一个氨基的置换，可使MFG-E8与磷脂酰丝氨酸膜有更高度的亲和力[3]。通过以上结构域，MFG-E8参与多种细胞间相互作用以及体机免疫清除过程，包括介导精-卵结合、附睾上皮细胞的维持、肠上皮细胞的维持与修复、促进乳腺分支形态发生、促进血管形成、促进树突状细胞外泌体功能、增强吞噬清除凋亡细胞等等。尽管乳脂肪球表皮生长因子最初发现于乳汁中，但它具体作用还不是很清楚，不过在乳腺癌细胞中发现MFG-E8的分泌量显著提高。Kamran Atabai等研究发现，MFG-E8通过辨认暴露于凋亡上皮细胞表面的丝氨酸与凋亡的上皮细胞结合并促进吞噬细胞对凋亡细胞的清除，缺乏MFG-E8的小鼠乳腺组织凋亡的细胞数增多，乳腺退化和脂肪细胞再生受阻，并随乳腺退化的进行，乳腺组织出现炎症。Newburg等报道MFG-E8不仅能促进凋亡上皮细胞的清除，还可抑制轮状病毒从而对乳腺起保护作用。MFG-E8能通过循环入血，因此我们可在乳腺癌患者血清中检测出较高水平的MFG-E8，联合肿瘤标志物CA153、CEA可能在乳腺癌的早期诊断中具有临床意义。另外有研究已发现MFG-E8在脑胶质瘤组织中呈现出高表达，因此MFG-E8同样可能在乳腺癌组织中呈现高表达。探索MFG-E8在乳腺癌、癌旁组织及良性肿瘤中的表达、探索MFG-E8在不同组织级别乳腺癌中的表达，可能发现MFG-E8在乳腺癌诊断、浸润、转移及评估预后中的意义，提供一个新的预测指标。

综上所述，目前大多标志物敏感性高者特异性较低，而特异性高者敏感性、较低，使用单一的肿瘤标志物进行评估可能灵敏度、准确性不够高，器官特异性不够强。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤标记物及其在血液中联合检测方法，，旨在解决目前大多标志物敏感性高者特异性较低，而特异性高者敏感性、较低，使用单一的肿瘤标志物进行评估可能灵敏度、准确性不够高，器官特异性不够强的问题。

本发明是这样实现的，一种肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括MFG-E8、CA153和CEA。

本发明另一目的在于提供一种肿瘤标记物在血液中联合检测方法，该肿瘤标记物在血液中联合检测方法包括：

MFG-E8、CA153和CEA血清水平检测：CA153血清和CEA血清水平检测采用电化学方法检测，MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法检测；

临界值设定：CA153的临界值为25U/ml，CEA的临界值为3.4μg/l，超过临界值判定为阳性；

统计学分析：数据采取SPSS13.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(x±s)表示，样本间均数比较采用t检验；样本率的比较采用X2检验；

MFG-E8、CA153和CEA血清水平三项指标的检测进行比较；对MFG-E8、CA153、CEA阳性率进行比较。

进一步，所述MFG-E8与CA153、CEA在血液中联合检测前需进行通过临床随机抽样方法，选取未经过放、化疗，无其他重要脏器严重并发症的乳癌组30例，30例乳腺纤维瘤作为良性组，30例正常体检人群作为对照组，备用。

进一步，所述MFG-E8、CA153和CEA血清水平检测前需进行乳癌组、良性组、对照组均清晨空腹采静脉血5ml，迅速分离血清，-20℃保存备测。

进一步，所述CA153血清和CEA血清水平检测采用美国罗氏E170及配套试剂以电化学方法检测CA153和CEA水平，操作方法采用双抗夹心法，所述双抗夹心法为：

生物素化的抗CA153单克隆抗体和钌(Ru)标记的抗CA153单克隆抗体混匀，形成夹心复合物；

加入链霉亲和素包被和微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上；

反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

进一步，所述MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法，检测试剂盒为Cusabio公司产品，酶标仪为Thermo multiskan MK3。

进一步，所述MFG-E8血清水平、CA153血清水平和CEA血清水平比较中MFG-E8、CA153、CEA三项指标的检测结果差异有统计学意义(P<0.01)。

进一步，所述MFG-E8、CA153、CEA阳性率比较中差异有统计学意义，P均<0.05。

本发明提供的MFG-E8、ER在乳腺癌中的阳性表达率均高于其在癌旁乳腺组织中的阳性表达率，差异有统计学意义(P＜0.01)，MFG-E8与ER的表达均与组织学分级(P＝0.000，P＝0.002)有相关性，差异有统计学意义。MFG-E8和ER在乳腺癌组织中的表达呈正相关(r＝0.424，P＝0.001)，但MFG-E8的阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期无显著相关，P＞0.05；

乳腺浸润性导管癌组织中存在MFG-E8的高表达，MFG-E8和ER高表达与乳腺癌的发展有关，联合检测MFG-E8、ER的表达可能为乳腺癌预后的判断及靶向治疗提供实验依据。乳癌组MFGE8、CA153和CEA的阳性率分别是68.4％、55.9％和33.5％，良性组分别为8.1％、5.7％、3.1％，对照组分别为1.1％、0.7％、0.3％，各组间两两比较，差异有统计学意义，P均<0.05。三项指标中MFGE8的敏感性最高(68.4％)，特异性以CEA最高(96.8％)。若三种标志物任意两两联合，均可提高检出敏感性，以MFGE8和CA153联合最高(75.4％)，而特异性略有降低：若三者联合敏感性可以提高到(86.3％)，特异性仍较高(89.1％)，准确性最高(92.2％)，所以MFGE8和CA153、CEA联合检测，可作为诊断乳腺癌的指标，对乳腺癌的早期诊断具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的肿瘤标记物在血液中联合检测方法流程图；

图2是本发明实施例提供的MFG-E8在乳腺癌中的阳性表达(SP×100)图；

图3是本发明实施例提供的MFG-E8在癌旁组织中的阴性表达(SP×100)图；

图4是本发明实施例提供的ER在乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图5是本发明实施例提供的ER在乳腺癌中的阴性表达(En Vision×100)图；

图6是本发明实施例提供的MFG-E8在I级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图7是本发明实施例提供的MFG-E8在I级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×400)图；

图8是本发明实施例提供的MFG-E8在II级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图9是本发明实施例提供的MFG-E8在II级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×400)图；

图10是本发明实施例提供的MFG-E8在III级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图11是本发明实施例提供的MFG-E8在III级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×400)图；

图12是本发明实施例提供的ER在I级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图13是本发明实施例提供的ER在II级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图14是本发明实施例提供的ER在III级乳腺癌中的阳性表达(En Vision×100)图；

图15是本发明实施例提供的ER在乳腺癌中的阴性表达(En Vision×100)图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明MFG-E8在乳腺浸润型导管癌中是否具有高表达；在不同组织分级或不同浸润特性的癌组织中表达有无差异；与其他乳腺癌免疫组化指标是否具有相关性；从而证实MFG-E8能否成为评价乳腺癌预后的新指标。

采用免疫组化方法检测MFG-E8和ER在54例乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平，并结合临床病理因素分析其与乳腺癌发生、发展及浸润、转移的相关性。

收集乳腺癌组织、癌旁组织(≧5cm)及良性肿瘤组织。标本经10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，制成4μm连续切片，经脱蜡，脱苯，水化后，行抗MFG-E8(1:50)免疫组化染色。染色方法按SP法试剂盒说明书步骤进行，以抗体稀释液代替一抗做阴性对照。鼠人MFG-E8多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，一抗稀释浓度为1：50。链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒购自上海长岛公司，抗体稀释液、DAB显色剂购自美国DAKO公司。

乳腺癌组织标本中MFG-E8、ER阳性率分别为83.3％、63％，癌旁组织中阳性率分别为3.7％、29.6％，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。Spearman相关性分析显示ER与MFG-E8在乳腺浸润性导管癌中的表达呈正相关，且MFG-E8的阳性表达与乳腺癌的组织学分级呈正相关(r＝0.593，P＝0.000)，但与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期无明显相关性(P＞0.05)。

血清MFGE8和CA153、CEA联合检测，对乳腺癌的诊断可将敏感性提高到(86.3％)，特异性降低不多(89.1％)，准确性最高(92.2％)，对乳腺癌的早期诊断具有重要的意义。MFG-E8在乳腺浸润性导管癌组织中的表达显著高于癌旁组织，同时其高表达又与乳腺癌的组织学分级显著相关，提示MFG-E8可能成为一种判断乳腺癌进展和预后的新分子标志物。MFG-E8的阳性表达与雌激素受体有显著正相关性。因此提示MFG-E8可能通过细胞内的信号级联反应上调雌激素受体表达，促进乳腺癌细胞加速增殖。因此，以MFG-E8为靶点抑制其基因表达，遏制肿瘤相关巨噬细胞与癌症干细胞的相互作用以及雌激素受体的表达，可能成为肿瘤治疗和减少对抗癌药物的耐药性的重要手段之一。

在本发明中，根据实验数据、组织病理结合临床研究结果，提示MFG-E8可作为乳腺癌诊断、浸润及转移的新的组织学检测指标。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。

一种肿瘤标记物，该肿瘤标记物包括MFG-E8、CA153和CEA。

如图1所示：一种肿瘤标记物在血液中联合检测方法，该肿瘤标记物在血液中联合检测方法包括：

S101：MFG-E8、CA153和CEA血清水平检测：CA153血清和CEA血清水平检测采用电化学方法检测，MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法检测；

S102：临界值设定：CA153的临界值为25U/ml，CEA的临界值为3.4μg/l，超过临界值判定为阳性；

S103：统计学分析：数据采取SPSS13.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(x±s)表示，样本间均数比较采用t检验；样本率的比较采用X2检验；

S104：MFG-E8、CA153和CEA血清水平三项指标的检测进行比较；对MFG-E8、CA153、CEA阳性率进行比较。

所述MFG-E8与CA153、CEA在血液中联合检测前需进行通过临床随机抽样方法，选取未经过放、化疗，无其他重要脏器严重并发症的乳癌组30例，30例乳腺纤维瘤作为良性组，30例正常体检人群作为对照组，备用。

所述MFG-E8、CA153和CEA血清水平检测前需进行乳癌组、良性组、对照组均清晨空腹采静脉血5ml，迅速分离血清，-20℃保存备测。

所述CA153血清和CEA血清水平检测采用美国罗氏E170及配套试剂以电化学方法检测CA153和CEA水平，操作方法采用双抗夹心法，所述双抗夹心法为：

生物素化的抗CA153单克隆抗体和钌(Ru)标记的抗CA153单克隆抗体混匀，形成夹心复合物；

加入链霉亲和素包被和微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上；

反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

所述MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法，检测试剂盒为Cusabio公司产品，酶标仪为Thermo multiskan MK3。

所述MFG-E8血清水平、CA153血清水平和CEA血清水平比较中MFG-E8、CA153、CEA三项指标的检测结果差异有统计学意义(P<0.01)。

所述MFG-E8、CA153、CEA阳性率比较中差异有统计学意义，P均<0.05。

各组MFG-E8、CA153和CEA血清水平比较

MFG-E8、CA153、CEA三项指标的检测结果在乳癌组与良性组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；在乳癌组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。

表1三组标本血清MFG-E8、CA153、CEA的检测结果(x—±s)

各组MFG-E8、CA153、CEA阳性率比较

乳癌组MFG-E8、CA153和CEA的阳性率分别是68.4％、55.9％和33.5％，良性组分别为8.1％、5.7％、3.1％，对照组分别为1.1％、0.7％、0.3％，各组间两两比较，差异有统计学意义，P均<0.05。

MFG-E8、CA153、CEA联合检测对乳腺癌诊断的价值和评估

MFG-E8、CA153和CEA三项标志物在乳腺癌的诊断中，就单项指标检测而言，MFG-E8的敏感性最高(68.4％)，特异性以CEA最高(96.8％)。若三种标志物任意两两联合，均可提高检出敏感性，以MFG-E8和CA153联合最高(75.4％)，而特异性略有降低：若三者联合敏感性可以提高到(86.3％)，特异性降低不多(89.1％)，准确性最高(92.2％)(表2)。

表2乳腺癌组MFG-E8、CA153和CEA的敏感性、特异性和准确性(％)

下面结合实验和应用原理对本发明作进一步描述。

MFG-E8蛋白在血液中表达方法，该MFG-E8蛋白在血液中表达方法包括；

冰冻切片4-8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟；3％H₂O₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2；

5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟,倾去血清，冲洗,滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜；PBS冲洗，5分钟x3次；

滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟；PBS冲洗，5分钟x3次；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟；

PBS冲洗，5分钟x3次；显色剂显色3-15分钟(DAB或NBT/BCIP)；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片；

判断与分析:MFG-E8阳性表达主要为细胞质染色呈棕黄或棕褐色，ER阳性表达主要为细胞核内呈棕黄或棕褐色染色,染色后，10×10高倍视野下，随机选4个视野，计数细胞总数及浆阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分。阳性细胞率≤10％记为1分，阳性细胞率＞10％、≤50％为2分，阳性细胞数＞50％、≤75％为3分，阳性细胞率＞75％为4分；同时，根据染色的强弱程度计分：阴性染色1分，弱染色2分，中等强度染色3分，强染色4分；根据二者的乘积判断结果：≤4分为(-)；＞4且≤8为(+)；＞8且≤12为(++)；＞12且≤16为(+++)。统计分析是(-)为阴性表达，(+)、(++)和(+++)合计为阳性表达；以上结果均至少由两位病理科医生以盲法观察确定；

组织病理学分级标准：

按WHO分级标准，根据腺管形成、核异型性、核分裂数(×100)3方面对每例乳腺癌组织评分，所得总分为Ⅰ-Ⅲ级，3-5分为Ⅰ级，6-7分为Ⅱ级，8-9分为Ⅲ级；

统计学分析:

用SPSS20.0统计分析软件对数据采用χ²检验和Spearman相关分析进行统计学分析处理。

所述在进行MFG-E8蛋白在血液中表达的方法前须进行采集鼠抗人MFG-E8多克隆抗体，一抗稀释浓度为1：50，取链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂盒、抗体稀释液、DAB显色剂；病变标本经10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，制成4μm连续切片，经脱蜡，脱苯，水化后，行常规HE染色和MFG-E8、ER免疫组化染色。

下面结合实验对本发明作进一步描述。

1.实验研究

材料与方法

病例选择

通过临床随机抽样方法，选取2010年3月至2013年1月手术女性患者，经病理确诊为乳腺浸润性导管癌、乳腺纤维瘤的患者及正常体检者各30例。乳癌组30例要求未经过放、化疗，无其他重要脏器严重并发症，正常体检者均未发现乳腺疾病及其他部位肿瘤。所有病例年龄30～65岁，平均年龄46岁。乳腺癌组30例中，根据Scarfff-Bloom-Richardson分级法，进行组织病理分级，其中Ⅰ级(高分化)9例，Ⅱ级(中分化)16例，Ⅲ级(低分化)5例，25例伴有腋窝淋巴结转移。30例乳腺纤维瘤作为良性组，30例正常体检人群作为对照组。分别测定各组血清MFG-E8、CA153和CEA水平。

MFG-E8、CA153和CEA检测

各组患者均清晨空腹采静脉血5ml，迅速分离血清，-20℃保存备测。采用美国罗氏E170及配套试剂以电化学方法检测CA153和CEA水平。操作方法采用双抗夹心法：

(1)生物素化的抗CA153单克隆抗体和钌(Ru)标记的抗CA153单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。

(2)加入链霉亲和素包被和微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。

(3)反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

CEA检测方法与CA153相同。

血清MFG-E8水平检测采用亲和素-生物素ELISA法，检测试剂盒为Cusabio公司产品，酶标仪为Thermo multiskan MK3。

实验操作按试剂盒说明书进行：

(1)设标准孔(0,390,780,1560,3120,6250,12500,25000ng/l)和待测实验组及对照组孔；

(2)分别加样100μl，37℃反应120mins；

(3)弃去液体，甩干；

(4)每孔加生物素标记抗体工作液100μl，37℃反应60mins；洗板3次；

(5)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，37℃反应60mins；洗板5次；

(6)依次每孔加底物90μl，显色，加终止液50μl；

(7)双波长比色测定OD值并制作标准曲线，查出相应的浓度。

临界值设定

CA153的临界值为25U/ml，CEA的临界值为3.4μg/l，超过临界值判定为阳性。

统计学方法

全部数据采取SPSS13.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(x±s)表示，样本间均数比较采用t检验；样本率的比较采用X2检验。

2.结果

2.1各组MFG-E8、CA153和CEA血清水平比较

MFG-E8、CA153、CEA三项指标的检测结果在乳癌组与良性组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；在乳癌组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。

表1三组标本血清MFG-E8、CA153、CEA的检测结果(x—±s)

2.2各组MFG-E8、CA153、CEA阳性率比较

乳癌组MFG-E8、CA153和CEA的阳性率分别是68.4％、55.9％和33.5％，良性组分别为8.1％、5.7％、3.1％，对照组分别为1.1％、0.7％、0.3％，各组间两两比较，差异有统计学意义，P均<0.05。

2.3MFG-E8、CA153、CEA联合检测对乳腺癌诊断的价值和评估

MFG-E8、CA153和CEA三项标志物在乳腺癌的诊断中，就单项指标检测而言，MFG-E8的敏感性最高(68.4％)，特异性以CEA最高(96.8％)。若三种标志物任意两两联合，均可提高检出敏感性，以MFG-E8和CA153联合最高(75.4％)，而特异性略有降低：若三者联合敏感性可以提高到(86.3％)，特异性降低不多(89.1％)，准确性最高(92.2％)(表2)。

表2乳腺癌组MFG-E8、CA153和CEA的敏感性、特异性和准确性(％)

3.目前发现与乳腺癌相关的肿瘤标志物有：乳清蛋白、CEA、CA-153、CA-125、细胞角蛋白20等。这些肿瘤标志物存在于组织细胞体液中，被广泛地应用于乳腺癌的早期诊断及预后判断。但是目前还没有一种灵敏度较高同时具有较高特异性的肿瘤标记物，大多数标记物敏感性较高特异性较低，而特异性较高者敏感性较低，不能很好的对肿瘤作出早期诊断和鉴别诊断。为了弥补单一肿瘤标志物在临床检测中敏感性和特异性不足。选择MFG-E8、CA153和CEA联合检测来诊断乳腺癌，提高其检测的敏感性、特异性和准确性。

MFG-E8是一种存在于多种物种体内的乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白，乳脂由分化的乳腺上皮细胞合成，然后经膜包被分泌入乳导管腔，包被于脂滴表面的这层膜称为乳脂肪球膜，主要由糖蛋白、蛋白、胆固醇、磷脂构成。乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)又称lactadherin(乳黏素)或SED1，是乳脂肪球膜主要的糖蛋白之一，由乳腺上皮细胞、巨噬细胞、不成熟树突状细胞分泌。尽管乳脂肪球因子最初发现乳汁中，但它的具体作用还不是很清楚，不过在乳腺癌细胞中发现MFG-E8的分泌量显著提高。

MFG-E8可通过增强吞噬清除凋亡细胞，其羧基末端C样结构域具有与磷脂特异结合的功能，在吞噬细胞清除凋亡淋巴细胞过程中，当吞噬细胞被激活并遇到凋亡淋巴细胞后即可分泌MFG-E8，这时MFG-E8的C端与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰乙醇胺残基暴露在凋亡细胞的表面，而MFG-E8的N端RGD基序与表达在逐渐增多的吞噬细胞αvβ3或αvβ5整合素相结合。MFG-E8在吞噬细胞和凋亡细胞之间起到桥连作用，加强了凋亡细胞的吞噬清除，对维持机体的内环境稳定起到重要作用。与野生型的动物相比，无MFG-E8分泌动物的活化腹膜巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬功能减弱。另外，由于缺乏足够的清除凋亡细胞的能力，成年无MFG-E8分泌动物可引起自身免疫性疾病，例如脾脏增大、血清中抗DNA抗核蛋白抗体显著增加以及由循环抗体在肾脏的沉积引起的肾小球肾炎等。在系统性红斑狼疮的病人体内，低水平的MFG-E8能加强吞噬作用，高水平对吞噬作用的减弱并呈剂量依赖性，其原因可能是过量的MFG-E8分别与吞噬细胞和凋亡细胞结合，打破了两细胞间MFG-E8的桥连作用，从而引起吞噬障碍进而引起慢性自身免疫性疾病。

MFG-E8的调理素作用能清除动脉粥样硬化患者体内凋亡细胞碎片和致病性斑块，而这些凋亡细胞碎片的吞噬清除对维持机体内环境的稳定及激活抗炎通路是至关重要的。Ait-Oufella H等构建了缺乏MFG-E8的动脉粥样硬化的小鼠模型，发现在无MFG-E8的小鼠中，清除凋亡细胞的能力明显减弱，病变部位的凋亡细胞显著增多，这导致病变面积约有70％的增加。此外，MFG-E8也参与了Alzheimer's病中淀粉样蛋白斑的清除以及乳腺的退化过程中凋亡细胞的清除，MFG-E8缺乏使凋亡细胞不能被有效地清除，导致Alzheimer's病和乳腺疾病的发病率增加。MFG-E8通过辨认暴露于凋亡上皮细胞表面的丝氨酸与凋亡的上皮细胞结合并促进吞噬细胞对凋亡细胞的清除，缺乏MFG-E8的小鼠乳腺组织凋亡的细胞数增多，乳腺退化和脂肪细胞再生受阻，并随乳腺退化的进行，乳腺组织出现炎症。

MFG-E8可表达于健康成人的脉管系统，包括主动脉和下肢肌肉组织，可促进上皮细胞和血管平滑肌细胞的移行和增殖以及促进组织新生血管形成。

MFG-E8作为αvβ3和αvβ5整合子的配体，介导黏着蛋白的聚集以及细胞内的信号级联反应起始过程。因此，通过直接影响内皮血管发生、血管平滑肌的移行和增殖以及通过抗凋亡途径的激活，促进了血管壁的发育和血管重建。在小鼠局部缺血康复模型的研究显示，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的异位表达呈前血管原性，MFG-E8缺陷小鼠的缺血肌肉没有受到VEGF过表达的影响，而野生型小鼠肌肉中MFG-E8过表达可介导VEGF的恢复。这些结果显示，MFG-E8是前血管原性VEGF信号传导的下游效应因子。对这一通路进一步的研究表明，MFG-E8作为αvβ3和/或αvβ5的配体，依次加强AKT磷酸化过程，正是其介导了血管上皮细胞存活和增殖。

MFG-E8mRNA及MFG-E8在血管生成窦和带Rip1-Tag2标签的小鼠肿瘤中是增加的，能以促进血管生成的方式促进肿瘤生长，MFG-E8还能导致肿瘤的侵袭和转移。

MFG-E8不仅能促进凋亡上皮细胞的清除，还可抑制轮状病毒从而对乳腺起保护作用。MFG-E8在乳腺癌细胞表面表达呈上调趋势，其抗体能抑制该蛋白的作用。MFG-E8能通过循环入血，在乳腺癌患者血清中能检测出较高水平，而在正常健康女性及乳腺良性肿瘤患者血清中，MFG-E8水平低，统计学有显著性差异。

单一的肿瘤标志物可能灵敏度、准确性不够高，器官特异性不够强，联合检测可弥补单指标检测的不足。MFG-E8的敏感性最高(68.4％)，特异性以CEA最高(96.8％)。若三种标志物任意两两联合，均提高检出敏感性，以MFG-E8和CA153联合最高(75.4％)，而特异性略有降低：若三者联合敏感性可以提高到(86.3％)，特异性降低不多(89.1％)，准确性最高(92.2％)，所以MFG-E8和CA153、CEA联合检测，可作为诊断乳腺癌的指标，对乳腺癌的早期诊断具有重要的意义。

下面结合病理原理对本发明作进一步描述。

病理原理

1材料与方法

1.1材料

选取2012年8月-2013年7月经病理证实为乳腺浸润性导管癌的组织标本54例。患者均为女性，年龄28岁-75岁，中位年龄55岁，平均为52.6岁；≤50岁者25例，＞50岁者29例。肿瘤直径1cm-6cm，中位直径2.5cm，平均为2.8cm。乳腺癌组织学分级、TNM分期参照WHO及AJCC(2003版本)制订的标准。54例中Ⅰ期4例，Ⅱ期27例，Ⅲ期23例。对照组为距离癌组织5cm以外的正常乳腺组织，并且无炎症反应和残留癌成分。所有病例术前未接受放疗、化疗或免疫治疗。

1.2试剂与方法

鼠抗人MFG-E8多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，一抗稀释浓度为1：50。链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒购自上海长岛公司，抗体稀释液、DAB显色剂购自美国DAKO公司。乳癌标本经10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，制成4μm连续切片，经脱蜡，脱苯，水化后，行常规HE染色和MFG-E8、ER免疫组化染色。染色方法按SP法试剂盒说明书步骤进行，以抗体稀释液代替一抗做阴性对照。阴性对照以PBS替代一抗，阳性对照使用已确定的阳性反应切片。

具体步骤：

(1)冰冻切片4-8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟。

(2)3％H₂O₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2。

(4)5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟,倾去血清，冲洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。

(5)PBS冲洗，5分钟x3次。

(6)滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。

(7)PBS冲洗，5分钟x3次。

(8)滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟。

(9)PBS冲洗，5分钟x3次。

(10)显色剂显色3-15分钟(DAB或NBT/BCIP)

(11)自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

1.3结果的判断与分析

MFG-E8阳性表达主要为细胞质染色呈棕黄或棕褐色，ER阳性表达主要为细胞核内呈棕黄或棕褐色染色。染色后，10×10高倍视野下，随机选4个视野，计数细胞总数及浆阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分。阳性细胞率≤10％记为1分，阳性细胞率＞10％、≤50％为2分，阳性细胞数＞50％、≤75％为3分，阳性细胞率＞75％为4分；同时，根据染色的强弱程度计分：阴性染色1分，弱染色2分，中等强度染色3分，强染色4分；根据二者的乘积判断结果：≤4分为(-)；＞4且≤8为(+)；＞8且≤12为(++)；＞12且≤16为(+++)。统计分析是(-)为阴性表达，(+)、(++)和(+++)合计为阳性表达。以上结果均至少由两位病理科医生以盲法观察确定。

1.4组织病理学分级标准

按WHO分级标准，根据腺管形成、核异型性、核分裂数(×100)3方面对每例乳腺癌组织评分，所得总分为Ⅰ-Ⅲ级，3-5分为Ⅰ级，6-7分为Ⅱ级，8-9分为Ⅲ级。

1.5统计学分析

用SPSS20.0统计分析软件对数据采用χ²检验和Spearman相关分析进行统计学分析处理。

2.结果

2.1 MFG-E8和ER的表达

MFG-E8在乳腺癌组织中的阳性表达如图2，在癌旁组织中的阴性表达如图3。ER在乳腺癌组织中的阳性表达如图4，在癌旁组织中的阴性表达如图5。

54例乳腺癌组织中MFG-E8、ER阳性者分别为45例(83.3％)、34例(63.0％)，癌旁组织阳性者表达为2例(3.7％)、16例(29.6％)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。Spearman秩相关检验分析MFG-E8、ER在乳腺浸润性导管癌中的统计结果是r＝0.424，P＝0.001,显示ER与MFG-E8在乳腺浸润性导管癌中的表达呈正相关见下表。

表MFG-E8与ER在乳腺癌组织中表达的相关性分析(n＝54)

2.2 MFG-E8和ER表达与临床病理因素的关系

组织学分级为1级的乳腺癌标本4例，MFG-E8无阳性表达表达，组织学分级为2-3级的乳腺癌标本50例，MFG-E8阳性表达为44例。MFG-E8在I、II、III级乳腺癌中的阳性表达如图6-11；ER在I、II、III级乳腺癌中的阳性表达分别如图12、13、14；阴性表达如图15。

经统计学分析，两组中MFG-E8的阳性表达比较差异有统计学意义(P＜0.01)；ER在组织学分级为2-3级的乳腺癌组织中的表达阳性率也明显高于1级的乳腺癌组织，其差异有统计学意义(P＜0.01)。Spearman相关性分析显示MFG-E8和ER的阳性表达与乳腺癌的组织学分级呈正相关(r＝0.593，P＝0.000)。而MFG-E8和ER阳性表达均与淋巴结转移、临床分期无明显相关性(P＞0.05)。

下面结合原理分析对本发明作进一步描述。

MFG-E8是一种存在于多种物种内的亲脂性糖蛋白，其最初被发现是它作为一个黏附在乳汁脂肪小球膜表面的镶嵌型外周蛋白。MFG-E8有两个功能结构域，参与多种细胞间相互作用以及体机免疫清除过程。该蛋白能促进乳腺分支形态发生，成人组织新生血管形成和增强吞噬清除凋亡细胞、维持组织动态平衡、防止炎症。

雌性哺乳动物青春期时，乳腺组织开始发育。在分支形态发生(branchingmorphogenesis)过程中，上皮细胞小管开始向外迁移，侵入周围脂肪细胞组成的沉淀，形成乳腺管网。MFG-E8除了在产后乳腺复旧的过程中清除凋亡细胞以外，还参与乳腺的发育。MFG-E8缺乏的雌性小鼠乳腺变小，表现在上皮导管和末端芽(terminal end buds,TEBs)的分支形成作用明显减弱，且发育不良。在乳腺的正常发育过程中，扩张的上皮细胞树来源于构成双层上皮细胞管(即网状上皮细胞和肌上皮细胞)的两种细胞之间相互促进作用，而MFG-E8表达在结合有肌上皮细胞αvβ3/5整合素受体的上皮细胞上，导致促分裂原活化蛋白激酶激活，随后细胞增殖，导管形成。MFG-E8缺失可导致肌上皮细胞上的促分裂原活化蛋白激酶几乎不能激活，并伴有细胞增殖以及分支形态发生减弱。

MFG-E8可表达于健康成人的脉管系统，包括主动脉和下肢肌肉组织，可促进上皮细胞和血管平滑肌细胞的移行和增殖以及促进组织新生血管形成。MFG-E8作为αvβ3和αvβ5整合子的配体，介导黏着蛋白的聚集以及细胞内的信号级联反应起始过程。因此，通过直接影响内皮血管发生、血管平滑肌的移行和增殖以及通过抗凋亡途径的激活，促进了血管壁的发育和血管重建。在小鼠局部缺血康复模型的研究显示，血管内皮细胞生长因子(VEGF)的异位表达呈前血管原性，MFG-E8缺陷小鼠的缺血肌肉没有受到VEGF过表达的影响，而野生型小鼠肌肉中MFG-E8过表达可介导VEGF的恢复。这些结果显示，MFG-E8是前血管原性VEGF信号传导的下游效应因子。对这一通路进一步表明，MFG-E8作为αvβ3和/或αvβ5的配体，依次加强AKT磷酸化过程，正是其介导了血管上皮细胞存活和增殖。

MFG-E8的羧基末端C样结构域具有与磷脂特异结合的功能，在吞噬细胞清除凋亡淋巴细胞过程中，当吞噬细胞被激活并遇到凋亡淋巴细胞后即可分泌MFG-E8，这时MFG-E8的C端与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰乙醇胺残基暴露在凋亡细胞的表面，而MFG-E8的N端RGD基序与表达在逐渐增多的吞噬细胞αvβ3或αvβ5整合素相结合。MFG-E8在吞噬细胞和凋亡细胞之间起到桥连作用，加强了凋亡细胞的吞噬清除，对维持机体的内环境稳定起到重要作用。与野生型的动物相比，无MFG-E8分泌动物的活化腹膜巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬功能减弱。另外，由于缺乏足够的清除凋亡细胞的能力，成年无MFG-E8分泌动物可引起自身免疫性疾病，例如脾脏增大、血清中抗DNA抗核蛋白抗体显著增加以及由循环抗体在肾脏的沉积引起的肾小球肾炎等。在系统性红斑狼疮的病人体内，低水平的MFG-E8能加强吞噬作用，高水平对吞噬作用的减弱并呈剂量依赖性，其原因可能是过量的MFG-E8分别与吞噬细胞和凋亡细胞结合，打破了两细胞间MFG-E8的桥连作用，从而引起吞噬障碍进而引起慢性自身免疫性疾病。最近的研究也显示，MFG-E8的调理素作用能清除动脉粥样硬化患者体内凋亡细胞碎片和致病性斑块，而这些凋亡细胞碎片的吞噬清除对维持机体内环境的稳定及激活抗炎通路是至关重要的。缺乏MFG-E8的动脉粥样硬化的小鼠模型，在无MFG-E8的小鼠中，清除凋亡细胞的能力明显减弱，病变部位的凋亡细胞显著增多，这导致病变面积约有70％的增加。此外，MFG-E8也参与了Alzheimer's病中淀粉样蛋白斑的清除以及乳腺的退化过程中凋亡细胞的清除，MFG-E8缺乏使凋亡细胞不能被有效地清除，导致Alzheimer's病和乳腺疾病的发病率增加。

MFG-E8mRNA及MFG-E8在血管生成窦和带Rip-Tag2标签的小鼠肿瘤中是增加的，能以促进血管生成的方式促进肿瘤生长。MFG-E8在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达显著高于癌旁组织，证实MFG-E8可促进乳腺癌的形成和生长。高表达于乳腺癌细胞中的MFG-E8，可通过不同的途径，促进乳腺癌的生长。一方面，它通过表达在结合有肌上皮ανβ_3/5整合素受体的上皮细胞上，导致促分裂原活化蛋白激酶激活，促进肿瘤细胞增殖。另一方面，MFG-E8通过直接影响内皮血管发生、血管平滑肌的移行和增殖，促进肿瘤新生血管生成，维持肿瘤细胞的能量代谢。

乳腺浸润性导管癌的组织学分级与预后密切相关，组织学分级高的患者多数预后不良。乳腺癌组织中MFG-E8的高表达与组织学分级有正相关性，表明MFG-E8是促进肿瘤侵袭的一种生物标志。其可能机制为：①高表达的MFG-E8通过于肿瘤细胞膜暴露的磷脂酰丝氨酸结构相结合，改变细胞骨架结构及形态，使之利于向前移动、爬行，促进细胞的侵袭，②过量的MFG-E8可分别与吞噬细胞和凋亡细胞结合，打破两细胞间的桥连作用，从而引起吞噬障碍。组织学分级高的乳腺癌组织可过度表达MFG-E8，阻止机体对肿瘤细胞的吞噬清除及炎症反应，增加肿瘤细胞的侵袭力。

肿瘤由增生的肿瘤细胞和基质细胞组成，包括内皮细胞、炎症细胞和成纤维细胞。基质细胞(如成纤维细胞和免疫细胞)在肿瘤的生长过程中发挥重要作用。乳腺癌相关巨噬细胞与乳腺癌的发生发展有着密切联系。

癌症干细胞能特异性刺激肿瘤相关巨噬细胞表达MFG-E8，后者通过STAT3和hedgehog信号通路可诱导癌症干细胞促肿瘤生长作用以及对抗肿瘤药物的抵抗。肿瘤组织中浸润的肿瘤相关巨噬细胞数量与肿瘤的组织学分级有着密切联系。本发明中MFG-E8在乳腺癌中的阳性表达率显著高于其在癌旁乳腺组织中的阳性表达率，并与组织学分级显著相关(P＜0.01)，提示乳腺癌相关巨噬细胞通过分泌MFG-E8的表达促使肿瘤的生长和侵袭。其机制可能为肿瘤细胞分泌多种趋化因子使外周循环中的单核细胞在肿瘤部位聚集形成肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞分泌乳脂球表皮生长因子Ⅷ蛋白促使肿瘤生长。

MFG-E8的氨基末端结构域中含有两个表皮生长因子(EGF)样结构域。EGF可使MAPK活化，活化的MAPK直接磷酸化ERα的丝氨酸-118残基，从而调节ERα的转录活性。本发明中MFG-E8的阳性表达与雌激素受体有显著正相关性(P＜0.01)。因此提示MFG-E8可能通过细胞内的信号级联反应上调雌激素受体表达，促进乳腺癌细胞加速增殖。

综上所述，MFG-E8在乳腺浸润性导管癌组织中的表达显著高于癌旁组织，同时其高表达又与乳腺癌的组织学分级显著相关，提示MFG-E8可能成为一种判断乳腺癌进展和预后的新分子标志物。以MFG-E8为靶点抑制其基因表达，遏制肿瘤相关巨噬细胞与癌症干细胞的相互作用以及雌激素受体的表达，可能成为肿瘤治疗和减少对抗癌药物的耐药性的重要手段之一。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种肿瘤标记物，其特征在于，该肿瘤标记物由MFG-E8、CA153和CEA构成。

2.一种如权利要求1所述的肿瘤标记物在血液中联合检测方法，其特征在于，该肿瘤标记物在血液中联合检测方法包括：

MFG-E8、CA153和CEA血清水平检测：CA153血清和CEA血清水平检测采用电化学方法检测，MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法检测；

临界值设定：CA153的临界值为25U/ml，CEA的临界值为3.4μg/l，超过临界值判定为阳性；

统计学分析：数据采取SPSS13.0统计软件分析，检测结果均采用均数±标准差(x±s)表示，样本间均数比较采用t检验；样本率的比较采用X2检验；

MFG-E8、CA153和CEA血清水平三项指标的检测进行比较；对MFG-E8、CA153、CEA阳性率进行比较。

3.如权利要求2所述的肿瘤标记物在血液中联合检测方法，其特征在于，所述CA153血清和CEA血清水平检测采用美国罗氏E170及配套试剂以电化学方法检测CA153和CEA水平，操作方法采用双抗夹心法，所述双抗夹心法为：

生物素化的抗CA153单克隆抗体和钌标记的抗CA153单克隆抗体混匀，形成夹心复合物；

加入链霉亲和素包被和微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上；

反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

4.如权利要求2所述的肿瘤标记物在血液中联合检测方法，其特征在于，所述MFG-E8血清水平检测采用亲和素-生物素ELISA法，检测试剂盒为Cusabio公司产品，酶标仪为Thermomultiskan MK3。

5.如权利要求2所述的肿瘤标记物在血液中联合检测方法，其特征在于，所述MFG-E8血清水平、CA153血清水平和CEA血清水平比较中MFG-E8、CA153、CEA三项指标的检测结果差异有统计学意义，P<0.01。

6.如权利要求2所述的肿瘤标记物在血液中联合检测方法，其特征在于，所述MFG-E8、CA153、CEA阳性率比较中差异有统计学意义，P均<0.05。