CN105352921A - 一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器制备及其应用，由光子晶体、核酸荧光分子探针和DNA辅助探针构成。光子晶体作为基底，利用DNA的胸腺嘧啶（T）与Hg²⁺间强的亲和作用，使标记有荧光基团ROX的核酸适体与互补序列构成荧光检测体系。光子晶体薄膜是用制得的PS小球，采用垂直沉积自组装的方法，在玻璃片基底上形成的。光子晶体表面喷金，基于Au-S键合作用，在光子晶体表面自组装巯基修饰的标记有荧光基团ROX的核酸适体，其中ROX的发射波长与光子晶体的禁带相符，以达到增强荧光的效果。本发明通过利用光子晶体增强荧光的原理，提高了核酸荧光分子的荧光信号强度，从而提高了传感器检测的灵敏度和准确性。

Description

一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备及应用

技术领域

本发明属于材料制备和分析技术领域，涉及PS小球溶剂挥发自组装制备蛋白石结构光子晶体的方法，尤其涉及一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备及应用。

背景技术

光子带隙是光子晶体最重要的特征。光子晶体具有和半导体相似的结构，只是将半导体中周期变化的原子变成了周期变化的两种不同介电常数的介质材料。和半导体材料一样，介电常数的周期性排列产生了一定的“势场”，当两种材料的介电常数相差足够大时，在电介质界面上会出现布拉格散射，产生光子带隙，能量落在带隙重的光将不能传播。两种介质材料的介电常数比(或折射率比)越大，布拉格散射越强烈，就越有可能出现光子带隙。

重金属汞离子在水体中的污染日益引起人们的关注，其经过食物链的生物放大作用，进入人体积累在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，而且能够引起神经紊乱，甚至引起死亡。另外，Hg²⁺能与酶中的氨基、二巯基、羧基、羟基以及细胞膜内的磷酰基结合，使酶失活，造成功能和结构损伤，从而阻碍细胞的生物活性和正常代谢。传统的痕量Hg²⁺检测方法主要有原子吸收、电感耦合等离子体发射光谱、化学法(沉淀滴定及元素分析等)、电导检测法(电导率测定及电位滴定法)、光谱检测法(荧光及紫外-可见光吸收检测法)和等离子体质谱等技术。然而，这些方法普遍存在检测过程繁琐、仪器昂贵、运行费用高、复杂的样品预处理、需要专业操作人员等缺点，并不适合现场快速监测和连续在线分析。

以光子晶体作为布拉格反射镜面实现荧光材料的固态荧光增强。通过共聚物乳胶微球的竖直沉积自组装，在玻璃基底上制备了具有不同光子禁带的蛋白石(Opal)型光子晶体，选择发射波长在光子禁带范围内的有机荧光染料，由于有机染料的发射波长在光子禁带范围内，当其受到激发时发射的荧光会被光子晶体沿禁带方向反射而不能透过光子晶体，因而有机染料在光晶表面的荧光要比无光晶结构的玻璃表面明显的增强。研究表明，Hg²⁺能介导胸腺嘧啶(T)配对，形成T-Hg²⁺-T复合物，其稳定性比正常的Watson-Crick碱基对还要稳定。基于此特性，通过设计特殊的结构，结合荧光猝灭、纳米金凝聚比色、荧光能量转移、电化学开关等信号传导模式，近年来发展了一系列简单快速的均相检测方法。

发明内容

本发明的目的是：针对检测分析的高灵敏度、高选择性需求，提供了一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法。

本发明的主要目标是构建一个基于光子晶体增强荧光的检测平台，与传统的核酸探针传感器相比，通过信号的放大而实现提高传感器的灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器，由光子晶体、核酸荧光分子探针和互补核酸序列构成。首先合成聚苯乙烯微球或者采用改进的StOber法制备SiO₂球形颗粒，再采用垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体，喷金后修饰核酸荧光分子探针，通过T-Hg²⁺-T的键合作用于互补序列配对，进而达到检测Hg²⁺的目的。包括如下步骤：

1、聚苯乙烯微球的合成

将一定量纯化后的苯乙烯倒入分液漏斗中，依次用NaOH溶液和超纯水洗涤，再用无水氯化钙将残留少量水除去，最后减压蒸馏得到纯化的苯乙烯。室温下，将苯乙烯单体、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠一起加入三口烧瓶，搅拌，水浴加热后滴加过硫酸铵，恒温反应12h,最后用冰浴冷却至室温，结束反应得到乳白色聚苯乙烯微球乳液。

将苯乙烯单体、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸和十二烷基苯磺酸钠加入三口瓶后，调整搅拌转速为650r/min。水浴加热到60℃，20min后将过硫酸铵滴加完毕并调整水浴加热到80℃，恒温反应12h,最后用冰浴冷却至室温。整个反应始终在匀速搅拌下进行，温度控制在(80±2)℃。

Opal光子晶体的组装也可以是不同粒径的SiO₂小球，采用改进的StOber法制备SiO₂球形颗粒，通过调整氨水和无水乙醇的比制备不同粒径的SiO₂，进一步组装成不同禁带的光子晶体，选取相应的荧光染料。

2、垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体

用制得的聚苯乙烯微球乳液，在恒温恒湿箱中于温度50℃-70℃，湿度50-70％的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将乳胶球沉积在处理好的玻璃片基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜。

玻璃片是通过将载玻片切割成1×3.5cm²的玻璃片，然后配制体积比为3:1的浓硫酸(97％)双氧水(30％)混合溶液，将玻璃片浸泡其中10分钟以充分清洗玻璃片表面的污染物(应该向双氧水中注入浓硫酸，此反应非常剧烈，应在通风厨中操作，并戴好防护用具)。之后将酸液回收，用大量去离子水冲洗玻璃片，再分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醇超声清洗10分钟，最后用氮气吹干，放置于干燥、温暖、避光的环境中。

3、利用磁控溅射仪在光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有DNA适配体的溶液中1h,然后用去离子水洗涤N₂干燥。

将100uM的DNA适配体溶液稀释为10nM的DNA，具体做法是：取1uL100uM的DNA适配体溶液加10mL无菌水即得10nM的DNA。

4、将上述光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中40min,然后用去离子水洗涤N₂干燥。

含有Hg²⁺和互补核酸的溶液的配置：

首先将1mM的Hg²⁺溶液稀释为1uM的Hg²⁺溶液，具体做法是：称取固体HgCl₂2.715g,加10mL无菌水即配成1mMHg²⁺溶液，然后取10uL1mMHg²⁺溶液，加10mL无菌水即配成1uMHg²⁺溶液，取1uL100uM互补核酸序列溶液加入已配好1uMHg²⁺溶液中，最终得到10nM的互补核酸序列——Hg²⁺溶液。

本发明的还提供另一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1.SiO₂微球的合成:

1.1将一定量的TEOS与无水乙醇混合，超声得到均匀的TEOS溶液，备用；

1.2将步骤1.1得到的TEOS溶液加入到一定量的氨水和的无水乙醇和水混合的溶液中，磁力搅拌2h,离心洗涤，水洗、乙醇洗各2次，60℃在真空干燥箱中干燥24h～48h即得到SiO₂微球；

步骤2.垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体：

将步骤1制备的聚苯乙烯微球乳液，置于恒温恒湿箱中在温度为50℃-70℃，湿度50-70％的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将聚苯乙烯微球乳沉积在基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜；

步骤3.利用磁控溅射仪在步骤2制备得到的光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有核酸荧光分子探针的溶液中，静置0.8-1.2h,然后用去离子水洗涤，N₂干燥，得到连接有核酸荧光分子探针的光子晶体；

步骤4.将步骤3所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中35-50min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器。

进一步，所述的基底为玻璃、石英或云母中的一种。

进一步，所述步骤3中，所述核酸荧光分子探针通过5＇端修饰的巯基(SH)连接在喷有金的光子晶体表面。

进一步，所述步骤4中，所述光子晶体上的核酸荧光分子探针含有25个碱基，从3＇端开始的10、13、16碱基位点为胸腺嘧啶(T)与含有Hg²⁺和互补核酸5＇端开始的4、7、10碱基位点胸腺嘧啶(T)通过T-Hg²⁺-T键合完全碱基互补。

进一步，所述TEOS与无水乙醇的体积比为1:10，所述氨水、无水乙醇和水的体积比为1:3-7：1-5。

上述制备的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器在汞离子荧光检测中应用。

5、通过荧光发射光谱图得到其荧光强度曲线示意图，荧光强度达到200。

在不同禁带的光子晶体上修饰核酸荧光分子探针(其中荧光染料的发射波长在其中一种光子晶体的禁带范围内)，比较其荧光发射光谱图上的荧光强度。

本发明与现有技术相比，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1、通过光子晶体增强荧光的效果，增强了荧光探针检测信号，提高了检测的灵敏性，减小了最低检测浓度和检测限。

2、结合单碱基错配原理和与胸腺嘧啶(T)间高特异的亲和作用设计传感器，具有高的检测选择性，可在100倍高浓度杂离子存在下检测Hg²⁺。

3、利用Au-S自组装原理制备传感界面，简单、重复性好。

4、构建了一个基于光子晶体增强荧光的检测平台，不仅可以检测金属离子，也可以检测病毒及DNA、RNA等核酸类物质。

附图说明

图1是本发明基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器示意图。

图2-3是本发明实施例2所制备的光子晶体的禁带波长。

图4-5是本发明实施例2所制备的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的荧光发射光谱(图4光子晶体禁带在646-656之间，图5光子晶体禁带在798-799之间)。

具体实施方式

下面结合具体是实施例对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1

1)采用改进的StOber法制备SiO₂球形颗粒，通过调整氨水和无水乙醇的比制备不同粒径的SiO₂。将一定量的正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇混合，超声得到均匀的TEOS溶液，将上述TEOS溶液加入到一定量的氨水和不同配比的无水乙醇和水混合的溶液中，磁力搅拌2h,离心洗涤(水洗、乙醇洗各2次)，60℃在真空干燥箱中干燥24h即得到SiO₂微球。实验参数如下表：

2)垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体

将玻璃片分别于丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗20min,然后置于混合溶液(H₂SO₄和H₂O₂的体积比为3:1)浸泡一夜。用去离子水冲洗玻璃片,经氮气吹干后垂直浸入SiO₂胶体球溶液中,在恒温恒湿箱中于60℃自然干燥。

3)利用磁控溅射仪在光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有DNA适配体的溶液中1h,然后用去离子水洗涤N₂干燥。所用核酸荧光分子探针为单链DNA，荧光基团为RhodamineB，核酸荧光分子探针的DNA链为(5＇端至3＇端)：

SH-CCTACTAATGATAAACCACTGGTGAATCGCTCAAGTCAGTAGTAGG-RhodamineB

4)将3)所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中40min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，

含有Hg²⁺和互补核酸的溶液的配置：

首先将1mM的Hg²⁺溶液稀释为1uM的Hg²⁺溶液，具体做法是：称取固体HgCl₂2.715g,加10mL无菌水即配成1mMHg²⁺溶液，然后取10uL1mMHg²⁺溶液，加10mL无菌水即配成1uMHg²⁺溶液，取1uL100uM互补核酸序列溶液加入已配好1uMHg²⁺溶液中，最终得到10nM的互补核酸序列——Hg²⁺溶液。

所用互补核酸序列为(3＇端至5＇端)：

CGCTGCTCTTCAC

5)通过荧光发射光谱图得到其荧光强度。

实施例2

1)聚苯乙烯微球的合成

将一定量纯化后的苯乙烯倒入分液漏斗中，依次用NaOH溶液和超纯水洗涤，再用无水氯化钙将残留少量水除去，最后减压蒸馏得到纯化的苯乙烯。室温下，将苯乙烯单体、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠一起加入三口烧瓶搅拌转速为630/min，水浴加热至50℃，保温15min后将过硫酸铵滴加完毕并调整水浴加热到75℃,采用冰浴冷却至室温,最后用冰浴冷却至室温，结束反应得到乳白色聚苯乙烯微球乳液，其中，所述苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠的体积比为20:1:1:100:123；

2)垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体

用制得的聚苯乙烯微球乳液，在恒温恒湿箱中于温度50℃℃，湿度50的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将乳胶球沉积在处理好的玻璃片基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜。

3)利用磁控溅射仪在光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有DNA适配体的溶液中1h,然后用去离子水洗涤N₂干燥。

所用核酸荧光分子探针为单链DNA，荧光基团为ROX，核酸荧光分子探针的DNA链为(5＇端至3＇端):

SH-CAGTCTGCGTCGTGATGTGAGACTG-ROX

4)将3)所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中40min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，

含有Hg²⁺和互补核酸的溶液的配置：

首先将1mM的Hg²⁺溶液稀释为1uM的Hg²⁺溶液，具体做法是：称取固体HgCl₂2.715g,加10mL无菌水即配成1mMHg²⁺溶液，然后取10uL1mMHg²⁺溶液，加10mL无菌水即配成1uMHg²⁺溶液，取1uL100uM互补核酸序列溶液加入已配好1uMHg²⁺溶液中，最终得到10nM的互补核酸序列——Hg²⁺溶液。

所用互补核酸序列为(3＇端至5＇端)：

CGCTGCTCTTCAC

5)通过荧光发射光谱图得到其荧光强度。

实施例3

1)聚苯乙烯微球的合成

将一定量纯化后的苯乙烯倒入分液漏斗中，依次用NaOH溶液和超纯水洗涤，再用无水氯化钙将残留少量水除去，最后减压蒸馏得到纯化的苯乙烯。室温下，将苯乙烯单体、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠一起加入三口烧瓶搅拌转速为660/min，水浴加热至50℃，保温15min后将过硫酸铵滴加完毕并调整水浴加热到85℃,采用冰浴冷却至室温,最后用冰浴冷却至室温，结束反应得到乳白色聚苯乙烯微球乳液，其中，所述苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠的体积比为20:1:1:100:123；

2)垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体

用制得的聚苯乙烯微球乳液，在恒温恒湿箱中于温度70℃，湿度70％的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将乳胶球沉积在处理好的玻璃片基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜。

3)利用磁控溅射仪在光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有DNA适配体的溶液中1h,然后用去离子水洗涤N₂干燥。

所用核酸荧光分子探针为单链DNA，荧光基团为ROX，核酸荧光分子探针的DNA链为(5＇端至3＇端):

SH-CAGTCTGCGTCGTGATGTGAGACTG-ROX

4)将3)所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中40min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，

含有Hg²⁺和互补核酸的溶液的配置：

首先将1mM的Hg²⁺溶液稀释为1uM的Hg²⁺溶液，具体做法是：称取固体HgCl₂2.715g,加10mL无菌水即配成1mMHg²⁺溶液，然后取10uL1mMHg²⁺溶液，加10mL无菌水即配成1uMHg²⁺溶液，取1uL100uM互补核酸序列溶液加入已配好1uMHg²⁺溶液中，最终得到10nM的互补核酸序列——Hg²⁺溶液。

所用互补核酸序列为(3＇端至5＇端)：

CGCTGCTCTTCAC

5)通过荧光发射光谱图得到其荧光强度。

Claims (8)

1.一种基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于：该传感器由光子晶体(1)、核酸荧光分子探针(2)和DNA辅助探针(3)构成，基于Au-S键合作用，在喷有金的光子晶体表面自组装巯基修饰的标记有荧光基团ROX的核酸适体，由于金对荧光的猝灭作用，起初ROX处于猝灭状态，利用DNA的胸腺嘧啶（T）与Hg²⁺间强的亲和作用，核酸适体与互补序列配对后，荧光基团ROX远离金表面，荧光猝灭作用减弱，利用光子晶体布拉格反射性能，提高荧光检测的灵敏度的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器,所述DNA辅助探针(3)包括汞离子和互补核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1.聚苯乙烯微球的合成：

1.1将一定量纯化后的苯乙烯倒入分液漏斗中，依次用NaOH溶液和超纯水洗涤，再用无水氯化钙将残留少量水除去，最后减压蒸馏得到纯化的苯乙烯；

1.2室温下，将纯化的苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠，一起加入三口烧瓶调整搅拌转速为630-660r/min，水浴加热至50-70℃，保温15-25min后将过硫酸铵滴加完毕并调整水浴加热到75-85℃,采用冰浴冷却至室温，结束反应得到乳白色聚苯乙烯微球乳液，其中，所述苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯溶液、丙烯酸、超纯水和十二烷基苯磺酸钠的体积比为20:1:1:100:123；

步骤2.垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体：

将步骤1制备的聚苯乙烯微球乳液，置于恒温恒湿箱中在温度为50℃-70℃，湿度50-70%的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将聚苯乙烯微球乳沉积在基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜；

步骤3.利用磁控溅射仪在步骤2制备得到的光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有核酸荧光分子探针的溶液中，静置0.8-1.2h,然后用去离子水洗涤，N₂干燥，得到连接有核酸荧光分子探针的光子晶体；

步骤4：将步骤3所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中35-50min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，得到基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器。

3.根据权利要求1所述的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于，

步骤1.SiO₂微球的合成：

1.1将一定量的TEOS与无水乙醇混合，超声得到均匀的TEOS溶液，备用；

1.2将步骤1.1得到的TEOS溶液加入到一定量的氨水和的无水乙醇和水混合的溶液中，磁力搅拌2h，离心洗涤，水洗、乙醇洗各2次，60℃在真空干燥箱中干燥24h～48h即得到SiO₂微球；

步骤2.垂直沉积自组装法合成Opal光子晶体：

将步骤1制备的聚苯乙烯微球乳液，置于恒温恒湿箱中在温度为50℃-70℃，湿度50-70%的条件下，采用垂直沉积自组装的方法，将聚苯乙烯微球乳沉积在基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜；

步骤3.利用磁控溅射仪在步骤2制备得到的光子晶体薄膜表面喷射金，将喷有金的光子晶体浸泡在含有核酸荧光分子探针的溶液中，静置0.8-1.2h,然后用去离子水洗涤，N₂干燥，得到连接有核酸荧光分子探针的光子晶体；

步骤4：将步骤3所得光子晶体浸泡在含有Hg²⁺和互补核酸的溶液中35-50min,然后用去离子水洗涤N₂干燥，基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器。

4.根据权利要求2或3所述的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于：所述的基底为玻璃、石英或云母中的一种。

5.根据权利要求2或3所述的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，所述核酸荧光分子探针通过5＇端修饰的巯基（SH）连接在喷有金的光子晶体表面。

6.根据权利要求2或3所述的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤4中，所述光子晶体上的核酸荧光分子探针含有25个碱基，从3＇端开始的10、13、16碱基位点为胸腺嘧啶（T）与含有Hg²⁺和互补核酸5＇端开始的4、7、10碱基位点胸腺嘧啶（T）通过T-Hg²⁺-T键合完全碱基互补。

7.根据权利要求6所述的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器的制备方法，其特征在于，所述TEOS与无水乙醇的体积比为1:10，所述氨水、无水乙醇和水的体积比为1:3-7：1-5。

8.一种如权利要求2-7任意一项权利要求所述制备的基于光子晶体增强荧光的汞离子传感器在汞离子荧光检测中应用。