CN116732141B - 一种快速检测生物dna特异性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测生物DNA特异性的方法，包括如下步骤：(1)将WO3和NaCl粉末装入研钵中，研磨，得到混合粉末；(2)将混合粉末放置于SiO2/Si处理基片，再将所述基片和硒粉放入反应器，进行硒化，得到基底材料；(3)将DNA溶液滴加到步骤(2)的基底材料上，进行负载，得到负载有DNA的基底材料，并进行检测。本发明中检测生物DNA特异性的方法，对DNA浓度要求低，操作简单便捷，检测灵敏度和准确度高、检测过程简单限制少。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种快速检测生物DNA特异性的方法。
背景技术
生物体的DNA具有特异性，根据其特定的DNA序列合成特定的蛋白质，而表现出不同的遗传性状。因此，可以利用生物DNA的特异性对不同生物污染源进行检测与分析。有关生物医学方面的研究专家已经采用使用DNA作为识别配体进行基于杂交和适体的生物测定。为了检测生物DNA，已经开发了多种方法，例如电化学方法和荧光法。但是对于电化学方法，检测时需要电信号灵敏度差，测试过程复杂，荧光法对于指示剂有限制要求，生物DNA检测方法灵敏度差、操作复杂、应用范围窄、准确度低的问题亟待解决。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种快速检测生物DNA特异性的方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明以过渡金属硫化物和DNA分子探针作为识别元件。过渡金属硫化物选用单层WSe2，单层WSe2的直接带隙为1.61eV有良好的光学特性，使用进行匹配的目标DNA带来的双螺旋光学结构，最后再由DNA探针对目标DNA进行识别，由生物信号转化为光学信号；再针对双链与单链的对比，能得到光致发光PL光谱图的峰位对比。PL光谱图在单双链DNA的附载上有明显的不同。因此本研究利用光致发光检测单链DNA(ssDNA)、能匹配的双链DNA(dsDNA)的光谱图，来识别检测生物DNA序列。
一种快速检测生物DNA特异性的方法，包括如下步骤：
(1)将WO3和NaCl粉末装入研钵中，研磨，得到混合粉末；
(2)将步骤(1)的混合粉末放置于SiO2/Si处理基片，再将所述基片和硒粉放入反应器，进行硒化，得到基底材料；
(3)将DNA溶液滴加到步骤(2)的基底材料上，进行负载，得到负载有DNA的基底材料，并进行检测。
进一步的，步骤(1)中，所述NaCl和WO3的质量比为1:5～6；所述研磨时间为9～11min。
进一步的，步骤(2)中，所述SiO2/Si处理基片的制备方法为：将SiO2/Si基片放入食人鱼溶液中，105～115℃加热25～35min，然后加入丙酮，超声9～11min，再加入异丙醇，超声9～11min，得到SiO2/Si处理基片；所述食人鱼溶液为浓硫酸和质量分数为29％～31％的过氧化氢溶液按质量比6～7:3～4混合制得；所述丙酮和异丙醇的质量比为1:1～2。
进一步的，步骤(2)中，所述混合粉末和硒粉的质量比为1：20～25。
进一步的，步骤(2)中，所述基底材料为WSe2/SiO2；步骤(3)中，所述DNA溶液为单链DNA溶液和/或DNA互补序列溶液；步骤(3)中，所述负载有DNA的基底材料为单链DNA/WSe2/SiO2和/或双链DNA/WSe2/SiO2。
进一步的，步骤(2)中，所述反应器为三温区管式炉；所述基片放置于三温区管式炉的第二温区，所述硒粉放置于三温区管式炉的第一温区；所述硒化的具体条件为：通入Ar和H2，管式炉的第一温区温度为250～300℃，第二温区温度为1010～1060℃，生长时间为2～10min；所述Ar和H2的体积比为9:1～2，流量为40～50sccm。
进一步的，所述单链DNA溶液或DNA互补序列溶液的制备方法为：将含有所需的碱基对序列的DNA的离心管4000r～4100r离心30s～60s，再加入缓冲溶液配置成0.1～100μM浓度的溶液，制得单链DNA溶液或DNA互补序列溶液；所述含有所需的碱基对序列的DNA包括探针单链DNA和/或DNA互补序列，所述探针单链DNA序列如下：TATATTTATTCTTATTTTATTCTTTATTTTTTTTTTT；所述DNA互补序列如下：AAAAAAAAAACATAAAGAATAACAATAAGAATAACATATA。
进一步的，步骤(3)中，所述检测采用可设置PL模式的高分辨显微共焦拉曼光谱仪，采用530～540nm的激光，采集9～11s。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明中检测生物DNA特异性的方法检测灵敏度高，检测过程简单且限制少，不仅解决了传统使用电学信号检测，因检测浓度限度高所带来的信号差，灵敏度不够的问题，也解决了基于荧光淬灭性能测试的DNA生物传感器在生物体上的应用受限于荧光指示剂的化学特性而不能无选择的应用的问题。
(2)本发明以利用WSe2能谷具有光学选择性和DNA双链的双螺旋结构所特有的光学活性，与使用线偏振光后加1/4的偏振片的原理相同，最后用光致发光的PL光谱图能明显检测DNA双链所带来的能谷极化效果，提高检测的准确度。
(3)本发明中检测生物DNA特异性的方法，对DNA浓度要求低，使用简单的光致发光光谱图就能进行检测，操作简单，便捷。
附图说明
图1是WSe2单层膜的光学显微镜图片。
图2是WSe2单层膜的PL光谱图。
图3为WSe2单双链对比的PL光谱图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明使用的浓硫酸浓度为98.3％。
所需的碱基对序列的DNA来源于：生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1-一种快速检测生物DNA特异性的方法
(1)将NaCl和WO3以1：5的比例称量后放入研钵，研磨10min，得到混合粉末。
(2)将SiO2/Si基片放入食人鱼溶液(浓硫酸和质量分数为30％的过氧化氢溶液按质量比7:3混合制得)110℃加热30min，然后放入丙酮，超声10min，再加入异丙醇，超声10min，该丙酮和异丙醇的质量比为1:1，得到SiO2/Si处理基片；称量1g的硒粉放置于石英舟中，放在三温区管式炉的第一温区，再称量45mg步骤(1)中的混合粉末倒在SiO2/Si处理基片正中间，留有前后生长余地，把整个SiO2/Si处理基片放在石英舟中，防止药品倾倒，将石英舟放入三温区管式炉的第二温区，装好法兰；管式炉的第一温区温度为250℃，第二温区温度为1020℃，生长时间2min，抽真空排除管内气体，按体积比为9:1通入Ar和H2，流量为50sccm，得到基底材料WSe2/SiO2。
(3)取两个步骤(2)中的基底材料WSe2/SiO2，将单链DNA(ssDNA)溶液滴加到其中一个基底材料上，使其铺满整个基片，DNA尾端上的硫醇分子和二维材料进行结合，后用包好锡纸的培养皿盖住，一个小时后，再将表面的DNA溶液用滤纸吸干，利用超纯水冲掉未附载上的DNA，得到单链DNA(ssDNA)/WSe2/SiO2；取另一个基底材料，将单链DNA(ssDNA)溶液滴入，得到单链DNA(ssDNA)/WSe2/SiO2后再将DNA互补序列溶液滴加上去，用包好锡纸的培养皿盖盖住，并在一小时后，用滤纸吸掉表面的DNA分子，利用超纯水冲掉未附载的DNA匹配链，得到双链DNA(dsDNA)/WSe2/SiO2；利用光致发光的手段，采用可设置PL模式的高分辨显微共焦拉曼光谱仪，采用532nm的激光，采集时间为10s，对单链DNA(ssDNA)/WSe2/SiO2和双链DNA(dsDNA)/WSe2/SiO2进行检测，得到不同光谱；该单链DNA(ssDNA)溶液或DNA互补序列溶液制备方法为：购买所需的碱基对序列的DNA(包括探针单链DNA和DNA互补序列，探针单链DNA序列：TATATTTATTCTTATTTTATTCTTTATTTTTTTTTTT，DNA互补序列：AAAAAAAAAACATAAAGAATAACAATAAGAATAACATATA)，将含有的DNA的离心管利用离心机在4000r下离心50s，再加入1X TE缓冲溶液(10mmol/LTris.HCl、1mmol/L EDTA、pH为8)配置成0.2μM浓度的溶液，制得单链DNA(ssDNA)溶液或DNA互补序列溶液。
实施例2-一种快速检测生物DNA特异性的方法
在实施例1的基础上，将步骤(2)中的管式炉的第一温区温度调整为280℃，第二温区温度调整1050℃；其他步骤基本与实施例1一致。
实施例3-一种快速检测生物DNA特异性的方法
在实施例1的基础上，将步骤(2)中的管式炉的第一温区温度调整为300℃，第二温区温度调整1060℃；其他步骤基本与实施例1一致。
图3为实施例1的实验结果，从图3可知，双链带来的能谷劈裂，出现了双峰，比起简单的单链掺杂效果更加明显，利用PL光谱图的不同，直接证明利用WSe2的能谷光学选择效应能够对DNA尽心生物检测且检测灵敏度和准确度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种快速检测生物DNA特异性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将WO3和NaCl粉末装入研钵中，研磨，得到混合粉末；
(2)将步骤(1)的混合粉末放置于SiO2/Si处理基片，再将所述基片和硒粉放入三温区管式炉中，进行硒化，硒化的具体条件为：通入总流量为40～80sccm的体积比为9:1～2的Ar和H2，管式炉的第一温区温度为250～300℃，第二温区温度为1010～1060℃，生长时间为2～10min，得到WSe2/SiO2基底材料；
所述SiO2/Si处理基片的制备方法为：将SiO2/Si基片放入食人鱼溶液中，食人鱼溶液为质量比6～7:3～4的浓硫酸和质量分数为29％～31％的过氧化氢溶液混合而成，105～115℃加热25～35min，然后加入丙酮，超声9～11min，再加入异丙醇，超声9～11min，得到SiO2/Si处理基片；
(3)将单链DNA溶液和/或DNA互补序列溶液滴加到步骤(2)的WSe2/SiO2基底材料上，进行负载，得到单链DNA/WSe2/SiO2和/或双链DNA/WSe2/SiO2，采用可设置PL模式的高分辨显微共焦拉曼光谱仪进行检测，采用530～540nm的激光，采集9～11s，得PL光谱图，所述PL光谱图用于分析双链DNA分子负载的WSe2的能谷极化效果来检测生物DNA；
所述单链DNA溶液和/或DNA互补序列溶液的制备方法为：将探针单链DNA和/或DNA互补序列的离心管4000r～4100r离心30s～60s，再加入缓冲溶液配制成0.1～100μM浓度的溶液，制得单链DNA溶液或DNA互补序列溶液；所述探针单链DNA序列如下：
TATATTTATTCTTATTTTATTCTTTATTTTTTTTTTT；所述DNA互补序列如下：AAAAAAAAAACATAAAGAATAACAATAAGAATAACATATA；
所述DNA/WSe2/SiO2用于利用WSe2能谷具有光学选择性和DNA双链的双螺旋结构的光学活性检测生物DNA。
2.如权利要求1所述的一种快速检测生物DNA特异性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述NaCl和WO3的质量比为1:5～6；所述研磨时间为9～11min。
3.如权利要求1所述的一种快速检测生物DNA特异性的方法，其特征在于，所述丙酮和异丙醇的质量比为1:1～2。
4.如权利要求1所述的一种快速检测生物DNA特异性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合粉末和硒粉的质量比为1：20～25。
5.如权利要求1所述的一种快速检测生物DNA特异性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基片放置于三温区管式炉的第二温区，所述硒粉放置于三温区管式炉的第一温区。
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