CN109320536A - 一种基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于Aza‑BODIPY的近红外二窗荧光探针的设计合成与应用，属于有机荧光探针领域。近红外二区染料(NIR‑II，1000‑1700nm)由于其发射波长较长，光散射和组织自发荧光干扰较少，在生物成像中可获得更好的分辨率和成像深度。Aza‑BODIPY类荧光染料拥有较长的吸收发射波长，较窄的半峰宽，较大的摩尔消光系数，被广泛应用于光动力治疗等领域。本发明设计合成的近红外二窗荧光探针结构式如图(I)所示。该探针在经典的Aza‑BODIPY结构上引入给电子基团久洛尼定，并增加分子的刚性。该探针具有优越的光稳定性和抗干扰能力。该探针在小鼠成像实验中，成功实现近红外二窗成像。

Description

一种基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针及其制备与 应用
技术领域
本发明涉及一种基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的及其制备和应用，属于有机荧光探针领域。
背景技术
荧光成像为生物研究和生物医学应用提供了一个强有力的工具，相较于目前应用的成像技术，如核磁共振(MRI)、断层扫描(CT)、超声波(Ultrasound)、正电子发射断层成像术(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，光声成像(photoacoustic tomography,PAT)等，荧光成像(FLI)技术具有可多通道成像和响应时间快，操作简单，价格低等优点。特别是荧光成像具有高的信噪比，低毒性，可满足医学影像中的诸多要求，因此，受到极大的关注。
应用于生物荧光成像的染料和探针往往需要在四个方面满足要求:信噪比，波长，生物兼容性以及药物代谢动力学。对于一般的小分子材料，基本都能满足后面两个条件。而研究者们关注和研究较多的是波长的问题。对于短波长的材料，在生物成像时，短波长的光会对生物组织产生一定的伤害，并且穿透深度较浅、信噪比也不高。为了解决传统生物荧光成像所存在的穿透深度浅、分辨率低、信噪比差等问题，研究者们进行着不断的探索。研究发现光子穿透深度主要由组织散射和组织吸收决定，随着波长的增加，组织对光的散射和吸收逐渐减少，进而能够解决所面临的问题。所以近红外区域的染料得到极大的关注，其中，近红外二窗(NIR II，1000-1700nm)的染料，在改善成像效果方面，优势明显。目前，NIRII成像的研究受到了广泛关注，主要分为无机纳米材料和有机小分子材料两个方面。由于小分子的染料较有高的生物相容性，其在临床应用方面表现出了极高的潜力。因此，大力发展小分子NIR II染料和探针是推进NIR II技术临床应用亟待解决的问题。
氮杂氟硼二吡咯(Aza-BODIPY)是氟硼二吡咯(BODIPY)染料家族中8位碳原子被氮原子替代的一类BODIPY的类似物，后者以其较长的吸收发射波长，较窄的半峰宽，摩尔消光系数较大，已经被广泛应用于光动力治疗、荧光传感器、近红外荧光探针等生物化学荧光分析领域。
发明内容
本发明利用Aza-BODIPY的染料性质，在其结构上引入了给电子基团久洛尼定结构，通过引入这些给电子基团和增加分子的刚性来增加分子光谱的红移，进而达到近红外二区发光的目的。
本发明采用的技术方案是一种基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的设计合成，其结构式如下：
本发明采用的另一技术方案是：荧光探针为基于久洛尼定衍生物的荧光探针
FBL3的制备方法分别包括如下步骤:
2.1FBL3将久洛尼定衍生物12(1-2当量)加入到圆底烧瓶中，并加入干燥的二氯甲烷(1-3当量)，DIPEA(5-15当量)，并在氮气的保护下，缓慢加入BF3·Et2O(10-20当量)。在室温下避光反应24小时，将反应后的物质用饱和氯化钠的水溶液洗涤，并加入二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸并柱层析纯化，最终得到具有金属光泽的蓝黑色固体FBL3。反应式如下：
优选的，所述的荧光探针FBL3的制备方法中，12和BF3·Et2O的当量比应该为1：5–1：10，否则会导致反应不完全或产生其他的杂质，另外反应应该在氮气条件下进行，否则反应可能会失败。
优选的，所述的荧光探针的前体物质12的制备方法如下：
(1)1：将三氯氧磷(1-3当量)在冰盐浴条件下，缓慢滴加到盛有DMF(3-9当量)的圆底烧瓶中，滴加完毕后撤去冰浴，在氮气保护下，室温先继续搅拌半个小时，制备Vilsmeier-Haack试剂，然后向其中缓慢滴加含有0.5-2当量的久洛尼定的DMF溶液，滴加完毕后，在90℃条件下回流4h。将反应后的物质倒入冰水中使其反应停止，继续搅拌至少2h，有黄色固体析出，最终抽滤得到浅黄色固体1。其反应式如下：
(2)10：在圆底烧瓶中加入甲氧基苯乙酮(1-5当量)、化合物1(1-2当量)、乙醇(40-50当量)、KOH(20％的水溶液，1-2当量)，并室温下搅拌24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液中洗涤，随后用乙酸乙酯进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，并过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到红色固体10。其反应式如下：
(3)11:在圆底烧瓶中加入化合物10(1-2当量)、硝基甲烷(10-30当量)、乙醇(40-50当量)。并在95℃下回流24h，冷却后，将反应后的物质用饱和氯化钠水溶液淬灭，并加入乙酸乙酯进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到淡黄色固体11，其反应式如下：
(4)12：在圆底烧瓶中，加入化合物11(1-2当量)、正丁醇(20-30当量),乙酸铵(35-70当量)，体系在115℃下回流24h,然后旋干3/4液体并抽滤，得到蓝黑色固体化合物12。
优选的，所述步骤4中所述的一系列久洛尼定衍生化合物的制备方法4.1中的中间产物(1)中1制备中，三氯氧磷和DMF的摩尔比为1:3，最后体系加入到冰水中搅拌时间至少为2h，让固体产物充分析出。
(2)10：甲氧基苯乙酮和化合物1的摩尔比为1:1-2.5:1，这样能让化合物1充分反应完全，从而提高产率。
(3)11：制备中化合物10和硝基甲烷的摩尔比为1:10–1：15，反应后的混合溶液先用饱和氯化钠水溶液洗涤会提高产率。
(4)12：制备中化合物11和乙酸铵的摩尔比为1：35左右，这样能让原料充分反应掉。最终旋干3/4液体抽滤的时候，可以用乙醇洗涤。
本发明采用的另一技术方案是：FBL3可应用于生物组织内的近红外二区的成像试剂的制备，可以清晰看到小鼠体内的血管。
所述的荧光探针的纳米包覆粒子FBL3NPs的制备方法如下：
(1)称取FBL3 2.0mg于1.5mL的离心管中，加入1.0mL THF,充分溶解；
(2)称取F-127 9.0mg于20mL的玻璃瓶中，加入10mL去离子水，超声溶解；
(3)在持续超声的情况下，将溶有FBL3的1mL的THF，快速打入到上步所配置的溶液中，继续超声2min，过滤，离心，得到FBL3NPs水溶液；
(4)采用吸光度法，测定FBL3NPs水溶液的浓度。
有益效果：
荧光技术具有操作简便、分辨率高且可实现实时成像等特点，已被广泛应用于生物医学检测和成像领域。其中，近红外二区荧光染料(NIR-II，1000-1700nm)
由于其发射波长较长，光散射和组织自发荧光干扰较少，在生物组织成像中可获得更高的时空分辨率和更深的成像深度。Aza-BODIPY类荧光染料是近几十年来才发展起来的一类新型染料，具有一些突出的优点:较长的吸收发射波长，较窄的半峰宽，较大的摩尔消光系数，被广泛应用于光动力治疗，荧光传感器、近红外荧光探针等领域。
本发明设计合成的近红外二窗(NIR II)的荧光探针如的结构式如图(I)所示。该探针通过在经典的Aza-BODIPY结构上引入给电子基团久洛尼定，其二者的结合，是整个分子表现出来的特性，是两只个共同作用的结果，不是单一某个基团带来，并且二者的结构恰好造成分子轨道能级(HOMO和LUMO)的比较大的差值，从而分子有较大的斯托克斯位移，并增加了分子的刚性，来调节分子基态与激发态能级，从而实现近红外二区的发射。另外，该探针具有优越的光稳定性、pH稳定性以及对生命的离子和氨基酸的抗干扰能力。通过纳米包裹的该探针在活体小鼠成像实验中，成功实现了近红外二窗成像，可以清晰地看到小鼠体内的血管。未来将该领域与临床治疗相结合，将有助于疾病的诊断和治疗。本发明克服了，近红外二区有机小分子，体系比较单一的问题，首创利用AzaBodipy设计和合成近红外二窗分子。
本发明的荧光探针具有较好的光稳定性、生物兼容性等特点，对细胞无毒副作用。在生物应用中，能够进行小鼠全身成像、组织成像、肿瘤细胞成像。在全身成像中，FBL3NPs的二窗成像具有较高分辨率，能够很清晰的看到小鼠身上及脑部的血管等细节，体现出二窗成像的优势。同时，制备的FBL3NPs能好很好的靶向小鼠肿瘤部位，在解刨实验中，能够很清晰的看到分子的代谢情况，主要位于小鼠的肝脏和肿瘤位置。
附图说明
1.图1为探针FBL3的合成路线。
2.图2-a、2-b、2-c分别是FBL3的氢谱、碳谱、质谱数据。
3.图3为探针FBL3在不同有机溶液中的吸收光谱。
4.图4为探针FBL3在不同有机溶液中的发射光谱。
5.图5为探针FBL3在不同pH溶液中的吸收和荧光光谱。
6.图6为47种离子及氨基酸对FBL3的影响。
7.图7为FBL3NPs的紫外和荧光光谱。
8.图8为FBL3NPs在水溶液中的光稳定性。
9.图9为FBL3NPs的XTT测试(HepG2细胞)。
10.图10为不同鸡肉厚度下FBL3NPs荧光数值曲线图。
11.图11为FBL3NPs在小鼠体内不同时间点的荧光成像图。
12.图12为FBL3NPs在小鼠体内肿瘤和组织器官成像。
具体实施方式
实施例1
系列基于Aza-BODIPY的近红外二窗荧光探针FBL3的制备方法如下：
1.1 1：将三氯氧磷(1.17g,7.62mmol)在冰盐浴条件下，缓慢滴加到盛有DMF(1.67g,22.87mmol)的圆底烧瓶中，滴加完毕后撤去冰浴，在氮气保护下，室温先继续搅拌半个小时，制备Vilsmeier-Haack试剂。然后将溶解有久洛尼定(1.2g,6.93毫摩尔)的DMF溶液缓慢向其中滴加，滴加完毕后，在90℃条件下回流4h。将反应后的物质倒入冰水中使其反应停止，继续搅拌至少2h，有黄色固体析出，最终抽滤得到浅黄色固体1。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.59(s,1H),7.28(s,2H),3.28(t,J＝6.0,4H),2.76(t,J＝6.0,4H),1.95(m,4H)。其反应式如下：
1.2 10：在圆底烧瓶中加入甲氧基苯乙酮(375.5mg,2.5mmol)、化合物1(500mg,2.46mmol)、乙醇(50mL)、KOH(20％的水溶液，15mL)，并室温下搅拌24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中洗涤，随后用乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，并过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到红色固体10。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝9.0Hz,2H),7.73(d,J＝15.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(s,2H),6.98(d,J＝6.0Hz,2H),3.88(s,3H),3.25(t,J＝4.5Hz,4H),2.79(t,J＝6.0Hz,4H),1.97(m,4H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ188.87,162.86,145.48,145.13,132.20,130.73,130.48,128.04,121.91,121.05,115.67,114.05,113.64,55.45,50.00,27.74,21.66.其反应式如下：
1.3 11:在圆底烧瓶中加入化合物10(330mg,1mmol)、硝基甲烷(0.88mL,15mmol)、乙醇(50mL)。并在95℃下回流24h，冷却后，将反应后的物质用饱和氯化钠水溶液(10mL)淬灭，并加入乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到淡黄色固体11。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝9.0Hz,2H),6.93(d,J＝9.0Hz,2H),6.64(s,2H),4,74(m,1H),4.59(m,1H),1.93(m,4H).13CNMR(75MHz,CDCl3)δ195.82,163.76,139.86,130.43,125.85,121.84,114.69,113.87,80.13,58.51,55.54,49.96,41.67,38.85,27.71,22.02.其反应式如下：
1.4 12和FBL3在25mL圆底烧瓶中，加入化合物11(394.5mg，1.0mmol)、乙酸铵(2695mg,35.0mmol)，正丁醇(20mL),115℃下回流24h,旋干3/4液体、抽滤，得到蓝黑色固体化合物12。在25mL圆底烧瓶中加入化合物12(20mg，0.0286mmol)、干燥的二氯甲烷、DIPEA(0.05mL，0.286mmol)，在氮气保护下，缓慢加入BF3·Et2O(0.07mL，0.572mmol)，室温避光反应24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中使其反应停止，随后加入二氯甲烷(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，DCM)纯化，最终得到有金属光泽固体FBL3。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.02(d,J＝12.0Hz,4H),7.59(s,6H),6.97(d,J＝12Hz,4H),6.72(s,2H),3.86(s,6H),3.27(s,4H),2.77(m,4H),2.01(m,4H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ161.22,156.74,148.46,145.26,145.03,131.19,125.20,120.68,114.39,114.0,111.41,55.37,44.66,12.78.其反应式如下：
实施例2
系列基于Aza-BODIPY的近红外二窗荧光探针FBL3的制备方法如下：
2.1 1：将三氯氧磷(2.34g,15.24mmol)在冰盐浴条件下，缓慢滴加到盛有DMF(3.34g,45.74mmol)的圆底烧瓶中，滴加完毕后撤去冰浴，在氮气保护下，室温先继续搅拌半个小时，制备Vilsmeier-Haack试剂。然后将溶解有久洛尼定(2g，11.55毫摩尔)的DMF溶液缓慢向其中滴加，滴加完毕后，在90℃条件下回流4h。将反应后的物质倒入冰水中使其反应停止，继续搅拌至少2h，有黄色固体析出，最终抽滤得到浅黄色固体1。
2.2 10：在圆底烧瓶中加入甲氧基苯乙酮(751mg,5mmol)、化合物1(800mg,3.94mmol)、乙醇(60mL)、KOH(20％的水溶液，20mL)，并室温下搅拌24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中洗涤，随后用乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，并过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到红色固体10。
2.3 11:在圆底烧瓶中加入化合物10(660mg,1mmol)、硝基甲烷(2mL,34mmol)、乙醇(60mL)。并在95℃下回流24h，冷却后，将反应后的物质用饱和氯化钠水溶液(10mL)淬灭，并加入乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到淡黄色固体11。
2.4 12和FBL3在25mL圆底烧瓶中，加入化合物11(789mg，2.0mmol)、乙酸铵(5390mg,70mmol)，正丁醇(30mL),115℃下回流24h,旋干3/4液体、抽滤，得到蓝黑色固体化合物12。在25mL圆底烧瓶中加入化合物12(40mg，0.0572mmol)、干燥的二氯甲烷、DIPEA(0.1mL，0.572mmol)，在氮气保护下，缓慢加入BF3·Et2O(0.14mL，1.144mmol)，室温避光反应24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中使其反应停止，随后加入二氯甲烷(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，DCM)纯化，最终得到有金属光泽固体FBL3。
实施例3
系列基于基于Aza-BODIPY的近红外二窗荧光探针FBL3的制备方法如下：
3.1 1：将三氯氧磷(0.585g,3.81mmol)在冰盐浴条件下，缓慢滴加到盛有DMF(1g,13.72mmol)的圆底烧瓶中，滴加完毕后撤去冰浴，在氮气保护下，室温先继续搅拌半个小时，制备Vilsmeier-Haack试剂。然后将溶解有久洛尼定(0.6g，3.46毫摩尔)的DMF溶液缓慢向其中滴加，滴加完毕后，在90℃条件下回流4h。将反应后的物质倒入冰水中使其反应停止，继续搅拌至少2h，有黄色固体析出，最终抽滤得到浅黄色固体1。
3.2 10：在圆底烧瓶中加入甲氧基苯乙酮(375.5mg,2.5mmol)、化合物1(300mg,1.476mmol)、乙醇(30mL)、KOH(20％的水溶液，9mL)，并室温下搅拌24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中洗涤，随后用乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，并过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到红色固体10。
3.3 11:在圆底烧瓶中加入化合物10(330mg,1mmol)、硝基甲烷(1mL,17mmol)、乙醇(60mL)。并在95℃下回流24h，冷却后，将反应后的物质用饱和氯化钠水溶液(10mL)淬灭，并加入乙酸乙酯(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，EA)纯化，最终得到淡黄色固体11。
3.4 12和FBL3在25mL圆底烧瓶中，加入化合物11(197.25mg，0.5mmol)、乙酸铵(1540mg,20mmol)，正丁醇(10mL),115℃下回流24h,旋干3/4液体、抽滤，得到蓝黑色固体化合物12。在25mL圆底烧瓶中加入化合物12(10mg，0.0143mmol)、干燥的二氯甲烷、DIPEA(0.03mL，0.172mmol)，在氮气保护下，缓慢加入BF3·Et2O(0.04mL，0.343mmol)，室温避光反应24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液(10mL)中使其反应停止，随后加入二氯甲烷(30mL)进行萃取。之后加入无水硫酸钠干燥，过滤。旋蒸，过柱子(硅胶，DCM)纯化，最终得到有金属光泽固体FBL3。
实施例4
系列基于Aza-BODIPY的近红外二窗荧光探针FBL3的纳米包覆离子FBL3NPs的制备方法如下：
(1)称取FBL3 2.0毫克于1.5毫升的离心管中，加入1毫升四氢呋喃，充分溶解；
(2)称取F-127 9.0毫克于20毫升的玻璃瓶中，加入1毫升去离子水，超声溶解；
(3)在持续超声的情况下，将溶有FBL3的1毫升的四氢呋喃，快速打入到上步所配置的溶液中，继续超声2分钟，过滤，离心，得到FBL3NPs水溶液；
(4)采用吸光度法，测定FBL3NPs水溶液的浓度。
实施例5
系列基于Aza-BODIPY的近红外二窗荧光探针FBL3的纳米包覆粒子FBL3NPs的小鼠成像实验：
实验小鼠皆由南京青龙山动物场购买，为雌性小鼠，重量在20-30克。
(1)将染料制成水溶性纳米颗粒FBL3NPs(浓度为2.0mg/mL)，通过尾静脉注射(200微升)的方法注射到小鼠体内，分别对小鼠后腿和大脑进行成像并测试血管宽度。
(2)将商业染料染料ICG(浓度为2.0mg/mL)，通过尾静脉注射(200微升)的方法注射到小鼠体内，分别对小鼠后腿和大脑进行成像并测试血管度。
(3)将染料制成水溶性纳米颗粒FBL3NPs(浓度为2.0mg/mL)，通过尾静脉注射(200微升)的方法注射到小鼠(腋下接有4t1细胞)体内，分别在不同时间点(1小时，3小时，6小时，8小时)对老鼠进行成像，最后，进行解刨，并对肝脏、脾、肾以及肿瘤进行成像。

Claims (7)

1.一种基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针，其特征在于：能够成功实现近红外二窗成像，所述荧光探针结构如式(Ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的基于Aza-BODIPY近红外二窗的荧光探针的制备，其特征在于：在经典的Aza-BODIPY结构上引入给电子基团久洛尼定，并增加分子的刚性，来调节分子基态和激发态能级，从而实现近红外二区的发射，所述的荧光探针FBL3的制备方法如下：
将1-2当量久洛尼定衍生物12加入到圆底烧瓶中，并加入干燥的1-3当量二氯甲烷，5-15当量DIPEA，并在氮气的保护下，缓慢加入10-20当量BF3·Et2O，在室温下避光反应24小时，将反应后的物质用饱和氯化钠的水溶液洗涤，并加入二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸并柱层析纯化，最终得到具有金属光泽的蓝黑色固体FBL3。
3.根据权利要求2所述的基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的制备，其特征在于，所述的荧光探针FBL3的制备方法中，洛尼定衍生物12和BF3·Et2O的当量比应该为1:5–1:10，否则会导致反应不完全或产生其他的杂质，另外反应应该在氮气条件下进行，否则反应可能会失败。
4.根据权利要求2所述的基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针，所述的探针前体物质12的制备方法如下：
(1)将1-3当量的三氯氧磷在冰盐浴条件下，缓慢滴加到盛有3-9当量的DMF的圆底烧瓶中，滴加完毕后撤去冰浴，在氮气保护下，室温先继续搅拌半个小时，制备Vilsmeier-Haack试剂，然后向其中缓慢滴加含有0.5-2当量的久洛尼定的DMF溶液，滴加完毕后，在90℃条件下回流4小时，将反应后的物质倒入冰水中使其反应停止，继续搅拌至少2小时，有黄色固体析出，最终抽滤得到浅黄色固体1，其反应式如下：
(2)在圆底烧瓶中加入1-5当量的甲氧基苯乙酮、1-2当量的化合物1、40-50当量的乙醇、KOH 20％的水溶液1-2当量，并室温下搅拌24h，将反应后的物质倒入饱和氯化钠水溶液中洗涤，随后用乙酸乙酯进行萃取，之后加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，并过硅胶，EA柱子纯化，最终得到红色固体10，其反应式如下：
(3)在圆底烧瓶中加入1-2当量的化合物10、10-30当量的硝基甲烷、乙醇40-50当量，并在95℃下回流24h，冷却后，将反应后的物质用饱和氯化钠水溶液淬灭，并加入乙酸乙酯进行萃取，之后加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，过硅胶，EA柱子纯化，最终得到淡黄色固体11，其反应式如下：
(4)在圆底烧瓶中，加入1-2当量化合物11、20-30当量正丁醇，20-30当量乙酸铵，体系在115℃下回流24h，然后旋干3/4液体并抽滤，得到蓝黑色固体化合物12，
5.根据权利要求4所述的基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的制备，其特征在于：
所述步骤1中所述的一系列久洛尼定衍生化合物的制备方法的中间产物(1)制备中，三氯氧磷和DMF的摩尔比为1:3，最后体系加入到冰水中搅拌时间至少为2h，让固体产物充分析出；
所述步骤(2)的甲氧基苯乙酮和化合物1的摩尔比为1:1-2.5:1，这样能让化合物1充分反应完全，从而提高产率；
所述步骤(3)的制备中化合物10和硝基甲烷的摩尔比为1:10–1:15，反应后，要用饱和食盐水洗涤，才能增加产率；
所述步骤(4)的制备中化合物11和乙酸铵的摩尔比为1:10–1:15，这样能让原料充分反应掉，最终旋干3/4液体抽滤的时候，可以用乙醇洗涤。
6.一种如权利要求1所述的基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的应用，其特征在于：FBL3可应用于生物组织内的近红外二区的成像试剂的制备，可以清晰看到小鼠体内的血管。
7.一种如权利要求1所述的基于Aza-BODIPY的近红外二窗的荧光探针的应用，其特征在于：FBL3用纳米粒子包覆之后形成FBL3 NPs，其制备方法如下：
(1)称取FBL3 2.0毫克于1.5毫升的离心管中，加入1毫升四氢呋喃，充分溶解；
(2)称取F-127 9.0毫克于20毫升的玻璃瓶中，加入1毫升去离子水，超声溶解；
(3)在持续超声的情况下，将溶有FBL3的1毫升的四氢呋喃，快速打入到上步所配置的溶液中，继续超声2分钟，过滤，离心，得到FBL3 NPs水溶液；
(4)采用吸光度法，测定FBL3 NPs水溶液的浓度。
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