CN114271792B - 近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物荧光传感技术领域，具体为近红外第二窗口检测pH双通道比率荧光传感器及其制备方法和应用。本发明荧光传感器涉及染料包括：一具有近红外第二窗口发射的氮杂氟硼二吡咯类近红外荧光染料NAB和pH响应近红外罗丹明类荧光染料NRh；此两染料以不同摩尔比通过甲氧基聚乙二醇磷脂包裹构建可调检测转换点的近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器pTAS；该传感器可用于对小鼠体内pH的变化可视化检测。

Description

近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器及其制备方 法和应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器及其制备方法和应用。

背景技术

目前常见的分子影像技术如X线断层扫描成像(X-CT)，超声成像(UI)，正电子放射性断层成像(PET)和磁共振成像(MRI)已广泛用于对疾病等的医疗诊断。但是目前这些影像技术有其自身的缺点，如辐射，较差的空间分辨率，无法实现动态实时监测等。荧光成像由于实时、非侵入性、分辨率高、所需样品量少等优点，在生物技术领域等领域被广泛应用，尤其是有生物组织的荧光成像。相对于近红外第一窗口(700nm～900nm)荧光成像受限于生物组织在此波段范围内有很强的吸收和散射致使其信噪比和组织穿透深度都比较低，近红外第二窗口(900nm～1700nm)荧光成像，由于在这个波段内生物组织自身的吸收和散射弱，成像质量高和穿透深度深，成为近期荧光成像领域研究热点之一。目前，一些无机材料如碳纳米管，稀土下转换纳米颗粒，量子点实现近红外第二窗口区的发射，但是含有重金属元素具有潜在的生物毒性，进入活体后代谢缓慢，且在水中溶解性差，这大大限制了它们的应用价值。相对于无机材料，有机染料具有相对分子量较小，易于代谢，同时也可以实现近红外第二窗口区的发射，利于临床转化。所以近红外第二窗口区的有机荧光染料引起了广泛的关注。

近期，很多课题组开发了具有近红外第二窗口发射的有机小分子荧光染料，并应用于生物活体成像。这些染料大部分都属于荧光始终开启状态，在通过静脉给入生物体后，不管是否到达靶向组织，都会持续发出荧光信号，造成背景信号很高，导致靶标与背景信号比小的荧光成像，进而限制荧光检测的灵敏度和特异性；另外，也有一些报道基于靶向目标激活的单通道成像荧光探针，此种探针基于单一通道荧光增强模式成像，经常受限于激发光源与生物组织环境从而影响荧光检测的精准度。因此，开发近红外第二窗口检测的双通道比率荧光传感器，实现成像检测诊断的灵敏度、特异性和精准度，成为推进近红外第二窗口技术诊断检测与临床应用亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备工艺简单、生物相容性好、检测灵敏度高、精确度高的具有可调检测转换点的近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器及其制备方法和应用。

本发明提供的近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，采用氮杂氟硼二吡咯染料(记为NAB)和pH响应的近红外罗丹明类荧光染料(记为NRh)，两染料通过甲氧基聚乙二醇磷脂包裹构建荧光传感器，记为pTAS；其通过染料间的能量共振转移(FRET)，实现双通道比率荧光检测，并通过简单的对NAB与NRh的摩尔比调控实现检测点转换的调节，以满足检测对象不同亚区间的成像需要。

第一，本发明主要是在前人工作的基础上设计制备近红外第二窗口发射新的氮杂氟硼二吡咯和pH响应罗丹明类荧光染料，以此构建双通道比率荧光传感器，通过简单的对两种染料的摩尔比调控实现检测点的转换的调节，该设计思路和化合物结构未见文献报道。

第二，本发明针对现有近红外第二窗口成像的“始终开启”染料和单通道荧光激活探针带来成像检测灵敏度、特异性和精准度差等问题，合成并构建近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器。该传感器实现了对小鼠病灶微环境pH的酸性变化和碱性变化过程进行精准可视化监测。

本发明首先提供一种近红外第二窗口发射的有机小分子荧光染料NAB和pH响应染料NRh，其化合物结构式如下：

本发明还提供上述两个化合物的制备方法，其中，有机小分子荧光染料NAB的合成路线为：

有机小分子荧光染料NAB合成的具体步骤为：

(1)中间体2的合成

将化合物1(5-(N,N-二苯基)-2-噻吩乙酮)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛溶于乙醇中，在室温下加入40％氢氧化钾或氢氧化钠并搅拌10～12小时；反应结束后析出固体，过滤并用冷的乙醇洗，干燥后得到中间体红色固体化合物2；其中化合物1与3,4,5-三甲氧基苯甲醛及氢氧化钾的投料摩尔比为1:(1.0～1.3):(2～2.5)。

(2)中间体3的合成

将中间体2、硝基甲烷及碳酸钾置于甲醇中，在90-100℃搅拌回流6～8小时；反应冷却后，旋蒸溶剂甲醇，加入乙酸乙酯和水进行分液萃取；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，并用柱色谱分离得到中间体3；其中，中间体2与硝基甲烷及碳酸钾的投料摩尔比为1:(10～20):(10～20)。

(3)中间体4的合成

将中间体3和乙酸铵溶于乙醇中，在100℃搅拌回流24小时；反应冷却后，旋蒸除去一半溶剂乙醇，过滤得到蓝黑色中间体4；其中，中间体3与乙酸铵的投料摩尔比为1:20～1:25。

(4)染料NAB的合成

将中间体4混合于无水二氯甲烷中，氮气保护下先后加入二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，反应搅拌1～2小时后，加入二氯甲烷，水洗，分液，干燥后旋蒸至油状物，用柱色谱分离得到染料NAB；其中，中间体4与二异丙基乙胺及三氟化硼乙醚的投料摩尔比为1:(5:～7):(10～13)。pH响应染料NRh的合成路线为：

pH响应染料NRh合成的具体步骤为：

(1)中间体7的合成

将化合物5(9-邻苯甲酸-6-二乙氨基-1,2,3,4-四氢氧杂蒽盐)和化合物6(4-苯亚氨基丙烯-6-二乙氨基-1,2,3-三氢氧杂蒽)及乙酸钠混合于乙酸酐中，氮气保护下室温搅拌3～6小时；反应结束后旋蒸除去溶剂至油状物，用柱色谱分离得到中间体7；其中，化合物5与化合物6及乙酸钠的投料摩尔比为1:(1.2～1.3):(1～2)。

(2)染料NRh的合成

将中间体7和2,6-二甲基苯胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入PyBOP缩合剂和二异丙基乙胺，室温搅拌10～12小时；反应结束后，加入乙酸乙酯和水进行分液萃取；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，最后用柱色谱分离得到染料NRh；其中，中间体7与2,6-二甲基苯胺及PyBOP缩合剂/二异丙基乙胺的投料摩尔比为1:(1.0～1.5):(1.5～2)。

本发明制备得到染料NAB和pH响应的NRh，可用于制备近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，制备的具体步骤如下：

将近红外荧光染料NAB、NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇溶于氯仿中，再搅拌0.4-1小时，旋蒸除去溶剂，真空干燥，加热至60℃后加入40-60℃的去离子水溶解，超声，冷却至室温再通过30KD或10KD的超滤管超滤浓缩，得到最终的双通道比率荧光传感器，记为pTAS；其中，近红外染料NAB/NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:(100～24)，近红外染料NAB与NRh的摩尔比为(1:1～15)；最终pH荧光传感器的浓度为0.005～0.02mM(以染料NAB计)。

本发明中，优选近红外染料NAB/NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:(100～50)；

本发明制备得到双通道比率荧光传感器pTAS，在中性或碱性环境中，用808nm激光器激发，由于NRh未发生开环响应没有产生受体的吸收，传感器仅仅发射氮杂氟硼二吡咯NAB在940nm的荧光；在酸性环境下，传感器中染料NRh受酸发生开环响应，NAB能量供体与NRhH⁺能量受体发生FRET，此时808nm激光器激发，传感器产生NRhH⁺能量受体的1026nm荧光，从而实现近红外第二窗口对pH双通道比率荧光检测(图1)。

本发明制备得到双通道比率荧光传感器pTAS，对小鼠病灶微环境pH的酸性变化和碱性变化过程进行精准可视化监测。

本发明中，保持近红外染料NAB/NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:24，NAB与NRh的摩尔比为1:1时，记为pTAS-1,NAB与NRh的摩尔比为1:5时，记为为pTAS-2,NAB与NRh的摩尔比为1:10时，记为pTAS-3，NAB与NRh的摩尔比为1:15时，记为pTAS-4)。四种不同摩尔比染料NAB/NRh构建的双通道比率荧光传感器pTAS-1～4，在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发，能够观察的近红外第二窗口荧光发射谱图，其中，在中性和碱性环境中，传感器发射NAB供体940nm的荧光(峰1)，随着pH减低至酸性环境4.88，NAB供体940nm荧光逐渐减弱，NRhH⁺能量受体的1026nm荧光(峰2)逐渐增强。双通道荧光传感器pTAS-1～3，在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发后，得到的比率荧光变化(峰1/峰2)随pH变化的谱图，根据Boltzmann公式拟合出传感器pTAS-1～3的pH检测转换点分别为6.49,6.76和6.92，并且对应检测区间分别为6.11-6.88,6.43-7.09和6.63-7.22(图2)。

本发明中，保持近红外染料NAB/NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:50，相应的四种不同摩尔比染料NAB/NRh构建的双通道比率荧光传感器记为pTAS-5～8，观察到与类似现象，根据Boltzmann公式拟合出传感器pTAS-5～7的pH检测转换点分别为7.39，8.09和9.44，并且对应检测区间分别为6.92-7.91,7.24-8.94和9.10-9.78(图3)。

本发明中，保持近红外染料NAB/NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:100，相应的四种不同摩尔比染料NAB/NRh构建的双通道比率荧光传感器记为pTAS-9～12，观察到与类似现象，根据Boltzmann公式拟合出传感器pTAS-9～11的pH检测转换点分别为7.43,9.21和9.49，并且对应检测区间分别为6.90-7.95,8.85-9.57和9.16-9.82(图4)。

本发明中，双通道荧光传感器pTAS-2和pTAS-3，在对小鼠肿瘤微环境pH的酸性变化和碱性变化过程进行精准可视化监测(图5)。同样地，pTAS-5～8，pTAS-9～12也可进行精准可视化监测。

附图说明

图1为本发明近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器中包含的染料及调节传感器pH检测点的原理。其中，a为染料NAB和pH响应的染料NRh在不同pH条件下的结构变化及其发生能量转移(FRET)，b为调节传感器pH检测点的原理。

图2为本发明近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发，能够观察的近红外第二窗口荧光发射谱图，以及双通道荧光传感器pTAS-1～3在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发后，得到的比率荧光变化(峰1/峰2)随pH变化的谱图。其中a-d分别为为pTAS-1～4的在不同pH值下的荧光发射，e和f分别为pTAS-1～3的pH监测点及检测区间。

图3为本发明近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发，能够观察的近红外第二窗口荧光发射谱图，以及双通道荧光传感器pTAS-5～7在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发后，得到的比率荧光变化(峰1/峰2)随pH变化的谱图。其中a-d分别为为pTAS-5～8的在不同pH值下的荧光发射，e和f分别为pTAS-5～7的pH监测点及检测区间。

图4为本发明近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发，能够观察的近红外第二窗口荧光发射谱图，以及双通道荧光传感器pTAS-9～11在不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，用808nm的激光器激发后，得到的比率荧光变化(峰1/峰2)随pH变化的谱图。其中a-d分别为为pTAS-9～12的在不同pH值下的荧光发射，e和f分别为pTAS-9～11的pH监测点及检测区间。

图5为双通道荧光传感器pTAS-2和pTAS-3，在对小鼠肿瘤微环境pH的酸性变化和碱性变化过程可视化监测。其中，a为小鼠肿瘤血管夹闭导致的微环境pH下降过程中比率荧光成像结果，b为小鼠肿瘤瘤内注射碳酸氢钠导致的微环境pH上升过程中比率荧光成像结果，c为肿瘤微环境pH下降过程中比率荧光定量pH值与微针pH电极检测结果的对比，d为肿瘤微环境pH上升过程中比率荧光定量pH值与微针pH电极检测结果的对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步介绍本发明。

实施例1：

近红外二窗口的NAB染料的制备，化合物结构式如下：

具体步骤如下：

(1)中间体2的合成

称取化合物1(1.17g,4mmol)与3,4,5-三甲氧基苯甲醛(0.78g,4mmol)溶于20mL无水乙醇中，在冰水浴下加入40％氢氧化钾(1.5mL)，继续室温搅拌12小时，有黄色固体析出，过滤，并用冷的乙醇洗，干燥后得化合物1(1.2g,产率63％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.67(d,J＝15.2Hz,1H),7.63(d,J＝4.4Hz,1H),7.38–7.34(m,4H),7.30–7.28(m,4H),7.23–7.19(m,3H),6.83(s,2H),6.41(d,J＝4.0Hz,1H),3.91(s,6H),3.89(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:180.7,163.1,153.6,146.5,142.2,133.3,130.9,129.9,125.9,125.5,120.7,113.4,105.7,61.2,56.5.HR–MS(ESI):calculated for C₂₈H₂₅N₂O₄S[M+Na]⁺:494.1397,found 494.1388.

(2)中间体3的合成

称取中间体2(0.94g,2mmol)与硝基甲烷(1.5mL)溶于20mL甲醇溶液中，加入碳酸钾(0.56g,4mmol)后，在100度搅拌回流6小时；反应冷却后，旋蒸溶剂甲醇，加入乙酸乙酯(40mL)和水(30mL)进行分液萃取；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，并用硅胶柱色谱(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯)分离得到中间体3(0.55g,产率52％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.38(d,J＝4.4Hz,1H),7.37–7.33(m,4H),7.26–7.24(m,4H),7.22–7.19(m,2H),6.44(s,2H),6.30(d,J＝4.4Hz,1H),4.84–4.79(m,1H),4.71–4.66(m,1H),4.08–4.06(m,1H),3.83(s,6H),3.81(s,3H),3.22–3.08(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:188.3,163.7,153.7,146.3,137.7,135.0,134.0,130.4,130.0,126.2,125.6,112.8,104.7,79.6,61.0,56.4,41.2,40.7.HR–MS(ESI):calculated for C₂₉H₂₈N₂O₆S[M+H]⁺:533.1741,found533.1747.

(3)染料NAB的合成

称取中间体3(1.50g,4.3mmol)和乙酸铵(172mg,2.2mmol)混合于30mL乙醇中，100度加热回流反应24h，反应冷却后，旋蒸除去一半溶剂乙醇，过滤得到蓝黑色中间体4，直接用于下一步；黑色固体溶解于20mL干燥的二氯甲烷中，氮气保护下先后加入二异丙基乙胺(0.8mL)和三氟化硼乙醚(1mL)，反应搅拌1～2小时后，加入二氯甲烷，水洗，分液，干燥后旋蒸至油状物，用硅胶柱色谱(洗脱剂：二氯甲烷)分离得到染料NAB(0.12g,产率12％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.21(d,J＝4.4Hz,2H),7.39–7.35(m,8H),7.32–7.29(m,8H),7.22–7.19(m,4H),6.83(s,4H),6.59(d,J＝4.8Hz,2H),3.89(s,6H),3.73(s,12H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:159.5,153.3,146.7,146.4,145.5,140.2,138.9,134.1,130.0,128.7,125.8,125.1,123.8,118.1,117.7,109.9,106.5,61.2,56.2.HR–MS(ESI):calculated forC₅₈H₄₈BF₂N₅O₆S₂[M+H]⁺:1024.3189,found 1024.3188。

实施例2：

近红外二窗口的pH荧光响应的罗丹明类结构染料NRh的制备，化合物结构式如下：

具体步骤如下：

(1)中间体7的合成

将化合物5(0.94g,2mmol)和化合物6(0.77g,2mmol)溶解于20mL乙酸酐中，氮气保护下加入乙酸钠(0.33g,4mmol)后，室温搅拌3小时；反应结束后真空减压旋蒸除去溶剂至油状物，用硅胶柱色谱(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇)分离得到中间体7(0.32g,产率21％)。

(2)染料NRh的合成

将中间体7(200mg,0.26mmol)和2,6-二甲基苯胺(50mg,0.4mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下先后加入PyBOP缩合剂(200mg,0.26mmol)和二异丙基乙胺(70mg)，室温搅拌12小时；反应结束后，加入乙酸乙酯(100mL)，用两批次水(30mL)进行水洗；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，最后用硅胶柱色谱(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯)分离得到染料NRh(80mg,产率40％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.70–7.63(m,1H),7.61–7.57(m,1H),7.39(d,J＝4.4Hz,1H),7.29–7.27(m,1H),7.08–7.05(m,1H),7.00(d,J＝7.2Hz,1H),6.83–6.80(m,3H),6.50(d,J＝8.4Hz,1H),6.38(s,2H),6.31–6.28(m,3H),6.12(s,1H),3.41–3.31(m,8H),2.44(m,4H),2.22(s,3H),1.99–1.94(m,2H),1.76–1.68(m,6H),1.38(s,3H),1.22(t,J＝6.8Hz,6H),1.15(t,J＝6.8Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:166.7,156.2,154.8,151.2,149.0,148.5,148.1,147.7,138.8,138.4,131.6,129.2,128.5,127.9,126.2,125.5,124.9,124.2,120.5,120.0,111.1,110.2,107.7,107.6,107.5,106.0,98.3,97.8,70.9,44.5,44.4,29.9,26.0,25.3,24.5,21.8,21.3,19.3,18.7,12.7,12.5.HR–MS(ESI):calculated for C₅₂H₂₅₅N₃O₃[M+H]⁺:770.4316,found770.4310。

实施例3：

近红外第二窗口pH双通道比率荧光传感器pTAS的制备，以近红外染料NAB/NRh与甲氧基磷脂聚乙二醇的质量比为1:24，NAB与NRh的摩尔比1:10的pTAS-3为例，具体步骤如下：

分别取近红外荧光染料NAB氯仿溶液(20μL,1.25mM)和NRh氯仿溶液(100μL,2.5mM)溶于5mL氯仿中，再称取甲氧基DSPE-2000的氯仿溶液(335μL,25mg/mL)，室温搅拌0.5小时，旋蒸除去溶剂，真空干燥，加热至60℃后加入40-60℃的去离子水溶解，超声，冷却至室温再通过30KD或10KD的超滤管超滤浓缩至5mL，得到最终的pH荧光传感器pTAS-3，其中NAB/NRh浓度为5μM:50μM。

近红外第二窗口pH双通道比率荧光传感器pTAS-1～4在不同pH的荧光发射谱图：以pTAS-3为例，传感器加入到不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，配置染料NAB/NRh浓度为1μM/10μM的溶液，待平衡后，用808nm的激光器激发后测定荧光发射光谱，结果见图2a-d，其荧光强度比峰1/峰2变化如图2e-f。

实施例4：

改变近红外染料NAB/NRh与甲氧基磷脂聚乙二醇的质量比为1:50，NAB与NRh的摩尔比为1：(1～15)，近红外第二窗口pH双通道比率荧光传感器pTAS-5～8在不同pH的荧光发射谱图及pH监测点，检测范围：传感器加入到不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，待平衡后，用808nm的激光器激发后测定荧光发射光谱，结果见图3。

实施例5：

改变近红外染料NAB/NRh与甲氧基磷脂聚乙二醇的质量比为1:100，NAB与NRh的摩尔比为1：(1～15)，近红外第二窗口pH双通道比率荧光传感器pTAS-9～12在不同pH的荧光发射谱图及pH监测点，检测范围：传感器加入到不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，待平衡后，用808nm的激光器激发后测定荧光发射光谱，结果见图4。

实施例6：

双通道荧光传感器pTAS-2和pTAS-3对小鼠肿瘤微环境pH变化成像。具体步骤如下：

将麻醉的荷瘤小鼠尾静脉注射150μL pTAS-2探针(NAB/NRh浓度为10μM/50μM)，通过微创手术夹闭肿瘤供血血管，用808nm外置激光器照射小鼠全身，激光器功率密度为30mW/cm²，收集通道1(900-1700nm)与通道2(1000-1700nm)的荧光成像图像(参见图5)。

将麻醉的荷瘤小鼠尾静脉注射150μL pTAS-3探针(NAB/NRh浓度为10μM/100μM)，通过微创手术夹闭肿瘤供血血管，用808nm外置激光器照射小鼠全身，激光器功率密度为30mW/cm²，收集通道1(900-1700nm)与通道2(1000-1700nm)的荧光成像图像(参见图5)。

双通道荧光传感器pTAS-5和pTAS-6，双通道荧光传感器pTAS-10和pTAS-11，同样可以对小鼠肿瘤微环境pH变化进行荧光成像，具体略。

Claims (5)

1.一种近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器，其特征在于，采用氮杂氟硼二吡咯染料，记为NAB，以及pH响应的近红外罗丹明类荧光染料，记为NRh；两染料通过甲氧基聚乙二醇磷脂包裹构建得到荧光传感器，记为pTAS；其通过染料间的能量共振转移，实现双通道比率荧光检测，并通过对NAB与NRh的摩尔比调控实现检测点转换的调节，以满足检测对象不同亚区间的成像需要；其中，NAB与NRh，和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:

(100～50)，NAB与NRh的摩尔比的调控范围为1:(1～15)；所述NAB和NRh的化合物结构式如下：

2.一种如权利要求1所述近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

将近红外荧光染料NAB、NRh和甲氧基磷脂聚乙二醇溶于氯仿中，再搅拌0.4-1小时，旋蒸除去溶剂，真空干燥，加热至60℃后加入40-60℃的去离子水溶解，超声，冷却至室温再通过30KD或10KD的超滤管超滤浓缩，得到最终的双通道比率荧光传感器，记为pTAS；其中，近红外染料NAB与NRh，和甲氧基磷脂聚乙二醇的质量百分比为1:(100～50)，近红外染料NAB与NRh的摩尔比为1:(1～15)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光染料NAB的合成路线为：

NAB合成的具体步骤为：

(1)中间体2的合成

将5-(N,N-二苯基)-2-噻吩乙酮化合物1和3,4,5-三甲氧基苯甲醛溶于乙醇中，在室温下加入40％氢氧化钾或氢氧化钠并搅拌10～12小时；反应结束后析出固体，过滤并用冷的乙醇洗，干燥后得到中间体红色固体化合物2；其中，化合物1与3,4,5-三甲氧基苯甲醛及氢氧化钾的投料摩尔比为1:(1.0～1.3):(2～2.5)；

(2)中间体3的合成

将中间体2、硝基甲烷及碳酸钾置于甲醇中，在90-100℃搅拌回流6～8小时；反应冷却后，旋蒸溶剂甲醇，加入乙酸乙酯和水进行分液萃取；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，并用柱色谱分离得到中间体3；其中，中间体2与硝基甲烷及碳酸钾的投料摩尔比为：1:(10～20):(10～20)；

(3)中间体4的合成

将中间体3和乙酸铵溶于乙醇中，在100℃搅拌回流24小时；反应冷却后，旋蒸除去一半溶剂乙醇，过滤得到蓝黑色中间体4；其中，中间体3与乙酸铵的投料摩尔比为1:(20～25)；

(4)染料NAB的合成

将中间体4混合于无水二氯甲烷中，氮气保护下先后加入二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，反应搅拌1～2小时后，加入二氯甲烷，水洗，分液，干燥后旋蒸至油状物，用柱色谱分离得到染料NAB；其中，中间体4与二异丙基乙胺及三氟化硼乙醚的投料摩尔比为：1:(5～7):(10～13)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光染料NRh的合成路线为：

NRh合成的具体步骤为：

(1)中间体7的合成

将9-邻苯甲酸-6-二乙氨基-1,2,3,4-四氢氧杂蒽盐化合物5和4-苯亚氨基丙烯-6-二乙氨基-1,2,3-三氢氧杂蒽化合物6及乙酸钠混合于乙酸酐中，氮气保护下室温搅拌3～6小时；反应结束后旋蒸除去溶剂至油状物，用柱色谱分离得到中间体7；其中，化合物5与化合物6及乙酸钠的投料摩尔比为：1:(1.2～1.3):(1～2)；

(2)染料NRh的合成

将中间体7和2,6-二甲基苯胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入PyBOP缩合剂和二异丙基乙胺，室温搅拌10～12小时；反应结束后，加入乙酸乙酯和水进行分液萃取；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸至油状物，最后用柱色谱分离得到染料NRh；其中，中间体7与2,6-二甲基苯胺及PyBOP缩合剂/二异丙基乙胺的投料摩尔比为：1:(1.0～1.5):(1.5～2)。

5.如权利要求1所述近红外第二窗口检测pH的双通道比率荧光传感器在制备对小鼠病灶微环境pH的酸性变化和碱性变化过程进行精准可视化监测的试剂中的应用。