CN118005598A - 一种高稳定高亮度罗丹明衍生物、制备方法及其在近红外生物成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高稳定高亮度罗丹明衍生物、制备方法及其在近红外生物成像中的应用，该化合物在去离子水中最大吸收波长为603nm，最大发射波长为650nm，其荧光量子效率达到51.12％，几乎是商业光敏剂罗丹明B的二倍，能够在近红外区发射，并且具有较大的斯托克斯位移和高量子产率，满足荧光成像条件，不仅能够长时间成像，还能最大限度地减少对生物样品的光损伤，增加组织穿透深度，并最大限度地减少生物自身荧光信号的干扰，在医学领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于近红外一区(NIR-I:600～800nm)荧光成像技术领域，具体涉及一种高稳定高亮度罗丹明衍生物、制备方法及其在近红外生物成像中的应用，比如，在近红外细胞成像或近红外活体成像。
背景技术
荧光成像技术具有高灵敏度、实时空间成像和能够检测活细胞或组织中目标的特点，且能够将对机体的损伤降低到最小。因此，荧光成像已经成为一种方便和强大的工具，用于检测生物相关的物种，具有可视化形态学细节和监测生命系统中的各种生理过程的能力。近年来，随着荧光分析技术的快速发展，小分子荧光探针在生物成像、药物筛选和医学诊断等方面的应用越来越受到人们的关注，并显示出良好的应用前景。特别是小分子探针的设计，由于其具有可激活荧光探针的高特异性响应、快速灵敏度和优良的信噪比而引起了广泛的研究关注。然而，这项技术的成像质量严格依赖于用于样品染色的荧光染料的光物理性质。在荧光成像中近红外荧光成像可以最大限度地减少对生物样品的光损伤，增加组织穿透深度，并最大限度地减少生物自身荧光信号的干扰。
罗丹明染料具有优异的光物理性能，如高的摩尔消光系数、优秀的光稳定性等。自1887年被发现以来，就广泛应用于生物技术中作为荧光标记或小分子检测。但由于杂蒽衍生物的π-共轭体系有限，经典的罗丹明染料如罗丹明123、罗丹明6G和罗丹明B的发射波长仅在可见光区，从而限制了它们在生物成像中的应用。此外，小于717nm-1的斯托克斯位移，使得罗丹明染料通常表现出严重的自猝灭现象。可见目前经典的罗丹明染料已均无法有效地应用在生物成像中。因此，本发明研究团队认为有必要探寻一种能够在近红外区发射、具有较大的斯托克斯位移和高量子产率的罗丹明类染料用于生物成像。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术所存在的不足之处，而提供了一种高稳定高亮度罗丹明衍生物、制备方法及其在近红外生物成像中的应用。
为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：
一种罗丹明衍生物Rh-1，其特殊之处在于，其化合物结构为：
上述罗丹明衍生物Rh-1的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
1)制备(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮
将6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮溶解在DMF溶液后，加入K2CO3，待抽真空除氧后，50-70℃下加热搅拌10-20min后，加入碘乙烷，反应12-24h后，将反应液加入水中使用乙酸乙酯(EA)萃取，保留有机相，真空除去有机相得到黄色混合液体；随后使用硅胶柱层析对黄色混合液体提纯，得到黄色液体，即为(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮；
该步骤化学方程式如下：
化合物式一即为(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮；
2)制备罗丹明衍生物Rh-1
取4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸和步骤1)制得的(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮加至反应容器中，并置于冰水浴中搅拌冷却10-20min，结束后向反应容器中加入浓硫酸并继续搅拌5-10min后撤去冰浴；
将反应容器在油浴中加热至90-100℃并搅拌反应1.5～2h；反应结束待反应体系冷却至室温，将反应液直接倒入冰水中，滴加高氯酸并搅拌5-10min；搅拌结束后过滤去除液体保留固体，使用层析硅胶色谱柱纯化粗产物，得到蓝黑色固体粉末，即目标产物罗丹明衍生物Rh-1；
该步骤化学方程式如下：
进一步地，步骤1)中，6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮、碘乙烷和K2CO3的摩尔比为1∶2.5-4∶2，每克6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮对应添加10-15mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
进一步地，步骤2)中，4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸和6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮的摩尔比为1∶1，每克4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸对应添加10mL浓硫酸，且高氯酸、浓硫酸和冰水的体积比为1-5∶10∶200-400。
本发明还提供了上述罗丹明衍生物Rh-1在近红外一区(600nm～800nm)荧光成像(包含生物成像，即体外细胞成像和生物活体成像)中的应用，以及其作为或制备近红外一区荧光造影剂中的应用。
进一步地，相比于商业光敏剂罗丹明B(RhB)在体外细胞荧光成像10min后便开始出现光漂白现象，而Rh-1在体外细胞荧光成像持续20min后，未出现明显的光漂白现象。
进一步地，相比于商业光敏剂罗丹明B(RhB)在小鼠体内仅持续2h的肝部成像，Rh-1在小鼠体内肝部高亮度的荧光成像能够持续至少6h，且荧光强度是RhB的3倍左右。
基于上述应用，本发明提供了一种近红外一区荧光造影剂，其特殊之处在于：其有效成分为上述罗丹明衍生物(Rh-1)，该造影剂的制备过程很简单，根据荧光成像环境，利用罗丹明衍生物(Rh-1)和去离子水直接配制至相应的浓度即可使用。
进一步地，该造影剂于体外细胞荧光成像时，罗丹明衍生物(Rh-1)的质量浓度为2μg/mL，比如肝细胞；于活体荧光成像时，罗丹明衍生物(Rh-1)的质量浓度为239.5μg/mL，比如，用于小鼠肝脏组织活体成像所用浓度及注射量为：239.5μg/mL和200μL，可精选在注射药物20h时间内的不同时间点，对小鼠麻醉后即刻拍照，从而记录不同时间点的小鼠肝脏成像的荧光信号强度。
本发明的构思及原理：
鉴于罗丹明染料本身优异的光物理性能，以及目前罗丹明染料无法在近红外区进行荧光成像所面临的问题，本发明研究团队拟继续在罗丹明染料中寻找能够符合要求的荧光染料。本发明在研究过程中，通过氨基酚与酸酐反应，以浓硫酸为催化剂缩合及Fries重排制备了一种新的罗丹明衍生物，即Rh-1，并对其进行了检测，发现其具有1199nm-1的斯托克斯位移，较罗丹明B(RhB)增加了482nm-1，其最大吸收波长比RhB红移50nm，最大发射波长更是比RhB红移72nm，具有较大的斯托克斯位移；其次，该化合物荧光量子效率也几乎是RhB的二倍，具有高亮度的特点；此外，Rh-1为水溶性的小分子，在水溶液中性质十分稳定，具有高稳定的优势；因此，本发明研究团队认为该新的罗丹明衍生物Rh-1作为能够在近红外区发射、具有较大斯托克斯位移和高量子产率、且具有高稳定和高亮度特点的罗丹明染料，其在细胞和活体成像中势必占有优势，并对此进行了验证，确实如研究团队期望的一样，其应用方便快捷，且相比于目前的RhB，Rh-1将会在近红外一区具有更深的活体成像深度以及更高信噪比的优势。
本发明的优点：
1.本发明提供了罗丹明B衍生物Rh-1以及它的制备方法和它在近红外生物成像的应用，将检测该化合物在去离子水中最大吸收波长为603nm，最大发射波长为650nm，其荧光量子效率达到51.12％，几乎是商业光敏剂罗丹明B的二倍，能够在近红外区发射，并且具有较大的斯托克斯位移和高量子产率，满足荧光成像条件，不仅能够长时间成像，还能最大限度地减少对生物样品的光损伤，增加组织穿透深度，并最大限度地减少生物自身荧光信号的干扰。
2.本发明首次使用该罗丹明衍生物Rh-1进行细胞荧光成像和活体动物成像，在此基础上本发明将其应用至细胞内长时间的荧光成像，获得了细胞结构清晰、抗漂白的细胞成像效果；将其应用至小鼠体内的肝脏部位长时间的荧光成像，获得了荧光信号强，成像维持时间久的体内成像效果。
3.采用罗丹明B衍生物Rh-1进行荧光成像，操作简单易行，在医学领域具有广泛的应用前景，比如，肝脏再生系统成像。
附图说明
图1为化合物Rh-1的1H NMR(500MHz)；
图2为化合物Rh-1的13C NMR(500MHz)；
图3为化合物Rh-1的质谱；
图4为化合物Rh-1的紫外吸收光谱图及荧光发射光谱图；
图5为化合物Rh-1的水中的摩尔消光系数图；
图6为化合物Rh-1在L02细胞中不同时间点细胞成像图；
图7为化合物Rh-1以及RhB在活体小鼠内不同时间点肝脏的荧光成像对比图；
图8为化合物Rh-1以及RhB在活体小鼠内不同时间点肝脏的荧光信号强度对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：
若无特别强调，实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为市售分析纯。
一种罗丹明衍生物(Rh-1)，分子量为495g/mol，结构如下：
具体合成步骤如下：
1)制备式一化合物
将6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮(3.00g，18.61mmol)溶解在30mL DMF溶液后移至50mL两颈烧瓶中，再加入K2CO3(5.14g，37.20mmol)，待抽真空除氧后，60℃下加热搅拌20min后，再加入碘乙烷(8.71g，55.80mmol)，反应12h后，将反应液加入水中使用EA萃取，保留有机相，真空除去有机相得到黄色混合液体。随后使用硅胶柱层析提纯(EA∶PE＝1∶5)，得到黄色液体即为化合物式一(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮(3.25g，14.96mmol))，产率：80.36％。
2)制备目标产物Rh-1
取4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸(1.00g，3.19mmol)和化合物式一(0.70g，3.22mmol)加至50mL单口烧瓶，将烧瓶置于冰水浴中搅拌冷却10min。结束后向反烧瓶中加入10mL 98％的浓硫酸并继续搅拌5min后撤去冰浴。将烧瓶在油浴中加热至90℃并搅拌反应1.5h。反应结束待反应体系冷却至室温，将反应液直接倒入300mL冰水中，再滴加3mL高氯酸并搅拌5min。搅拌结束后过滤去除液体保留固体，使用层析硅胶色谱柱纯化粗产物(VMeOH∶VDCM＝1∶20)，得到N-(7-(2-羧基苯基)-3-(二乙氨基)-5，6-二氢-10H-苯并[c]呫吨-10-亚基)-N-乙基乙胺(Rh-1)，蓝黑色固体粉末，即目标产物Rh-1(1.12g，2.27mmol，产率：71.10％)。
Rh-1的1H NMR如图1所示，1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.24(s,1H),8.29–8.16(m,2H),7.90(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.80(td,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.45(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.25(d,J＝2.5Hz,1H),7.11(dd,J＝9.4,2.5Hz,1H),6.97(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),6.79(d,J＝2.5Hz,1H),3.62(qd,J＝7.1,2.8Hz,8H),3.01–2.80(m,2H),2.48(ddt,J＝18.6,9.5,5.0Hz,2H),1.24(td,J＝7.0,4.2Hz,12H)。
Rh-1的13C NMR如图2所示，13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ167.09,156.42,153.57,153.31,145.86,133.53,131.19,130.45,130.42,129.80,129.55,129.06,115.34,114.38,113.22,112.27,110.87,96.52,45.21,45.00,27.37,23.98,13.07,12.85.
Rh-1的质谱图如图3所示,LC-MS(ESI):calcd for C32H35N2O3 +[M]+＝495.26，foundm/z＝495.36。
本发明在该化合物制备工艺参数范围内通过上述方法同样能够制备出Rh-1。
本发明为了印证化合物Rh-1的应用，还进行了以下实验：
一、化合物Rh-1的紫外吸收光谱测试实验
实验具体细节如下：
以去离子水作为溶剂，配制质量浓度为1μg/mL的Rh-1溶液，将Rh-1充分溶解后，使用移液枪吸取2mL上述溶液加入四通石英比色皿中备用。
首先使用日立UH5300紫外分光光度对加入去离子水的四通石英比色皿进行基线校正，待上述操作结束后，放入盛装有待测样品的比色皿，并测量其在300～900nm范围内的吸收光谱。
二、化合物Rh-1的荧光发射光谱测试实验
实验具体细节如下：
以去离子水作为溶剂，配制质量浓度为1μg/mL的Rh-1溶液，将Rh-1充分溶解后，使用移液枪吸取2mL上述溶液加入四通石英比色皿中备用。
使用HORIBA-3荧光光谱仪测量待测样品溶液的荧光发射光谱。激发波长选择580nm、狭缝选择5×5mm、激发电压选择650V、测量范围590～900nm。
化合物Rh-1的紫外吸收光谱图及荧光发射光谱图如图4所示。其最大吸收波长为603nm，最大发射波长为650nm，斯托克斯位移相比与罗丹明B明显增加了482nm-1，可降低材料本身的自淬灭现象，从而能够更好的应用于荧光成像。
三、化合物Rh-1的摩尔消光系数的实验
实验具体细节如下：
以去离子水作为溶剂，配制质量浓度为50μg/mL的Rh-1溶液备用。使用日立UH5300紫外分光光度对加入去离子水的四通石英比色皿进行基线校正，待上述操作结束后，使用移液枪吸取2mL去离子水，并加入提前配好的120μL 50μg/mL的Rh-1溶液，并测量其吸收光谱，测量结束之后继续向比色皿中加入130μL 50μg/mL的Rh-1溶液，再次测量其吸收光谱，如此步骤，梯度增加比色皿中Rh-1的浓度，每次向比色皿中继续加入130μL 50μg/mL的Rh-1溶液再重复5次，测量结束后对吸收光谱作图，并根据测量的浓度对应的吸光度的拟合，其斜率即为Rh-1的摩尔消光系数。如图5所示，Rh-1的摩尔消光系数为4.13×104M-1cm-1，大于临床批准的Photofrin光敏剂(摩尔消光系数:1.17×103M-1cm-1)的10倍，说明Rh-1具有优异的吸光能力。
四、化合物Rh-1在L02细胞中不同时间点细胞成像实验
对指数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后，离心、重悬细胞、并计数，以80000个/mL的细胞密度接种至共聚焦皿中，12h后弃掉原有培养液，按此方式准备两份样品，分别加入含有2μg/mL Rh-1以及2μg/mL RhB的无血清DMEM培养液，继续培养3h后利用共聚焦进行细胞成像，并用激光共聚焦照射分别在5、10、15、20min后均进行拍照，对比Rh-1和RhB的抗漂白性能。如图6所示，RhB组在光照10min后便开始出现光漂白现象，而Rh-1在体外细胞荧光成像持续20min后，仍未出现明显的光漂白现象，这证明Rh-1在细胞成像中具有良好的抗光漂白能力。
五、化合物Rh-1以及RhB在活体小鼠内不同时间内的肝脏的荧光成像对比
两只C57小鼠去除腹部毛发干扰，通过尾静脉注射向小鼠体内注射200μL239.5μg/mL的Rh-1和RhB后，使用异氟烷对小鼠麻醉后立即用NIR-I活体成像仪对小鼠的肝脏进行成像，并且监测1、2、3、4、5、6、8、10、20h不同时间点的肝脏荧光信号强度。如图7所示，不同时间点肝脏的荧光成像对比图显示，相比于商业光敏剂RhB在小鼠体内仅持续2h的肝部成像，Rh-1在小鼠体内肝部高亮度的荧光成像可持续至少6h；不同时间点荧光信号强度如图8所示，Rh-1肝部荧光成像的信号强度是RhB的3倍左右。这说明Rh-1在活体成像中具有高稳定性、高亮度的应用潜力。
通过上述实验的验证，能够充分证明本发明制备的罗丹明衍生物(Rh-1)在近红外一区荧光成像中的应用，可以作为近红外一区荧光造影剂的有效成分。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种罗丹明衍生物Rh-1，其特征在于，其化合物结构为：
2.权利要求1所述罗丹明衍生物Rh-1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮
将6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮溶解在N,N-二甲基甲酰胺溶液后，再加入K2CO3，待抽真空除氧后，50-70℃下加热搅拌10-20min后，加入碘乙烷，反应12-24h后，将反应液加入水中使用乙酸乙酯萃取，保留有机相，真空除去有机相得到黄色混合液体；
随后使用硅胶柱层析对黄色混合液体提纯，得到黄色液体，即为(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮；
2)制备罗丹明衍生物Rh-1
取4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸和步骤1)制得的(6-(二乙氨基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮加至反应容器中，并置于冰水浴中搅拌冷却10-20min，结束后向反应容器中加入浓硫酸并继续搅拌5-10min后撤去冰浴；
将反应容器在油浴中加热至90-100℃并搅拌反应1.5-2h；反应结束待反应体系冷却至室温，将反应液直接倒入冰水中，再滴加高氯酸并搅拌5-10min；搅拌结束后过滤去除液体保留固体，使用层析硅胶色谱柱纯化粗产物，得到蓝黑色固体粉末，即目标产物罗丹明衍生物Rh-1。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：
步骤1)中，6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮、碘乙烷和K2CO3的摩尔比为1∶2.5-4∶2，每克6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮添加10-15ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
步骤2)中，4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸和6-氨基-3，4-二氢萘-1(2H)-酮的摩尔配比关系为1∶1，高氯酸、浓硫酸和冰水的体积比为1-5∶10∶200-400，每克4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基-2-苯甲酸添加10mL浓硫酸。
5.权利要求1所述罗丹明衍生物Rh-1在近红外一区荧光成像中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：罗丹明衍生物Rh-1在体外细胞荧光成像持续20min后，未出现明显的光漂白现象。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于：罗丹明衍生物Rh-1在小鼠体内肝部高亮度的荧光成像能够持续至少6h。
8.权利要求1所述罗丹明衍生物Rh-1作为或制备近红外一区荧光造影剂中的应用。
9.一种近红外一区荧光造影剂，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述罗丹明衍生物Rh-1。
10.根据权利要求9所述近红外一区荧光造影剂，其特征在于：
于体外细胞荧光成像时，罗丹明衍生物(Rh-1)的质量浓度为2μg/mL；
于活体荧光成像时，罗丹明衍生物(Rh-1)的质量浓度为239.5μg/mL。
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