KR101779923B1 - 미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법 - Google Patents

미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포 및 생체조직 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되어 미토콘드리아 내 pH 변화를 정량적으로 영상화할 수 있는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아에 선택적으로 염색됨과 동시에 pH 변화에 따라 탈수소 반응을 하여 강한 형광 색 변화를 나타내며, 물에 대한 우수한 용해도와 작은 분자량으로 인해 세포에 쉽게 로딩될 수 있고, 60분 이상에 걸쳐 세포 및 100~200 ㎛ 깊이의 생체조직에서 선택적으로 pH를 검출할 수 있으므로, 세포 및 생체조직에서 미토콘드리아 내부의 pH의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화 할 수 있다.

Description

미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법{Ratiometric two-photon fluorescent probe for detecting mitochondrial pH value and method for preparing the same}
본 발명은 미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포 및 생체조직 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되어 미토콘드리아 내 pH 변화를 정량적으로 영상화할 수 있는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
미토콘드리아는 여러 세포 기능에 필요한 에너지를 생성하는 소기관이다. 미토콘드리아가 에너지를 생성해 내는 주요 기전 중 하나는 양성자를 외부로 배출시키는 것이고, 이로 인해 미토콘드리아의 내부와 외부에는 전위차가 발생한다. 또한 미토콘드리아 내부의 pH는 약염기성(pH 7.8-8.0)을 유지하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 미토콘드리아의 pH가 비정상적인 영역으로 바뀌면 이는 다양한 기능의 장애, 신경질환 및 암 등의 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 살아있는 세포 및 생체조직 내에 존재하는 미토콘드리아의 pH를 정량적이고 실시간으로 검출하는 방법은 알려져 있지 않다. 이에 대해 미토콘드리아에 선택적으로 위치하고 pH의 변화에 선택적으로 감응하는 가변색 형광 프로브를 개발하면 살아있는 세포와 조직의 깊은 곳에서 진행되는 생물학적인 현상을 실시간으로 관찰 할 수 있게 해주어, pH와 관련된 생명과학 연구와 질병의 조기 진단, 진단 시약과 치료제의 개발 등에 크게 기여 할 수 있을 것으로 기대된다.
현재 수많은 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나, 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(<500 ㎚) 사용에 있다. 짧은 여기 파장은 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photo-bleaching) 및 세포 자가 형광(auto-fluorescence) 등의 문제를 야기함으로써 조직 영상화(imaging)에 대한 적용을 제한한다. 이러한 문제에 대한 해결책으로 제시된 것이 낮은 에너지의 2개의 근적외선 광자를 이용하는 이광자 현미경(TPM)을 사용하는 방법이다. 이광자 현미경을 사용하면, 손상되지 않은 100 ㎛ 깊이 이상의 생체조직 내부를 관찰할 수 있고 장시간의 영상을 실시간으로 만들 수 있다. 그러나 생체조직 내 존재하는 미토콘드리아 내부의 pH를 선택적으로 검출할 수 있는 이광자 가변색 형광 프로브는 전무한 상태이다.
따라서, 세포 및 생체조직 내 미토콘드리아 내부의 pH를 선택적으로 검출할 수 있는 이광자 가변색 형광 프로브의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 미토콘드리아 내 pH 검출 방법을 탐색하던 중, 생체 내 미토콘드리아에 선택적으로 염색되고 pH에 감응하여 강한 형광 변화를 나타내는 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하였으며, 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내부의 pH의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 미토콘드리아 내 pH에 감응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 미토콘드리아 내 pH의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 미토콘드리아 내 pH에 감응하여 형광 색이 변화하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 가변색 이광자 형광 프로브를 이용하여 미토콘드리아 내 pH의 분포 및 활성을 이광자 현미경을 통해 정량적으로 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브는 미토콘드리아에 선택적으로 염색됨과 동시에 pH 변화에 따라 감응하여 강한 형광 색 변화를 나타내며, 물에 대한 우수한 용해도와 작은 분자량으로 인해 세포에 쉽게 로딩될 수 있고, 60분 이상에 걸쳐 세포 및 100~200 ㎛ 깊이의 생체조직에서 선택적으로 pH를 검출할 수 있으므로, 세포 및 생체조직에서 미토콘드리아 내부의 pH의 분포 및 활성을 정량적으로 영상화 할 수 있다.
도 1은 완충용액에서 pH에 따른 (a) CMP1 및 (b) CMP2의 단일 광자 형광 방출 스펙트럼을 나타내는 도이다. 여기 파장은 각각 CMP1는 425nm이고, CMP2는 435nm이다.
도 2는 완충용액에서 pH에 따른 (a) CMP1 및 (b) CMP2의 I yellow /I iso 및 I red /I iso 를 타나내는 도이다. 여기 파장은 각각 CMP1는 425nm이고, CMP2는 435nm이다.
도 3은 CMP2 및 mCherrymito-7로 공동-표지된 HeLa 세포의 (a) 이광자 영상(TPM), (b) 단일광자 영상(OPM) 및 (c) 상기 (a) 및 (b)를 합친 영상이다. 이광자 및 단일광자 여기 파장은 각각 820 및 554 nm이었고, 상응하는 방출 파장은 450-550 nm (CMP2) 및 650-700 nm (mCherrymito-7)에서 수집되었다. 상기 영상은 반복적인 실험(n=5)에 의한 대표 영상이고, 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 4는 (a) 2μM CMP2로 배양된 이오노포어(ionophore) 처리된 HeLa 세포의 슈도 컬러(Pseudocolored) 가변색 이광자 영상(I red /I green )이고, (b) HeLa 세포에서 pH에 따른 이광자 I red /I green 적정 곡선이고, (c) 상기 (a)에서 백색 박스 위치를 확대한 고배율 영상이고, (d) 상기 (a)에서 적색 박스 위치를 확대한 고배율 영상이다. (c) 및 (d)에서 화살표는 관심있는 위치의 pH 값을 나타낸다. 여기 파장은 820 nm이고, 상기 영상은 반복적인 실험(n=8)에 의한 대표 영상이고, 스케일 바는 (a)는 13 ㎛이고, (c) 및 (d)는 4 ㎛이다.
도 5는 20 μM CCCP로 각각 (a) 선처리되기 전, (b) 1시간 동안 선처리, 및 (e) 6시간 동안 선처리된, 2μM CMP2로 염색된 HeLa 세포의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )이고, (c) 상기 (b)에서 박스 위치의 고배율 영상이고, (f) 상기 (e)에서 박스 위치의 고배율 영상이다. (c) 및 (f)에서 화살표는 관심있는 위치의 pH 값을 나타낸다. (d) TPM 영상에서 I red /I green 비율로부터 평가된 pH 값의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 여기 파장은 820 nm이고, 상기 영상은 반복적인 실험(n=8)에 의한 대표 영상이고, 스케일 바는 각각 (a) 15 ㎛, (b) 14 ㎛, (c) 4 ㎛, (e) 12 ㎛, 및 (f) 3 ㎛이다.
도 6은 2μM CMP2로 염색하기에 앞서 0~6시간 동안 아미노산/혈청-부족 완충용액에서 굶주린 HeLa 세포의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )이다. 여기서 (a) 대조군, (b) 2시간, (c) 4시간, (d) 6시간이고, (f, g, h)는 각각 (b, c, d)의 박스 위치의 고배율 영상이다. (f, g, h)에서 화살표는 관심있는 위치의 pH 값을 나타낸다. (d) TPM 영상에서 I red /I green 비율로부터 평가된 pH 값의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 여기 파장은 820 nm이고, 상기 영상은 반복적인 실험(n=5)에 의한 대표 영상이고, 스케일 바는 각각 (a) 16 ㎛, (b) 16 ㎛, (c) 12 ㎛, (d) 15 ㎛, (f) 4 ㎛, (g) 3 ㎛, 및 (h) 3 ㎛이다.
도 7은 (a) 20μM CMP2로 염색한 쥐의 해마절편의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )이다. 여기서 전체 미토콘드리아 내 pH 분포를 가시화하기 위해 약 90-210 ㎛ 정도의 깊이에서 z축 방향에 따른 360개의 TPM 영상을 결합한 영상이다(10x). (b, c, d) 각각 (b) CA1, (c) CA3, 및 (d) DG에 있는 박스 위치를 40 배 확대한 영상이다. 여기 파장은 820 nm이고, 스케일 바는 각각 (a) 300 ㎛, 및 (b, c, d) 48 ㎛이다.
본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015096739824-pat00001
[화학식 2]
Figure 112015096739824-pat00002
또한, 본 발명은
(1) 6-메톡시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온 및 에틸포르메이트를 반응시켜 화학식 A의 화합물을 제조하는 단계; (2) 상기 화학식 A의 화합물과 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논을 반응시켜 화학식 B의 화합물을 제조하는 단계; (3) 상기 화학식 B의 화합물과 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온을 반응시켜 화학식 C의 화합물을 제조하는 단계; (4) 상기 화학식 C의 화합물과 알코올을 반응시켜 화학식 D의 화합물을 제조하는 단계; 및 (5) 상기 화학식 D의 화합물과 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄염을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계;를 포함하며, 하기 반응식 1로 표시되는 화학식 1의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112015096739824-pat00003
또한, 본 발명은
(1') 나프탈렌-2,7-디올 및 클로로메틸 메틸 에테르를 반응시켜 화학식 E의 화합물을 제조하는 단계; (2') 상기 화학식 E의 화합물과 아이오도메탄을 반응시켜 화학식 F의 화합물을 제조하는 단계; (3') 상기 화학식 F의 화합물과 디메틸포름아미드(DMF)를 반응시켜 화학식 G의 화합물을 제조하는 단계; (4') 상기 화학식 G의 화합물과 산(acid)을 반응시켜 화학식 H의 화합물을 제조하는 단계; (5') 상기 화학식 H의 화합물과 디메틸 말론산을 반응시켜 화학식 I의 화합물을 제조하는 단계; (6') 상기 화학식 I의 화합물과 물을 반응시켜 화학식 J의 화합물을 제조하는 단계; 및 (7') 상기 화학식 J의 화합물과 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄염을 반응시켜 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계;를 포함하며, 하기 반응식 2로 표시되는 화학식 2의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
[반응식 2]
Figure 112015096739824-pat00004
또한, 본 발명은
(a) 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 어느 하나의 가변색 이광자 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계; (b) 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 탈수소 반응을 하여 형광을 나타내는 단계; 및 (c) 상기 형광을 가변색 이광자 현미경으로 관측하는 단계;를 포함하는, 가변색 이광자 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아 내 pH의 영상화 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 미토콘드리아 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015096739824-pat00005
[화학식 2]
Figure 112015096739824-pat00006
본 발명에 따른 생체 내 pH 검출용 가변색 이광자 형광 프로브는, 트리페닐포스포늄염(triphenylphosphonium salt, TPP)을 미토콘드리아 탐침으로, 페놀의 산소를 수소이온 수용체로 하여 이광자 형광체인 벤조크로멘 유도체 화합물에 도입시킨 것을 특징으로 한다.
상기 화학식 1(CMP1) 또는 화학식 2(CMP2)로 표시되는 이광자 형광 프로브는 생체 내 수소이온 농도(pH)가 산성에서 염기성으로 변화함에 따라 공명안정화에 따른 분자내 전하 이동(intramolecular charge transfer, ICT)의해 이광자 형광 프로브의 양성자화 부위인 페놀에서 페놀레이트가 형성되면서 적색 시프트된 형광이 발생하므로, 비율계량법에 의한 pH 탐침으로 적용이 가능하다.
[반응식]
Figure 112015096739824-pat00007
본 발명의 일 실시에 따르면, 상기 CMP2은 굽은-π-형(bent-π-shaped) 구조로서, 직선-π-형(bent-π-shaped) 구조를 갖는 CMP1에 비해 더 높은 컨주게이션 경로(conjugation pathway)을 가지므로 더 향상된 ICT 프로세스를 수행할 수 있다.
상기 화학식 1(CMP1) 또는 화학식 2(CMP2)로 표시되는 이광자 형광 프로브는 세포 내 소기관 중 미토콘드리아에 선택적으로 염색되며, 상기와 같이 탈수소 반응으로 인해 450~650 nm 범위의 가시광선 형광을 나타낸다. 따라서, 수소이온에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 형광 프로브로서 이용될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1(CMP1) 또는 화학식 2(CMP2)의 이광자 형광 프로브는 기존 사용되던 단일광자 형광 프로브와는 달리 100 ~ 200 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 또는 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체조직에서 미토콘드리아 내부의 수소이온 농도(pH)를 검출할 수 있고, 상기 이광자 형광 프로브의 짝염기(conjugate bases)의 pK a는 7.0~8.0로서 미토콘드리아의 pK a 값인 8.0에 유사하므로 세포 또는 생체조직의 미토콘드리아 내 pH를 효과적으로 검출할 수 있다.
또한, 상기 이광자 형광 프로브는 pH 6.0~9.0 범위에서 pH에 따라 선형의 형광 방출 비율을 나타냄으로써, 두 프로브 모두 상기 범위에서 pH 값을 결정하는데 바람직하다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60 분 이상 지속적인 수소이온 탐지가 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분~90 분 동안 탐지가 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
(1) 6-메톡시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온 및 에틸포르메이트를 반응시켜 화학식 A의 화합물을 제조하는 단계; (2) 상기 화학식 A의 화합물과 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논을 반응시켜 화학식 B의 화합물을 제조하는 단계; (3) 상기 화학식 B의 화합물과 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온을 반응시켜 화학식 C의 화합물을 제조하는 단계; (4) 상기 화학식 C의 화합물과 알코올을 반응시켜 화학식 D의 화합물을 제조하는 단계; 및 (5) 상기 화학식 D의 화합물과 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄염을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계;를 포함하며, 상기 반응식 1로 표시되는 화학식 1의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1') 나프탈렌-2,7-디올 및 클로로메틸 메틸 에테르를 반응시켜 화학식 E의 화합물을 제조하는 단계; (2') 상기 화학식 E의 화합물과 아이오도메탄을 반응시켜 화학식 F의 화합물을 제조하는 단계; (3') 상기 화학식 F의 화합물과 디메틸포름아미드(DMF)를 반응시켜 화학식 G의 화합물을 제조하는 단계; (4') 상기 화학식 G의 화합물과 산(acid)을 반응시켜 화학식 H의 화합물을 제조하는 단계; (5') 상기 화학식 H의 화합물과 디메틸 말론산을 반응시켜 화학식 I의 화합물을 제조하는 단계; (6') 상기 화학식 I의 화합물과 물을 반응시켜 화학식 J의 화합물을 제조하는 단계; 및 (7') 상기 화학식 J의 화합물과 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄염을 반응시켜 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계;를 포함하며, 상기 반응식 2로 표시되는 화학식 2의 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 가변색 이광자 형광 프로브의 제조 방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 (1)~(5)단계는 화학식 1(CMP1)로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 단계이다.
상기 (1)단계는 화학식 A의 화합물을 제조하는 단계로, 공지된 화합물인 6-메톡시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온에 에틸포르메이트를 가하고, 질소분위기 하에서 교반 및 세척하고, 이를 진공하에 건조함으로써 갈색 고체인 화학식 A의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (2)단계는 화학식 B의 화합물을 제조하는 단계로, 상기 화학식 A의 화합물에 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논을 가한 후, 이를 교반하고 여과하여 얻은 조생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체 화합물인 화학식 B의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (3)단계는 화학식 C의 화합물을 제조하는 단계로, 에탄올 내에 있는 화학식 B의 화합물 및 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온의 용액에 피페리딘을 가하여 얻은 침전물을 진공하에 건조함으로써 황색의 고체 화합물인 화학식 C의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (4)단계는 화학식 D의 화합물을 제조하는 단계로, HBr 내에 있는 화학식 C의 화합물을 고온에서 교반 및 냉각한 후, 이에 알코올을 가하여 조생성물을 수득한 후, 이를 결정화시킴으로써 황색 고체 화합물인 화학식 D의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (5)단계는 화학식 1의 화합물(CMP1)을 제조하는 단계로, 화학식 D의 화합물, (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 및 1-히드록시벤조트리아졸을 건조 DMF에 용해하고, N,N-디이소프로필 에틸아민을 가하여 교반하고, 이에 (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 가하여 얻은 혼합물을 교반하여 조생성물을 수득한 후, 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체인 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (1')~(6')단계는 화학식 2(CMP2)로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 단계이다.
상기 (1')단계는 화학식 E의 화합물을 제조하는 단계로, 공지된 화합물인 무수 DMF 내 나프탈렌-2,7-디올에 클로로메틸 메틸 에테르 및 소듐 하이드라이드를 가하여 반응 혼합물을 제조하고, 이에 에틸 아세테이트를 가하고 교반하여 얻은 조생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 백색 고체인 화학식 E의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (2')단계는 화학식 F의 화합물을 제조하는 단계로, DMF 내 화학식 E의 화합물에 아이오도메탄을 가한 후, 이를 교반하고 세척하여 얻은 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 농축 액체인 화학식 F의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (3')단계는 화학식 G의 화합물을 제조하는 단계로, 무수 디에틸 에테르 내에 있는 화학식 F의 화합물에 tert-부틸 리튬을 가한 후, 이에 무수 DMF를 가하고 교반하여 얻은 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 백색 고체로 변형되는 농축 액체인 화학식 G의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 (4')단계는 화학식 H의 화합물을 제조하는 단계로, 화학식 G의 화합물을 알코올에 용해하고, 이에 염산을 가하고 질소분위기 하에 교반하여 조생성물을 얻은 후, 이를 재결정함으로써 갈색 고체인 화합물 H를 제조할 수 있다.
상기 (5')단계는 화학식 I의 화합물을 제조하는 단계로, 에탄올 내 화학식 H의 화합물에 디메틸 말론산을 용해한 후, 이에 피페리딘을 가하고 질소분위기 하에 교반하여 조생성물을 얻은 후, 이를 재결정함으로써 갈색 고체인 화합물 I를 제조할 수 있다.
상기 (6')단계는 화학식 J의 화합물을 제조하는 단계로, 화학식 I의 화합물을 HBr에 용해한 후, 질소분위기 하에 교반하여 얻은 반응 혼합물에 물을 가하여 조생성물을 얻은 후, 이를 재결정함으로써 벽돌 적색 고체인 화합물 J를 제조할 수 있다.
상기 (7')단계는 화학식 2의 화합물(CMP2)을 제조하는 단계로, 화학식 J의 화합물, (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 및 1-히드록시벤조트리아졸을 건조 DMF에 용해하고, N,N-디이소프로필 에틸아민을 가하여 교반하고, 이에 (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 가하여 얻은 혼합물을 교반하여 조생성물을 수득한 후, 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체인 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 제조된 가변색 이광자 형광 프로브는 pH 4.0~9.0의 완충 용액에서 5.0~10.0 μM 용해도를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 가변색 이광자 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계; (b) 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 탈수소 반응을 하여 형광을 나타내는 단계; 및 (c) 상기 형광을 가변색 이광자 현미경으로 관측하는 단계;를 포함하는, 가변색 이광자 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아 내 pH의 영상화 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 이광자 형광 프로브를 매우 낮은 농도로 생체 내에 30 분 동안 주입시킴으로써 미토콘드리아에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 생체 내에 주입 후 이광자 현미경의 여기원은 820 nm에 해당하는 근적외선 빛을 사용하고, CMP1에 대해서는 400~500 nm(F파랑) 및 500~650 nm(F녹색)와 CMP2에 대해서는 450~550 nm(F녹색) 및 550~700 nm(F적색)의 두 채널에서 형광의 세기를 동시에 측정한다. 상기에 의해 관측되는 두 채널의 상대적 형광강도의 비율은 pH의 농도 변화에 따라 가변적인 특징을 나타낸다. 낮은 여기 에너지를 갖는 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하는 이광자 현미경(TPM)은 일광자 현미경에 비해서 90 ~ 200 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체조직에서 pH를 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60분 이상 지속적인 pH 검출이 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분~90 분 동안 검출이 가능하다.
상기와 같은 영상화 방법을 통해 미토콘드리아 내에서 pH의 분포 및 활동성을 효과적으로 영상화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 가변색 이광자 형광 프로브(CMP1 및 CMP2)의 제조
하기 반응식 1 및 2에서 6-메톡시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온(6-methoxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one) 및 나프탈렌-2,7-디올(naphthalene-2,7-diol)은 시그마 알드리치로부터 구매하여 사용하였고, 다른 화합물은 하기 반응식 1 및 2에 따라 제조하였다.
1.1 CMP1 (화학식 1)의 제조
[반응식 1]
Figure 112015096739824-pat00008
상기 반응식 1에서, (a): 포타슘 tert-부톡사이드(potassium tert-butoxide), 에틸포르메이트(ethylformate), 벤젠, 실온, 2시간; (b) 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논(2,3-Dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone, DDQ), 디옥산(dioxane), 실온, 2시간; (c) 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온(2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione), 피페리딘(piperidine), 아세트산, 에탄올, 80℃, 12 시간; (d) 48% HBr, 120℃, 12시간; (e) (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide), (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트((Benzotriazole-1-yioxy)tripyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate, PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt), N,N-디이소프로필 에틸아민(N,N-Diisopropyl ethylamine, DIPEA), N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF), 실온이다.
(1) 화학식 A 화합물의 제조
6-메톡시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온(6-methoxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one) (5.0 g, 39.62 mmol) 및 벤젠(150 mL) 내 포타슘 tert-부톡사이드 (8.9 g, 79.23 mmol)의 용액에 에틸포르메이트 (8 mL, 99.05 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 완료 후, 유기 용매를 감압하에 증발시켜 잔류물을 수득하였고, 상기 잔류물을 디에틸에테르 (100 mL)에 용해하고, 물로 세척하였다 (2 x 60 mL). 상기 물 층을 농축 HCl을 이용하여 pH 4로 조정하였다. 상기 산성 pH에서 갈색 침전물이 생성되었고, 이를 여과하여 수득한 후, H2O 및 헥산으로 세척하였다. 세척된 침전물을 진공하에 건조하여 갈색 고체인 화학식 A의 화합물을 수득하였다 (수율: 3.2 g (40 %)).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ14.65 (s, 1H), 7.94 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.85 (d, J=6.9Hz, 1H), 6.71 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 2.86 (t, J=6.8Hz, 2H), 2.55 (t, J=7.0Hz, 2H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ184.4, 172.3, 163.3, 144.4, 128.8, 125.0, 113.0, 112.8, 108.2, 55.6, 29.6, 23.5 ppm
(2) 화학식 B의 화합물의 제조
1,4-디옥산 내 화학식 A의 화합물(3.2 g, 15.67 mmol)의 용액에 아르곤 분위기 하에서 2,3-디클로로-5,6-디시아노벤조퀴논 (3.91 g, 17.24 mmol)를 방울방울 가한 후, 반응 혼합물을 추가적인 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 섬모충 필터(ciliate filter)를 통해 여과한 후, 여액을 감압하에 농축하였다. 조생성물을 용리액으로 에틸아세테이트:헥산(3:7 v/v)을 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체인 화학식 B의 화합물을 수득하였다 (수율: 2.1 g (66 %)).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ12.67 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.31 (d, J=9.2Hz, 1H), 7.41 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.15 (dd, J=2.4Hz, J=8.8Hz, 1H ), 7.05 (d, J=2.4Hz, 1H), 3.94 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ195.7, 195.5, 162.1, 161.6, 140.0, 127.7, 126.3, 118.6, 118.4, 113.5, 106.5, 55.8ppm.
(3) 화학식 C의 화합물의 제조
25mL 에탄올 내 화학식 B의 화합물 (500 mg, 2.47 mmol) 및 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온 (430 mg, 2.96 mmol)의 용액에 피페리딘(0.2mL) 및 아세트산(0.1mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 2시간 동안 80℃에서 교반하였다. 반응이 진행됨에 따라 황색 침전물이 생성되었고, 하룻밤 동안 교반 및 가열한 후, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 여과하여 침전물을 수득하였다. 잔류물을 에탄올로 여러 번 세척하고, 진공하게 건조하여 황색 고체인 화학식 C의 화합물을 수득하였다 (수율: 435 mg (65 %)).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ13.07 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.06 (d, J=9.2Hz, 1H), 7.61 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.57 (d, J=8.8Hz, 1H ), 7.30 (d, J=2.4Hz, 1H), 7.20 (dd, J =2.4Hz, J =8.8Hz, 1H), 3.87 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ164.6, 160.8, 157.3, 153.1, 150.1, 138.2, 126.2, 124.3, 132.9, 120.0, 116.8, 115.7, 112.5, 107.7, 56.3 ppm.
(4) 화학식 D의 화합물의 제조
HBr (4 mL, 48%) 내 화학식 C의 화합물 (400 mg, 1.62 mmol)의 현탁액을 120℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각하고 얼음 물에 붓고, 수득된 침전물을 여과 제거하였다. 잔류물을 끓는 MeOH (30 mL)로 처리하고 불용성 불순물을 여과하여 제거하였다. 여액을 증발시키고 조생성물을 디클로로메탄 및 헥산으로 결정화시켜 황색 고체인 화학식 D의 화합물을 수득하였다 (수율: 111 mg (24%)).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ13.09 (s, 1H), 10.54 (s, 1H), 8.80 (d, J=5.2Hz, 1H), 8.21 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.70 (m, 1H ), 7.59 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.23 (d, J =11.2Hz, 2H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ164.7, 159.7, 157.6, 153.7, 138.7, 126.0, 124.9, 132.7, 120.3, 116.2, 115.3, 112.7, 112.1, 110.6ppm.
(5) 화학식 1의 화합물 (CMP1)의 제조
화학식 D의 화합물 (100 mg, 0.39 mmol), (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (150 mg, 0.39 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (94 mg, 0.42 mmol)을 건조 DMF (10 mL)에 용해한 후, 반응 혼합물에 N,N-디이소프로필 에틸아민 (0.1 mL)을 첨가하고, 전체 반응물을 질소 분위기 하에서 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물에 (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (244 mg, 0.468 mmol)을 첨가하고, 전체 반응 혼합물을 어두운 조건에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조생성물을 용리액으로 CHCl3 내 10% 메탄올를 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체인 화학식 1의 화합물(CMP1)을 수득하였다 (수율: 85 mg (39 %)).
1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ10.62 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 8.86 (S, 1H), 8.27 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.78 (m, 17H ), 7.29 (d, S7 J=9.6Hz, 2H), 3.89 (m, 2H), 3.73 (m, 2H) ppm.
13C NMR (d6-DMSO, 100 MHz): δ162.4, 160.8, 159.9, 153.1, 149.7, 149.6, 138.7, 135.5, 134.2 (d, J=9.8Hz), 130.8 (d, J=12.9Hz), 126.1, 125.0, 124.2, 120.5, 119.4, 118.5, 116.1, 115.5, 112.6, 110.7, 34.1, 22.0 ppm.
1.2 CMP2 (화학식 2)의 제조
[반응식 2]
Figure 112015096739824-pat00009
상기 반응식 2에서, (a) 클로로메틸 메틸 에테르(Chloromethyl methyl ether), 소듐 히드라이드(Sodium hydride, NaH), N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF), 0℃ 내지 실온, 2시간; (b) 아이오도메탄(Iodomethane), 포타슘 카보네이트(potassium carbonate, K2CO3), DMF, 실온, 6시간; (c)tert-부틸리튬(tert-Butyllithium), DMF, 디에틸에테르(diethyl ether), -20℃; (d)이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol), 5(M) HCl, 65℃, 2시간; (e)디메틸 말론산(Dimethyl malonate), 피페리딘, 에탄올, 80℃, 12시간; (f) 48% HBr, 120℃, 12시간; (g) (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드((2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide), (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트((Benzotriazole-1-yioxy)tripyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate, PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt), N,N-디이소프로필 에틸아민(N,N-Diisopropyl ethylamine, DIPEA), DMF, 실온이다.
(1) 화학식 E의 화합물의 제조
나프탈렌-2,7-디올 (10.0 g, 62.43 mmol)을 무수 DMF (100 mL)에 용해한 후, 질소분위기 하에서 0℃로 냉각하고, 천천히 소듐 하이드라이드 (1.5 g, 62.43 mmol) 및 클로로메틸 메틸 에테르 (4.74 mL, 62.43 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30분 동안 동일한 온도에서 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물에 포화 암모늄 클로라이드 용액 (100 mL) 을 첨가하여 반응을 ??칭하고, 에틸 아세테이트를 첨가한 후, 전체 반응물을 30분 동안 교반하였다. 수집된 유기 층을 물로 세척하고 (2 x 50 mL), 무수 Na2SO4로 건조하고, 감압하에 농축하고, 조생성물을 용리액으로 에틸아세테이트:헥산(2:8 v/v)을 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 백색 고체인 화학식 E의 화합물을 수득하였다 (수율: 3.4 g (27 %)).
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ7.67 (t, J=9.6Hz, 2H), 7.22 (d, J=2.8Hz, 1H), 7.08 (dd, J=2.4Hz, J=8.8Hz, 1H), 6.98 (d, J=2.4Hz, 2H), 6.02 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 3.56 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz,): δ155.6, 154.2, 135.9, 129.8, 129.6, 125.1, 116.7, 116.2, 109.2, 108.9, 94.6, 56.5 ppm.
(2) 화학식 F의 화합물의 제조
DMF (30 mL) 내 화학식 E의 화합물 (3.39 g, 16.6 mmol)의 용액에 K2CO3 (3.44 g, 24.91 mmol)를 첨가하고, 질소분위기 하에서 30분 동안 교반하였다. 상기 용액에 아이오도메탄 (1.61 mL, 24.91 mmol)을 천천히 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 진공으로 제거하고, 잔류물을 염수 용액으로 세척한 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기 층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 후, 용리액으로 에틸아세테이트:헥산(2:8 v/v)을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 농축 액체인 화학식 F의 화합물을 수득하였다 (수율: 3.5g (96.7%)).
1H NMR(CDCl3, 400MHz): δ7.68 (t, J=8.6Hz, 2H), 7.34 (d, J=2.4Hz 1H), 7.10 (d, J=2.4Hz 1H), 7.08 (t, J=2.4Hz, 1H), 7.04 (dd, J=2.4Hz, J=8.8Hz, 1H), 5.30 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.54 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ158.3, 155.8, 135.9, 129.3, 129.2, 125.1, 116.9, 116.5, 109.5, 105.5, 94.7, 56.4, 55.6 ppm.
(3) 화학식 G의 화합물의 제조
무수 디에틸 에테르 (40 mL) 내 화학식 F의 화합물 (3.5 g, 16.06 mmol)의 용액에 tert-부틸 리튬 (23.37 mL, 24.1 mmol)을 질소 분위기 하에서 30분 동안 -20℃에서 방울방울 가하였다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 동일 온도에서 교반한 후, 상기 반응 혼합물에 무수 DMF (1.85 mL, 24.08 mmol)를 30분 동안 첨가하고, 전체 반응물을 질소분위기 하에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응물을 얼음물을 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조하고 유기 용매를 증발한 후, 용리액으로 에틸아세테이트:헥산(2:8 v/v)을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 백색 고체로 변형되는 농축 액체인 화학식 G의 화합물을 수득하였다 (수율: 1.21g (30.5%)).
1H NMR(CDCl3, 400MHz): δ10.53 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.75 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.03 (s, 2H), 5.39 (s, 2H), 3,91 (s, 3H), 3.56 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ189.9, 160.5, 156.0, 139.5, 131.7, 130.8, 129.6, 129.4, 123.9, 118.4, 109.3, 105.2, 95.0, 55.7 ppm.
(4) 화학식 H의 화합물의 제조
화학식 G의 화합물 (700 mg, 2.83 mmol)를 이소프로필 알코올 (15 mL)에 용해한 후, 상기 반응 혼합물에 5(M) HCl (7 mL)를 첨가하고, 65℃에서 3시간 동안 질소분위기 하에서 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 이소프로필 알코올을 감압하에 증발시켰다. 조생성물을 에틸 아세테이트에 용해한 후, 염수 용액으로 세척하였다 (2 x 30 mL). 유기 층을 Na2SO4로 건조하고 감압하에 농축하였다. 생성물을 디클로로메탄 및 헥산으로 재결정함으로써 갈색 고체인 화학식 H의 화합물을 수득하였다 (수율: 305 mg (53.1%)).
1H NMR(CDCl3, 400MHz): δ10.48 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.73 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.99 (dd, J=2.4Hz, J=8.8Hz, 1H), 6.95 (d, J=2.8Hz, 1H), 3,93 (s, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz,): δ196.1, 161.4, 156.9, 140.5, 137.6, 131.3, 123.2, 120.5, 118.2, 110.8, 104.4, 55.8 ppm.
(5) 화학식 I의 화합물의 제조
20 mL 에탄올 내 화학식 H의 화합물 (305 mg, 1.5 mmol) 및 디메틸 말론산 (0.186 mL, 1.62 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.045 mL, 0.45 mmol)을 방울방울 첨가하였다. 생성된 혼합물을 65 ℃에서 2시간 동안 질소분위기 하에서 교반한 후, 실온으로 냉각하고 감압하에 증발한 후, 조생성물을 디클로로메탄 및 헥산으로 재결정화하여 갈색 고체인 화학식 I의 화합물을 수득하였다 (수율: 353 mg (77%)).
1H NMR(CDCl3, 400MHz): δ8.64(d, J=17.6Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.16 (t, J=9.2Hz, 2H), 3.97 (s, 6H) ppm.
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ149.7, 149.1, 130.9, 130.8, 130.7, 120.3, 120.2, 111.5, 105.1, 62.2, 55.9, 53.2, 45.5, 24.4, 23.8, 14.7 ppm.
(6) 화학식 J의 화합물의 제조
화학식 I의 화합물 (350 mg, 1.2 mmol)를 HBr (10 mL)로 용해한 후 120℃에서 12시간 동안 질소분위기 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, H2O (50 mL)를 첨가하고, 생성된 침전물을 여과 제거한 후, 디에티 에테르로 세척하였다. 잔류물을 끓는 MeOH (30 mL)로 처리하고 불용성 불순물을 여과하여 제거하였다. 여액을 증발시키고 조생성물을 디클로로메칸/헥산으로 재결정하여 벽돌 적색 고체인 화학식 J의 화합물을 수득하였다 (수율: 160 mg (52.2 %)).
1H NMR(d6-DMSO, 400MHz): δ10.41(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.36 (s.1H), 7.90 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.11 (d, J=9.2Hz, 2H) ppm.
13C NMR (d6-DMSO, 100 MHz): δ164.6, 159.2, 157.6, 151.4, 149.5, 138.4, 132.1, 131.8, 125.3, 120.1, 117.2, 115.9, 110.2, 108.7 ppm.
(7) 화학식 2의 화합물(CMP2)의 제조
화학식 J의 화합물 (100 mg, 0.39 mmol), (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (166 mg, 0.43 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (104 mg, 0.47 mmol)을 건조 DMF (10 mL)에 용해한 후, 반응 혼합물에 DIPEA (0.1 mL)를 첨가하고, 전체 반응물을 실온에서 1시간 동안 질소분위기 하에서 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물에 (벤조트리아졸-1-옥시)트리피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)을 첨가하고, 전체 반응 혼합물을 어두운 조건에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조생성물을 용리액으로 CHCl3 내 10 % 메탄올을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제함으로써 황색 고체인 화학식 2의 화합물(CMP2)를 수득하였다 (수율: 64 mg (26.3%)).
1H NMR(d6-DMSO, 400MHz): δ10.49 (s, 1H), 8.99 (t, J=5.6Hz, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.81 (m, 17H), 7.16 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.70 (m, 2H) ppm.
13C NMR (d6-DMSO, 100 MHz): δ161.4, 160.1, 158.5, 150.1, 148.4, 148.3, 137.6, 134.7, 133.4 (d, J=9.9Hz), 131.6, 131.1, 130.0 (d, J=12Hz), 124.7, 119.5, 118.5, 117.7, 116.0, 115.2, 109.6, 108.0, 33.3, 21.3 ppm
실험예 1. 상이한 pH를 갖는 완충 용액에서 용해도 측정
상기 실시예 1의 이광자 형광 프로브(CMP1 및 CMP2)의 소량을 각각 0.1 M KH 프탈레이트 완충용액 (pH 4.0), 0.1 M KH2PO4 (pH 7.0) 및 0.025 M 소듐 보레이트 완충용액 pH 9.0)에 용해하였다. 그 결과, pH 7.0의 완충용액에서 CMP1 및 CMP2의 용해도는 각각 6μM을 나타내어 세포 염색에 충분한 것으로 나타났다. 또한, 유사한 결과가 pH 4.0의 완충용액에서도 나타났으나, pH 9.0의 경우에는 CMP2의 용해도가 10μM을 나타내어 CMP2의 용해도인 6μM보다 더 높은 것으로 나타났다.
실험예 2. 광물리적 특성
이광자 형광 프로브(CMP1 및 CMP2)의 광물리적 특성을 표 1에 나타내었다.
프로브 pH λmax (1)(10-4ε)b λmax fl c Φd pKa e λmax (2) f δg Φδh
CMP1

4.0 394 (1.35) 552 (480) 0.43 7.65 ±0.04 750 44 13
7.0 397 (1.20) 552 (480) 0.34 750 41 12
9.0 442 (1.64) 556 0.35 910 194 44
CMP2

4.0 370 (2.01) 542 0.06 7.75 ±0.05 750 92 5.5
7.0 371 (1.76) 542 0.05 750 92 4.6
9.0 453 (1.47) 604 0.02 910 220 4.4
[a] 모든 측정은 범용 완충 용액에서 실시하였다.
[b] 단일광자 흡수 스펙트럼의 λmax 값으로, 단위는 nm이다. 괄호 안의 숫자는 몰 흡광 계수로 M-1cm-1 단위이다.
[c] 단일광자 방출 스펙트럼의 λmax 값으로, 단위는 nm이다. 괄호 안의 숫자는 숄더(shoulder) 값이다.
[d] 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield).
[e] 단일광자 모드로 측정된 pKa 값이다.
[f] 이광자 여기 스펙트럼의 λmax 값으로 단위는 nm이다.
[g] 이광자 흡수 단면적(two photon absorption cross-section))으로 GM의 단위를 가진다(1GM = 10-50 cm4 s/photon).
[f] 이광자 동작 단면적이다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, pH 7.0에서 CMP1은 397nm에서 최대 흡수 파장 및 552nm에서 최대 방출 파장을 가져 155nm의 스토크스 시프트(Stokes shift)를 나타내었다. 반면에, CMP2는 371nm에서 최대 흡수 파장 및 542nm에서 최대 방출 파장을 가져 171nm의 스토크스 시프트(Stokes shift)나타내었다. 또한, pH 9.0에서 CMP1은 114nm의 스토크스 시프트를 나타낸 반면, CMP2는 151nm의 스토크스 시프트를 나타내었다. 상기 pH 9.0에서 CMP1에 비해 CMP2의 높은 스토크스 시프트는 CMP2의 더 높은 컨주게이션 경로(conjugation pathway)에 따른 것으로, CMP2의 더 높은 ICT 프로세스를 용이하게 만든다. 또한, 유사한 관찰이 산성 pH 4.0의 경우에도 나타났다.
실시예 1의 이광자 형광 프로브(CMP1 및 CMP2)의 pH 영상 능력을 평가하기 위해, 산성으로부터 염기성까지의 pH 변화에 따른 CMP1 및 CMP2의 pH 프로파일을 측정하였다. pH에 따른 (a) CMP1 및 (b) CMP2의 단일 광자 형광 방출 스펙트럼을 도 1에 나타내었다. 여기서, 여기 파장은 각각 CMP1는 425nm이고, CMP2는 435nm이다.
도 1(b)에 나타난 바와 같이, pH 2.0에서 11.0으로 변화함에 따라 CMP2의 방출 스펙트럼은 542nm 파장에서 점점 감소하고, 604nm 파장에서 점점 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 520-558 nm (Fgreen) 및 587-622 nm (Fred)에서의 방출 강도의 비율(Fred/Fgreen)은 pH가 산성에서 염기성으로 변화함에 따라 145 배 증가하였다. 이러한 스펙트럼의 적색 시프트는 ICT 프로세스를 강화하는 염기성 pH에서의 페놀레이트의 형성때문이다. 또한, 도 1(a)에 나타난 바와 같이, 산성에서 염기성으로 pH가 변화함에 따라 유사한 적색 시프트 스펙트럼 변화가 CMP1에 대해서도 관찰되었다.
실험예 3. 이광자 형광 프로브(CMP1 및 CMP2)의 P K a
pH에 따른 (a) CMP1에 대한 방출비율(I yellow /I iso ) 및 (b) CMP2에 대한 방출비율(I red /I iso )를 도 2에 나타내었다. 여기서, 여기 파장은 각각 CMP1는 425nm이고, CMP2는 435nm이다. I iso 는 등방출점(isoemission point)을 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이, CMP1 및 CMP2의 짝염기(conjugate bases)의 pK a는 각각 7.65 ± 0.04 및 7.75 ± 0.05을 나타내어 미토콘드리아의 pK a 값인 8.0에 근접하였다. 또한 pH 6.0-9.0 범위에서 pH에 따라 선형의 방출 비율을 나타냄으로써, 두 프로브 모두 상기 범위에서 pH 값을 결정하는데 적합함을 나타내었다.
실험예 4. 이광자 형광 프로브의 흡수 단면적, 광안정성 및 세포독성
이광자 흡수(TPA) 단멱적(δ) 값은 이광자(TP) 프로브의 중요한 측면이다. 큰 단면적(δ) 값을 갖는 분자는 실제 응용에서 가능성을 나타낸다. 따라서, CMP1 및 CMP2의 이광자 프로브로서의 가능성을 확인하기 위하여 상이한 pH 환경에서 CMP1 및 CMP2에 대한 이광자 특성을 평가하였다. 그 결과, CMP2에 대한 이광자 흡수(TPA) 단멱적(δ) 값은 pH 4.0, 7.0 및 9.0에서 각각 220 (910 nm), 92 (750 nm) 및 92 (750 nm)GM인 것으로 나타났다 (표 1 참조). 이러한 CMP2의 큰 δ 값은 개선된 ICT 프로세스를 보증할 수 있다. 또한, 장시간 영상화를 위해서는 광안정성이 이광자 프로브의 중요한 측면이다. 따라서, CMP1 및 CMP2의 장시간 광안정성을 HeLa 세포를 이용하여 수행하였다. 광안정성 평가 결과, CMP2는 CMP1에 비해 더 안정하고, 60분 후에 초기 강도의 약 50%를 보유하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터, CMP2가 CMP1에 비해 장기간 동안 살아있는 세포 및 조직에서 미토콘드리아 내 pH를 관찰하는데 더 중요한 도구가 될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, MTS 분석 및 CCK-8 분석 결과, CMP2는 낮은 세포독성을 갖는 것으로 나타났다.
실험예 5. 이광자 형광 프로브의 미토콘드리아 선택성
본 발명의 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아에 특이한 선택성을 나타내는지 확인하기 위해 CMP2 및 mCherrymito-7(미토콘드리아에 대한 공지된 적색 방출 단일광자(OP) 마커)를 이용하여 코-로컬리제이션(Co-localization) 실험을 실시하였다.
CMP2 및 mCherrymito-7로 공동-표지된 HeLa 세포의 (a) TPM, (b) OPM 및 (c) 상기 (a) 및 (b)를 중첩한 영상을 도 3에 나타내었다. 여기서, 이광자 및 단일광자 여기 파장은 각각 820 및 5524 nm이었고, 상응하는 방출 파장은 450-550 nm (CMP2) 및 650-700 nm (mCherrymito-7)에서 수집되었다.
도 3에 나타난 바와 같이, CMP2의 TPM 영상은 mCherrymito-7의 OP 영상과 잘 중첩되었고, 피어슨의 코-로컬리제이션 계수(Pearson’s colocalization coefficient) (A)는 0.95 ± 0.05인 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 CMP2가 미토콘드리아 내에 대부분 존재하는 것을 알 수 있고, 본 발명에 따른 이광자 프로브가 미토콘드리아를 정확하게 영상화하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6. 이광자 형광 프로브를 이용한 HeLa 세포 내 pH 분포 영상
살아있는 세포에서 본 발명의 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아 내 pH 분포를 관찰할 수 있는지를 평가하였다.
2μM CMP2로 배양된 이오노포어(ionophore) 처리된 HeLa 세포의 슈도 컬러(Pseudocolored) 가변색 이광자 영상(I red /I green )을 도 4(a)에 나타내고, HeLa 세포에서 pH에 따른 이광자 I red /I green 적정 곡선을 도 4(b)에 나타내고, 상기 (a)에서 백색 박스 위치를 확대한 고배율 영상을 도 4(c)에 나타내고, 상기 (a)에서 적색 박스 위치를 확대한 고배율 영상을 도 4(d)에 나타내었다. 여기 파장은 820 nm이고, 스케일 바는 (a)는 13 ㎛이고, (c) 및 (d)는 4 ㎛이다.
도 4(a)에 나타난 바와 같이, pH 조정 곡선이 이오노포어 처리되고, CMP2로 표지된 HeLa 세포의 가변색 이광자 영상(I red /I green )에 의해 생성되고, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, pK a 값은 7.86 ± 0.05인 것으로 나타났다. 또한, pH에 따른 (I red /I green ) 플럿은 pH 6.5-8.5 범위에서 선형을 나타내어 상기 범위에서 CMP2가 pH 값을 측정하는데 가능함을 나타내었다. 또한, 도 4(c) 및 4(d)에 나타난 바와 같이, 고배율 영상으로부터 미토콘드리아 내 pH에서의 작은 변동(0.1 단위)도 관찰할 수 있음을 나타내었다.
다음으로는, CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)로 선처리된 CMP2 염색된 HeLa 세포의 미토콘드리아 내 pH 변화를 관찰하였다.
20 μM CCCP로 각각 선처리되기 전, 1시간 동안 선처리, 및 6시간 동안 선처리된 2μM CMP2로 염색된 HeLa 세포의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )을 각각 도 5의 (a), (b), 및 (e)에 나타내고, 상기 (b)에서 박스 위치의 고배율 영상을 도 5(c)에 나타내고, 상기 (e)에서 박스 위치의 고배율 영상을 도 5(f)에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 1시간 및 6시간 동안 20 μM CCCP로 선처리된 CMP2로 염색된 HeLa 세포는 대조군의 pH 7.82 ± 0.08에 비해, 1시간 후 7.09 ± 0.16 및 6시간 후 6.75 ± 0.27까지 미토콘드리아 내 pH(pHmito) 값의 감소에 따라 불균일한 pH 값을 나타내었다. 또한, TPM 영상은 1시간 선처리 된 경우는 핵 근처의 미토콘드리아가 주변위치의 미토콘드리아에 비해 산성 pH를 보유하나, 6시간 선처리된 경우는 핵 근처로부터 주변 위치까지 연속적인 흐름을 나타내었다. 또한, 고배율 영상으로부터 pH 6.9 ± 0.3의 평균 값을 가지고, pH 7.40 내지 6.36 범위에서 각 위치의 개별적 pH 값이 명확하게 영상화되는 것을 알 수 있다.
다음으로는, 영양분이 부족한 상태에서 CMP2 염색된 HeLa 세포의 미토콘드리아 내 pH 변화를 관찰하였다.
2μM CMP2로 염색하기에 앞서 0~6시간 동안 아미노산/혈청-부족 완충용액에서 굶주린 HeLa 세포의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )을 도 6에 나타내었다. 여기서 (a) 대조군, (b) 2시간, (c) 4시간, (d) 6시간이고, (f, g, h)는 각각 (b, c, d)의 박스 위치의 고배율 영상을 나타내고, 화살표는 관심있는 위치의 pH 값을 나타낸다. (d)는 TPM 영상에서 I red /I green 비율로부터 평가된 pH 값의 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
도 6(f, g, h)에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 내 pH 값은 각각 개별적인 위치에서 pH 7.19~6.27 범위로 나타났다. 또한 대사 억제는(metabolic inhibition)는 대조군에 비해 상기 2시간, 4시간 및 6시간의 경우, 각각 0.64 ± 0.1, 1.00 ± 0.2 및 1.21 ± 0.2 pH의 감소를 나타내었다. 또한 시간 대사 억제에 따라 미토콘드리아 내 산성화가 증가하였다. 이러한 결과는 CMP2가 미토파지(mitophagy) 과정 동안 미토콘드리아 내 pH 변화를 관찰할 수 있음을 나타낸다.
실험예 7. 이광자 형광 프로브를 이용한 쥐의 해마절편 내 pH 분포 영상
쥐 해마절편에서 이광자 형광 프로브(SHS-M2)의 유용성을 시험하였다. 쥐의 뇌 조직의 구조는 모든 깊이에서 불균질하므로, 약 90-210㎛ 깊이의 두께에서 360개의 TPM 영상을 얻었고, 이를 결합하여 전체적인 pH 분포를 영상화하였다.
20μM CMP2로 염색한 쥐의 해마절편의 슈도 컬러 가변색 이광자 영상(I red /I green )을 도 7의 (a)에 나타내었고, CA1, CA3, 및 DG에 있는 박스 위치를 40 배 확대한 영상을 각각 도 7의 (b), (c) 및 (d)에 나타내었다.
도 7(a)에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아는 DG 영역(치상회(dentate gyrus))보다는 CA1 및 CA3 영역에 분포되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 도 (b) 내지 (d)에 나타난 바와 같이, CA1 및 CA3 영역에서의 고배율 영상은 미토콘드리아 내 pH 값이 알칼리성 영역에 있다는 것을 명확하게 나타내었다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 가변색 이광자 형광 프로브를 포함하는 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물

    [화학식 2]
    Figure 112017073812889-pat00011
    .
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 미토콘드리아를 선택적으로 염색하는 것을 특징으로 하는, 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 탈수소 반응을 하여 450~650 nm 범위의 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는, 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 생체 세포 또는 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체조직에서 미토콘드리아 내 수소이온 농도(pH)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 수소이온 농도(pH)는 6.0~9.0 범위인 것을 특징으로 하는, 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물.
  6. 삭제
  7. (1') 나프탈렌-2,7-디올 및 클로로메틸 메틸 에테르를 반응시켜 화학식 E의 화합물을 제조하는 단계;
    (2') 상기 화학식 E의 화합물과 아이오도메탄을 반응시켜 화학식 F의 화합물을 제조하는 단계;
    (3') 상기 화학식 F의 화합물과 디메틸포름아미드(DMF)를 반응시켜 화학식 G의 화합물을 제조하는 단계;
    (4') 상기 화학식 G의 화합물과 산(acid)을 반응시켜 화학식 H의 화합물을 제조하는 단계;
    (5') 상기 화학식 H의 화합물과 디메틸 말론산을 반응시켜 화학식 I의 화합물을 제조하는 단계;
    (6') 상기 화학식 I의 화합물과 물을 반응시켜 화학식 J의 화합물을 제조하는 단계; 및
    (7') 상기 화학식 J의 화합물과 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄염을 반응시켜 화학식 2의 가변색 이광자 형광 프로브를 제조하는 단계; 를 포함하며, 하기 반응식 2로 표시되는 미토콘드리아 내 pH 변화 검출용 조성물 제조 방법:

    [반응식 2]
    Figure 112017017344078-pat00013
    .
  8. (a) 화학식 2로 표시되는 화합물인 가변색 이광자 형광 프로브를 생체 내에 주입하는 단계;
    (b) 상기 가변색 이광자 형광 프로브가 탈수소 반응을 하여 형광을 나타내는 단계; 및
    (c) 상기 형광을 가변색 이광자 현미경으로 관측하는 단계;를 포함하는, 가변색 이광자 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아 내 pH 변화의 영상화 방법
    [화학식 2]
    Figure 112017073812889-pat00015
    .
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