KR100870243B1 - 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및이를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 화학식 1의 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법에 관한 것이다:
<화학식 1>
상기 식에서,
X는 -OCH3, -OH 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
본 발명에 따른 이광자 염료는 높은 δTPA를 갖기 때문에 분자내 전하 수송이 용이하며, 광안정성이 우수하고, 수용성이 뛰어나며, 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수하다는 효과를 갖는다.
이광자 염료
Description
도 1a 내지 1f는 각각 본 발명에 따른 제조예 1의 화합물, 제조예 3의 화합물 (각각 pH가 1.0, 11.0 및 7.0인 수용액 중에서 측정), 제조예 4의 화합물 및 제조예 5의 화합물에 대한 농도에 따른 형광 강도를 도시한 그래프이다.
도 2a 내지 2b는 본 발명에 따른 제조예 1, 3, 4 및 5에 따른 화합물들에 대한 흡수 및 형광 스펙트럼을 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 제조예 1, 3, 4 및 5의 화합물에 대한 이광자 여기 스펙트럼을 도시한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 제조예 4의 화합물의 수용액에 대한 몰 흡수 스펙트럼 및 이광자 여기 스펙트럼 (도 4a)과, 제조예 4에 따른 화합물의 수용액에 대한 일광자 여기 형광 스펙트럼 및 이광자 여기 형광 스펙트럼 (도 4b)을 도시한 그래프이다.
도 5a는 제조예 4에 따른 화합물이 표지된 거대 단일층상 소포에 대한 이광자 형광 영상을 도시한 것이고, 도 5b 및 5c는 각각 1,4-비스[(E)-4-(디헥실아미노)스티릴]벤조니트릴 및 2,5-비스[6-(디헥실아미노)-1-H-인돌-2-일]벤조니트릴이 표지된 거대 단일층상 소포에 대한 이광자 형광 영상을 도시한 것이다.
도 6은 제조예 4의 화합물, 참고 화합물 1 및 참고 화합물 2에 대한 반감기 (t1/2)를 도시한 그래프이다.
도 7은 제조예 4에 따른 화합물이 표지된 A431 세포들에 대한 TPEF 영상 (λ=880 nm, 도면 하단의 축척은 30 ㎛)을 도시한 도면이다.
도 8a 및 8b는 제조예 6에 따른 화합물이 접합된 p43의 존재를 확인하기 위해서 SDS-PAGE에 의해서 분리된 분획을 자외선 (302 nm) 하에서 (도 8a), 그리고 Coomassie Blue R-250으로 염색함으로써 (도 8b) 가시화한 도면이다.
도 9는 제조예 6에 따른 화합물이 접합된 p43이 세포 내로 함입되어 축적된 상태 (37℃에서 배양)에서의 이광자 형광 영상 (λ=840 nm, 도면 하단의 축척은 30 ㎛)을 도시한 도면이다.
도 10은 DMSO 및 제조예 4에 따른 화합물을 서로 다른 농도에서 3시간 동안 세포들과 함께 배양한 경우 세포 생존율에 대한 그래프이다.
본 발명은 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 높은 δTPA를 갖기 때문에 분자내 전하 수송이 용이하며, 광안정성이 우수하고, 수용성이 뛰어나며, 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수한 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법에 관한 것이다.
여기를 위해서 2개의 NIR 광자들을 채용하는 이광자 현미경 (two-photon microscopy, TPM)은 생체 영상화에 있어서 많은 관심을 끌고 있다 (Denk, W.; Strickler, J. H.; Webb, W. W. Science, 1990, 248, 73.; Zipfel, W. R.; Williams, R. M.; Webb, W. W. Nat . Biotechnol . 2003, 21, 1369.). TPM은 감소된 광손상 (photodamage) 및 광표백 (photobleaching) 특성을 갖는다는 점 이외에도, 공간적으로 매우 영역화된 여기 현상으로 인한 개선된 3차원 해상도, 증가된 투과 깊이 (~1000㎛), 및 낮은 조직 자가-형광 (auto-fluorescence) 등과 같은 장점들을 갖는다 (So, P. T. C.; Dong, C. Y.; Masters, B. R.; Berland, K. M. Annu . Rev . Biomed. Eng . 2000, 2, 399.).
이러한 적용에 적합한 유용한 TP 탐침들은 현저한 TP 단면 (δTPA), 높은 수용성 (> 1μM), 세포 투과성, 높은 광안정성, 및 낮은 독성을 보유하여야 하며, 금속 이온들에 대한 수용체가 되거나 생분자에 접합될 수 있는 능력을 보유하여야 한다. 최근에, 큰 δTPA, 우수한 수용성, 및 향상된 광안정성을 보유한 TP 형광단 (fluorophore)을, 분자 구조를 최적화함으로써 합성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다.
구체적으로, δTPA는 분자내 전하 수송 (intramolecular charge transfer, ICT)을 용이하게 하기 위한 평면 구조를 유지하면서 강한 주게-받게 기들을 사용함으로써 증가될 수 있고 (Chung, S.-J.; Kim, K.-S.; Lin, T.-C.; He, G. S.; Swiatkiewicz, J.; Prasad, P. N. J. Phys . Chem . B . 1999, 103, 10741. 외 다수), 수용성은 암모늄 이온 및 올리고 (에틸렌 글리콜) 모노메틸 에테르와 같은 용해성 기들을 부착시킴으로써 증가될 수 있고 (Woo, H. Y.; Hong, J. W.; Mikhailovsky, B. Liu, A.; Korystov, D.; Bazan, G. C. J. Am . Chem . Soc . 2005, 127, 820. 외 다수), 헤테로시클릭 고리 내에 공액 가교를 포함시킴으로써 증가될 수 있다 (Kim, H. M.; Yang, W. J.; Kim, C. H.; Park, W.-H.; Jeon, S.-J.; Cho, B. R. Chem . Eur. J. 2005, 11, 6386.). 또한, 최근에 금속 이온, pH, 및 불소 이온에 대해서 민감한 TP 탐침들이 보고된 바도 있다 (Kim, H. M.; Jeong, M.-Y.; Ahn, H. C.; Jeon, S.-J.; Cho, B. R. J. Org . Chem . 2004, 69, 5749.).
그러나, 이들 모두는 유기 용매 또는 모델 세포막에서 연구된 것들이며, 세포 또는 조직 내에서 연구된 것이 아니다. 또한, 매우 최근에는 생체 내 영상화를 위한 수용성 덴드리머성 TP 추적자 (MW = ~30 kDa)가 개발된 바도 있지만 (Krishna, T. R.; Parent, M.; Werts, M. H. V.; Moreaux, L.; Gmouh, S.; Charpak, S.; Caminade, A.-M.; Majoral, J.-P.; Blanchard-Desce, M. Angew . Chem . Int . Ed . 2006, 45, 4645.), 생체 실시간 영상화를 위한 효과적인 분자 TP 탐침들에 대한 필요성은 절실한 상황이다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는 고리형 평면 구조 내에 강한 주게-받게 쌍들을 보유함으로써 높은 δTPA를 갖기 때문에 분자내 전하 수송이 용이하며, 고리 내에 공액 이중 결합을 갖기 때문에 광안정성이 우수하고, 수용체로서 일체형 에스테르기(들)을 갖기 때문에 수용성이 뛰어나며, 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수한 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 두 번째 기술적 과제는 상기 이광자 염료의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 세 번째 기술적 과제는 상기 이광자 염료를 이용한 세포의 실시간 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여, 화학식 1의 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료를 제공한다:
상기 식에서,
X는 -OCH3, -OH 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 이광자 여기 스펙트럼 (nm)의 최대 파장 범위가 780nm 내지 940nm일 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여,
화학식 4의 화합물로부터 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법을 제공한다:
상기 식에서,
X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
상기 식에서,
X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 2 및 화학식 4에서 X가 -N(CH3)2인 경우, 상기 화학식 4의 화합물은 하기 화학식 5의 화합물과 디클로로디시아노퀴논을 반응시켜서 제조될 수 있다:
또한, 본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여,
화학식 6의 화합물로부터 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법을 제공한다:
상기 식에서,
X는 -OH이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 6의 화합물은 하기 화학식 7의 화합물로부터 제조될 수 있다:
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 7의 화합물은 하기 화학식 8의 화합물로부터 제조될 수 있다:
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 8의 화합물은 하기 화학식 9의 화합물로부터 제조될 수 있다:
상기 식에서,
X는 -OH이다.
본 발명은 상기 세 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여,
상기 이광자 염료를 관찰 대상이 되는 세포질 내로 주입한 후 방출되는 이광자 여기 형광 영상을 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링 방법을 제공한다.
이하, 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료는 높은 δTPA를 갖기 때문에 분자내 전하 수송이 용이하며, 광안정성이 우수하고, 수용성이 뛰어나며, 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수하다.
본 발명은 화학식 1의 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료를 제공하며:
<화학식 1>
상기 식에서,
X는 -OCH3, -OH 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
우수한 물성을 갖는 세포 모니터링용 이광자 염료는, 높은 δTPA, 우수한 광안정성, 높은 수용성, 및 양호한 세포 투과성 등의 조건을 만족하여야 한다. 본 발명에서는 작은 분자량을 갖는 분자가 상기 서술한 우수한 물성들을 고르게 보유할 수 있도록 최적화 과정에 따른 이광자 염료를 제조하고자 하였다. 한편, 상술한 최적화 과정이 δTPA를 다소 감소시킬 수도 있지만, 플루오레세인 (fluorescein) 유도체들 (δTPA < 40GM) (Euler, T.; Detwiller, P. B.; Denk, W. Nature 2002, 418, 845.)에 기초한 일광자 형광 탐침들을 사용하는 생체 영상화에 TPM이 성공적으로 적용된 바 있기 때문에, 이러한 δTPA의 감소가 심각한 문제를 야기하지는 않는다.
따라서, 본 발명에서는 세포 모니터링용 이광자 염료로서 상기 화학식 1로 표시되는 2H-벤조[h]크로멘-2-온 유도체를 제공하며, 상기 유도체는 ⅰ) 고리형 평면 구조 내에 강한 주게-받게 쌍들을 보유함으로써 분자내 전하 수송 (intramolecular charge transfer, ICT)이 용이하고, 결과적으로 높은 δTPA 수치를 가지며, ⅱ) 고리 내에 공액 이중 결합을 갖기 때문에 광안정성이 우수하고, ⅲ) 수용체로서 일체형 에스테르기(들)을 갖기 때문에 수용성이 뛰어나며, ⅳ) 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수하다는 특성을 보유한다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 이광자 여기 스펙트럼 (nm)의 최대 파장 범위가 780nm 내지 940nm인데, 대부분의 TPM이 700nm 내지 1000nm의 여기 파장을 사용한다는 점을 고려하면 본 발명에 따른 이광자 염료가 TPM용 염료로 매우 적합한 것임을 알 수 있다.
본 발명에 따른 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법에 대해서 설명하면 하기와 같다.
본 발명은 화학식 4의 화합물로부터 화학식 2의 화합물 (화학식 1의 화합물 중 X가 -OCH3 또는 -N(CH3)2인 경우)을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법을 제공한다:
<화학식 2>
상기 식에서,
X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
<화학식 4>
상기 식에서,
X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이다.
예를 들어, 화학식 4의 화합물 중 X가 -OCH3인 경우에, 화학식 4의 화합물, 즉 1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드는 참고 문헌 (Christine, B.; Pierre, D.; Rene, R. Eur . J. Med . Chem . 1987, 22, 363.; Hamilton, R. W. J. Heterocycl. Chem . 1976, 13, 545)에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다.
상기 1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드와, 디메틸말로네이트 및 촉매량의 피페리디늄 아세테이트를 톨루엔 용매 중에서 반응시킴으로써 X가 -OCH3이고, Y가 -COOCH3인 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있게 된다.
마찬가지로, X가 -OCH3이고 Y가 -CN인 화학식 2의 화합물은 1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드와 메틸 시아노아세테이트 및 촉매량의 피페리디늄 아세테이트를 톨루엔 용매 중에서 반응시킴으로써 제조할 수 있게 된다.
또한, X가 -OCH3이고 Y가 -COOC4H4NO2인 화학식 2의 화합물은 1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드를 에탄올 중에서 KOH와 반응시킨 다음 산 용액을 첨가하여 얻어진 침전물에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드·HCl을 첨가하고 교반한 다음, 다시 N-히드록시숙신이미드 및 4-디메틸아미노피리딘을 첨가함으로써 제조할 수 있다.
한편, 화학식 4의 화합물 중 X가 -N(CH3)2인 경우에, 화학식 4의 화합물, 즉 6-디메틸아미노-1-히드록시나프탈렌-2-카르브알데히드는 참고 문헌 (Christine, B.; Pierre, D.; Rene, R. Eur . J. Med . Chem . 1987, 22, 363.; Hamilton, R. W. J. Heterocycl . Chem . 1976, 13, 545)에 기재된 바에 따라 제조된 6-디메틸아미노-1-히드록시-3,4-디히드로나프탈렌-2-카르브알데히드, 즉 하기 화학 식 5의 화합물과 디클로로디시아노퀴논 (DDQ)을 반응시켜서 제조될 수 있고:
<화학식 5>
제조된 화학식 5의 화합물을 X가 -OCH3인 경우에 대해서 서술한 바와 동일한 요령으로 반응시킴으로써 각각 X가 -N(CH3)2이고, Y가 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2인 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있게 된다.
한편, X가 -OH인 경우의 화학식 1의 화합물, 즉 하기 화학식 3의 화합물은 X가 -OCH3 또는 -N(CH3)2인 경우와는 다소 다르게 제조될 수 있으며, 따라서 본 발명은 하기 화학식 6의 화합물로부터 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법을 제공한다:
<화학식 3>
상기 식에서,
X는 -OH이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
<화학식 6>
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기 (TBDMSO)이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
상기 화학식 6의 화합물로부터 상기 화학식 3의 화합물의 제조는 상기 화학식 6의 화합물과 테트라부틸암모늄플루오라이드 (TBAF)를 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
또한, 상기 화학식 6의 화합물은 하기 화학식 7의 화합물로부터 제조될 수 있으며:
<화학식 7>
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다.
이는 상기 화학식 7의 화합물을, X가 -OCH3 또는 -N(CH3)2인 경우에 대해서 서술한 바와 동일한 요령으로 반응시킴으로써, 각각 Y가 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2인 화학식 6의 화합물을 제조할 수 있게 된다.
더 나아가, 상기 화학식 7의 화합물은 하기 화학식 8의 화합물로부터 제조될 수 있다:
<화학식 8>
상기 식에서,
X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다.
상기 화학식 8의 화합물로부터 상기 화학식 7의 화합물을 제조하는 과정은, 상기 화학식 8의 화합물에 리튬디이소프로필아미드를 첨가하고, 일정 시간 경과 후 에틸 포름산을 다시 첨가한 다음, 디클로로디시아노퀴논 및 1,4-디옥산을 첨가함으로써 제조될 수 있다.
한편, 상기 화학식 8의 화합물은 하기 화학식 9의 화합물로부터 제조될 수 있는데:
<화학식 9>
상기 식에서,
X는 -OH이다.
이는, 참고 문헌 (Christine, B.; Pierre, D.; Rene, R. Eur . J. Med . Chem . 1987, 22, 363.; Hamilton, R. W. J. Heterocycl . Chem . 1976, 13, 545)에 기재된 바에 따라서 제조된 화학식 9의 화합물에, t-부틸디메틸실라닐옥시클로라이드 (TBDMSCl) 및 이미다졸을 첨가함으로써 제조될 수 있다.
참고로, 하기 반응식 1에는 화학식 9의 화합물로부터 화학식 1의 화합물을 제조하거나, 화학식 5의 화합물로부터 화학식 1의 화합물을 제조하거나, 또는 화학 식 4의 화합물로부터 화학식 1의 화합물을 제조하는 과정에 대한 예시적인 개략 반응도를 나타내었다.
한편, 본 발명은 또한 상기 이광자 염료를 관찰 대상이 되는 세포질 내로 주입한 후 방출되는 이광자 여기 형광 영상을 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포의 실시간 모니터링 방법은, 높은 δTPA, 우수한 광안정성, 높은 수용성 및 작은 분자량을 갖는 이광자 염료를 사용하기 때문에, 세포 영상을 우수한 해상도로 안정적으로 관찰할 수 있고, 세포 심층 부위까지도 용이하게 관찰할 수 있게 된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 서술된 것이다.
제조예 1. 본 발명에 따른 이광자 염료의 제조
6-히드록시-3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온 (화학식 9), 1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드 (화학식 4의 화합물 중 X는 -OCH3인 경우), 6-디메틸아미노-1-히드록시-3,4-디히드로나프탈렌-2-카르브알데히드 (화학식 5)는 참고 문헌 (Christine, B.; Pierre, D.; Rene, R. Eur . J. Med . Chem . 1987, 22, 363.; Hamilton, R. W. J. Heterocycl . Chem . 1976, 13, 545)에 기재된 바에 따라서 제조하였다.
하기 제조예에 따라서 본 발명에 따른 이광자 염료인 하기 화학식 1의 화합물을 제조하였다.
<화학식 1>
상기 식에서,
X는 -OCH3, -OH 또는 -N(CH3)2이고,
Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다.
제조예 1. 8-메톡시-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르복실산 메틸 에스테르 (화학식 1의 화합물 중, X는 -OCH3이고, Y는 -COOCH3인 화합물)의 제조
1-히드록시-6-메톡시-2-나프트알데히드 (화학식 4의 화합물 중 X는 -OCH3인 경우) 0.50 g, 2.5 mmol, 디메틸말로네이트 0.33 g, 2.5 mmol 및 촉매량의 피페리디늄 아세테이트를 톨루엔 10 mL 중에 넣고, 딘-스타크 트랩 (Dean-Stark trap) 중에서 24시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 용매를 증발시켰다. 산물을 헥산/에틸 아세테이트 (6:1) 혼합액을 용리액으로 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다.
수율: 0.48 g (68 %); mp: 214-215 ℃; IR (KBr, cm-1): 1759 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.67 (s, 1H), 8.48 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 9.3 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.97 (s, 6H); 13C-NMR (75 Hz, CDCl3) δ 164.4, 161.4, 157.3, 154.3, 150.5, 138.6, 125.3, 125.2, 124.1, 120.0, 117.6, 115.1, 112.1, 107.0, 55.8, 53.0; Anal. Calcd for C16H12O5: C, 67.60; H, 4.25. Found; C, 67.50; H, 4.12.
제조예 2. 6-(t-부틸디메틸실라닐옥시)-1-히드록시나프탈렌-2-카르브알데히드 (화학식 7의 화합물)의 제조
화학식 9의 화합물 2.0 g, 12 mmol, TBDMSCl 2.2 g, 15 mmol 및 이미다졸 1.0 g, 15 mmol을 CH2Cl2 50 mL 중에 넣고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 CH2Cl2로 추출하고, 증발시켰다. 조생성물을 아르곤 하에서 건조 THF 70 mL 중에 용해시키고, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 상기 용액에, LDA 8.0 mL, 12 mmol (시클로헥산 중의 1.5 M)을 적가하였다. 1시간 경과 후에, 에틸 포름산 1.9 ml, 24 mmol을 10분에 걸쳐서 적가하였다. 상기 혼합물을 -78℃에서 10분 동안 교반한 다음, 24시간 동안 실온에서 방치하였다. 결과 혼합물에, 에탄올 (7.0 mL)을 첨가하고, 8.0mL 1,4-디옥산 중에 DDQ 2.7 g, 12 mmol을 적가한 다음, 실온의 아르곤 하에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 산물을 헥산/에틸 아세테이트 (10:1) 혼합액을 용리액으로 사용하여 실리카 컬럼 상에서 정제하였다.
수율: 1.7 g (46 %); IR (KBr, cm-1): 3418 (OH), 1624 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.73 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.33 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.6 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 1.02 (s, 9H), 0.28 (s, 6H); 13C-NMR (75 Hz, CDCl3) δ 195.9, 162.4, 158.3, 139.9, 127.4, 126.6, 122.0, 119.7, 118.6, 115.4, 113.5, 25.9, 18.5, -4.0; Anal. Calcd for C17H22O3Si: C, 67.51; H, 7.33. Found; C, 67.20; H, 7.54.
제조예 3. 8-히드록시-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르복실산 메틸 에스테르 (화학식 1의 화합물 중, X는 -OH이고, Y는 -COOCH3인 화합물)의 제조
화학식 7의 화합물로부터 제조예 1.1에 기재된 바와 동일한 요령으로 화학식 6의 화합물 중 X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이고, Y는 -COOCH3인 화합물을 제조하였다. 상기 제조된 화합물의 THF 용액 15mL (1.0 g, 2.6 mmol) 및 테트라부틸암모늄플루오라이드 (TBAF) (THF 중의 1.0 M, 3.2 ml, 3.1 mmol)를 실온의 아르곤 하에서 10분 동안 교반하였다. 산물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하였다. 용매를 증발시키고 산물을 헥산/에틸 아세테이트 (4:1) 혼합액을 용리액으로 사용하는 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해서 분리하였다.
수율: 0.63 g (55 %); mp: 283-284 ℃; IR (KBr, cm-1): 3421 (OH), 1718 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.85 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.2 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H); 13C-NMR (75 Hz, DMSO-d 6) δ 163.4, 159.3, 156.2, 153.4, 150.4, 138.3, 125.4, 124.4, 123.1, 119.7, 115.5, 113.9, 111.3, 110.0, 52.3; Anal. Calcd for C15H10O5: C, 66.67; H, 3.73. Found; C, 66.55; H, 3.86.
제조예 4. 6-디메틸아미노-1-히드록시나프탈렌-2-카르브알데히드 (화학식 4의 화합물 중 X는 -N(CH3)2인 화합물)의 제조
THF 10.0 mL 중의 DDQ 2.9 g, 13 mmol의 용액을, THF 30 mL 중의 6-디메틸아미노-1-히드록시-3,4-디히드로나프탈렌-2-카르브알데히드 (화학식 5) 2.8 g, 13 mmol 용액에 적가하고, 아르곤 하의 실온에서 5분 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 산물을 CH2Cl2을 용리액으로 사용하는 실리카 컬럼 상에서 정제하였다.
수율: 1.6 g (57 %); IR (KBr, cm-1): 3402 (OH), 1604 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.85 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 8.27 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 9.0 Hz, J = 2.6 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 3.13 (s, 6H).
제조된 화합물은 냉장고 중에서 방치되는 경우에 서서히 분해되기 때문에 더 이상의 정제 없이 합성 이후에 바로 사용되었다.
제조예 5. 8-디메틸아미노-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르복실산 메틸 에스테르 (화학식 1의 화합물 중 X는 -N(CH3)2이고, Y는 -COOCH3인 화합물)의 제조
6-디메틸아미노-1-히드록시나프탈렌-2-카르브알데히드 (제조예 4의 화합물)를 사용하여, 제조예 1에 기재된 바와 동일한 요령으로 제조하였다.
수율: 64 %; mp 199-200 ℃; IR (KBr, cm-1): 1701 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.64 (s, 1H), 8.44 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 9.5 Hz, J = 2.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.17 (s, 6H); 13C-NMR (75 Hz, CDCl3) δ 164.8, 159.9, 157.9, 151.5, 150.7, 138.9, 125.0, 124.9, 123.6, 115.9, 114.1, 112.6, 110.8, 105.7, 52.8, 40.5; Anal. Calcd for C17H15NO4: C, 68.68; H, 5.09; N, 4.71. Found; C, 68.65; H, 4.99; N, 4.61.
제조예 6. 8-디메틸아미노-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르보니트릴 (화학식 1의 화합물 중 X는 -N(CH3)2이고, Y는 -CN인 화합물)의 제조
6-디메틸아미노-1-히드록시나프탈렌-2-카르브알데히드 (제조예 4의 화합물) 및 메틸 시아노아세테이트를 사용하여, 제조예 1에 기재된 바와 동일한 요령으로 제조하였다.
수율: 52 %; mp: 274-276 ℃; IR (KBr, cm-1): 2223 (CN), 1724 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.37 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 9.6 Hz, J = 2.1 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.18 (s, 6H); 13C-NMR (75 Hz, CDCl3) δ 157.8, 153.5, 153.5, 151.4, 138.7, 124.6, 123.7, 123.5, 116.4, 115.6, 112.7, 110.2, 105.4, 96.0, 40.5; Anal. Calcd for C16H12N2O2: C, 72.72; H, 4.58; N, 10.60. Found; C, 72.79; H, 4.45; N, 10.58.
제조예 7. 8-디메틸아미노-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르복실 숙신이미도 일 에스테르 (화학식 1의 화합물 중 X는 -N(CH3)2이고, Y는 -COOC4H4NO2인 화합물)의 제조
에탄올 50 mL 중의 8-디메틸아미노-2-옥소-2H-벤조[h]크로멘-3-카르복실산 메틸 에스테르 (제조예 5의 화합물) 0.5 g, 1.7 mmol 및 KOH 0.2 g, 3.5 mmol의 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 결과물인 용액을 얼음물 50 mL로 희석시키고, pH가 3이 될 때까지 < 5℃에서 서서히 농축 HCl (수용액)을 첨가하였다. 침전을 수집하고, 증류수로 세척한다음, 진공 하에서 건조하였다. DMF 중에서 상기 중간체 0.3 g, 1.1 mmol 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드·HCl 0.2 g, 1.7 mmol의 혼합물을 20분 동안 교반한 이후에, N-히드록시숙신이미드 0.2 g, 1.2 mmol 및 4-디메틸아미노피리딘 13 mg, 0.11 mmol을 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에서 24시간 동안 교반한 후에, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 용매를 진공 중에서 제거하였다. 산물을 헥산/에틸 아세테이트 (2:1)를 용리액으로 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다.
수율: 48 %; mp 231-234 ℃; IR (KBr, cm-1): 1795, 1705 (C=O); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.89 (s, 1H), 8.40 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 9.3 Hz, J = 2.0 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 3.16 (s, 6H), 2.98 (s, 4H); 13C-NMR (75 Hz, CDCl3) δ 169.2, 165.3, 159.6, 157.9, 152.3, 150.6, 137.9, 126.2, 122.9, 123.1, 116.9, 114.7, 112.3, 111.2, 105.4, 40.5, 25.2; Anal. Calcd for C20H16N2O6: C, 63.16; H, 4.24; N, 7.37. Found; C, 63.20; H, 4.21; N, 7.40.
실시예 1. 용해도 측정
제조예 1, 3, 4 및 5에 따라서 제조된 본 발명에 따른 이광자 염료 소량을 DMSO에 용해시켜서 스톡 용액들 (1.5 × 10-2 M)을 제조하였다. 상기 용액을 6.0 × 10-3 ~ 6.0 × 10-5 M로 희석시키고, 마이크로 주사기를 사용하여 3.0 mL의 물을 포함하는 큐벳에 첨가하였다. 모든 경우에서, H2O 중의 DMSO의 농도는 0.2%로 유지되었다. 염료 농도에 대한 형광 강도의 곡선은 저농도에서는 선형이었으며, 고농도에서는 하향 곡선을 나타내었다. 선형 영역 중에서 최대 농도를 용해도로 간주하였으며, 도 1a 내지 1f에는 수용액 중의 제조예 1의 화합물, 제조예 3의 화합물 (각각 pH가 1.0, 11.0 및 7.0인 수용액 중에서 측정), 제조예 4의 화합물 및 제조예 5의 화합물에 대한 농도에 따른 형광 강도를 그래프로 도시하였다.
또한, 하기 표 1에는 각각의 화합물들에 대한 광물리학적 데이터들을 열거하였다.
| 화합물1 ) |  |
 |
△υ2) | Φ3) |
 |
δmax e |
| 제조예 1 | 391(1.99) | 481 | 4785 | 0.82 | 780 | 140 |
| 제조예 36) | 397(1.37) | 482,551 | 4442, 7040 | 0.48 | 780 | 270 |
| 제조예 4 | 453(1.54) | 570 | 4531 | 0.19 | 880 | 350 |
| 제조예 5 | 457(2.28) | 590 | 4933 | 0.050 | 940 | 470 |
도 1a 내지 1f 및 표 1의 결과로부터, 본 발명에 따른 이광자 염료들은 세포들을 염색할 수 있을 정도로 충분히 높은 수용성 (>1.0 × 10-6 M)을 나타낸다는 사실을 알 수 있다. 용해도는 수소 결합 자리의 수가 증가할수록 증가하였지만 (제조예 1 ≒ 제조예 3 > 제조예 4 및 5), 수용체가 -COOCH3로부터 (제조예 4) -CN (제조예 5)으로 변화하는 경우에는 상대적으로 변화가 없었다.
한편, λmax는 공여체에 따라서 -OCH3 < -OH < -N(CH3)2의 순으로 증가하였고, 수용체에 따라서 -COOCH3 < -CN의 순으로 증가하였다.
실시예 2. 스펙트럼 측정
모든 스펙트럼 측정은 톨루엔 용액 (스펙트럼급, Aldrich사) 및 증류수 중에서 수행되었다. 흡수 스펙트럼은 Hewlett-Packard 8453 다이오드 정렬 스펙트로미터 상에서 기록되었으며, 형광 스펙트럼은 Amico Bowman 시리즈 2 발광 스펙트로미터로 얻어졌다. 제조예 1, 3, 4 및 5에 따른 화합물들에 대한 흡수 및 형광 스펙트럼을 각각 도 2a 및 2b에 도시하였다. 형광 양자 수율은 플루오레세인, 쿠마린 307 또는 로다민 B를 참고 수치로 하여 결정하였다 (Demas, J.N.; Crosby, G.A. J. Phys. Chem . 1971, 75, 991-1024.).
형광 스펙트럼은 수용체-공여체 (주게-받게) 강도가 증가함에 따라서 단조로운 장파장 이동을 나타내며, 그 순서는 제조예 1 < 제조예 3 < 제조예 4 < 제조예 5이다 (도 2b 참조). 스토크스 이동 (Stokes shift)은 컸으며, 4442 내지 7040 cm-1의 범위였다 (표 1 참조). 공여체/수용체 강도가 증가함에 따라서, 여기 전자 상태의 전하 수송 특성이 증가하였으며, 이는 용매화 에너지가 크고 형광 스토크스 이동도 증가함을 의미한다. 흥미롭게도, 제조예 3에 따른 화합물은 2개의 피크들을 나타내며, 이는 pH 1.0 및 pH 11.0에서의 그것들과 유사하다. 더욱이, 제조예 3에 따른 화합물에 대한 pKa 수치는 대략 7.3으로서, 이는 상당량의 화합물이 중성 조건 하에서 탈수소화됨을 의미한다. 따라서, 제조예 3에 따른 화합물에 대한 비정상적으로 큰 스토크스 이동 (7040cm-1)은 O-가 OH보다 훨씬 더 강한 공여능을 보유하기 때문에 여기 상태에서 향상된 ICT를 갖는다는 점에 기인할 수 있다 (O-에 대해서 σ+=-2.3 vs OH에 대해서 σ+=-0.91).
실시예 3. 이광자 단면 (two-photon cross section)
제조예 1, 3, 4 및 5에 따른 화합물들에 대한 이광자 흡수 단면을, 하기 수학식 1을 사용한 이광자 유도 형광법을 사용하여 측정하였다.
상기 식에서,
첨자 s 및 r은 샘플 (s) 및 참고 분자들 (r) (Rumi, M.; Ehrlich, J. E.; Heikal, A. A.; Perry, J. W.; Barlow, S.; Hu, Z.; McCord-Maughon, D.; Parker, T. C.; Rockel, H.; Thayumanavan, S.; Marder, S. R.; Beljonne, D.; Bredas, J.-L. J. Am . Chem . Soc . 2000, 122, 9500.; Lee, W.-H.; Lee, H.; Kim, J.-A.; Choi, J.-H.; Cho, M.; Jeon, S.-J.; Cho, B. R. J. Am . Chem . Soc . 2001, 123, 10658.)을 의미하며,
PMT 탐지기에 의해서 수집된 신호의 강도는 S로 표시되고,
Φ는 형광 양자 수율을 나타내고,
φ는 실험 장치의 전반적인 형광 수집 효율을 나타내며,
c는 용액 중의 분자들의 수밀도를 나타내고,
또한, δr은 참고 분자의 TPA 단면을 나타낸다.
측정을 위해서는 모드-락된 티타늄-사파이어 레이저 (Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs)가 사용되었다. 샘플들은 1.0·10-6 M의 농도로 물에 용해되었으며, 이광자 유도된 형광 강도는 740-940nm에서 측정되었다. 참고 표준 (r)로는 플루오레세인 (8·10-5 M 수용액, pH = 11)이 사용되었으며, 그 이광자 특성은 참고 문헌 (Xu, C.; Webb, W. W. J. Opt . Soc . Am . B. 1996, 13, 481.)에 잘 특성화되어 있다. 동일한 여기 파장에서 발광된 참고 물질 및 샘플의 이광자 유도된 형광 스펙트럼을 측정하였으며, 상기 수학식 1을 사용하여 TPA 단면을 계산하였다.
도 3에는 제조예 1, 3, 4 및 5의 화합물에 대한 이광자 여기 스펙트럼을 도 시하였으며, 수치들은 2 이상의 측정치에 대한 평균값들이다. δTPA에 대한 실험적 불확실성은 10-15% 정도이다.
도 4a 및 4b에는 제조예 4에 따른 화합물의 수용액에 대한 몰 흡수 스펙트럼 및 이광자 여기 스펙트럼 (도 4a)과, 제조예 4에 따른 화합물의 수용액에 대한 일광자 여기 형광 스펙트럼 및 이광자 여기 형광 스펙트럼 (도 4b)을 도시하였다. 도 4a 및 4b를 참조하면, 일광자 및 이광자 흡수 최대값은 총 흡수 에너지의 관점에서 상당 부분 중첩되는 것을 보여주며, 본 발명에 따른 다른 화합물들에 대해서도 유사한 결과가 관측되었다. 흥미롭게도, 제조예 1, 3, 4 및 5의 화합물에 대한 
는 물 중에서 780-940 nm로 관측되었는데, 이는 대부분의 TPM이 여기 파장으로서 700-1000 nm 범위의 파장을 사용한다는 점을 감안하면, 생물학적 영상화에 있어서 매우 중요한 사실이다. 또한, 후술하는 바와 같이, 일광자 여기 형광 스펙트럼과 이광자 여기 형광 스펙트럼이 거의 완전히 중첩되는데, 이는 발광이 여기 모드에 관계없이 동일한 상태로부터 발생된다는 사실을 반증한다.
제조예 1, 3, 4 및 5의 화합물에 대한 δmax 수치들은 140-470 GM이었으며, 공여체/수용체 강도에 따라서 점차적으로 제조예 1 < 제조예 3 < 제조예 4 < 제조예 5의 순서로 증가하였으며, 최대값은 제조예 5의 화합물에 대한 470 GM이었다. 강한 공여체/수용체일수록 전하 수송 특성을 증가시켜서 TPA 변환 쌍극자 기질 요소를 더욱 증가시킬 뿐만 아니라, 형광 스펙트럼의 단일 톤 적색 이동에서 발견되는 것과 같은 기저 및 제1 여기 상태 사이의 에너지 간격을 감소시킨다.
실시예 4. 광안정성의 측정
광안정성은 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) 인지질로부터 성장되고 제조예 4에 따른 화합물이 표지된 거대 단일층상 소포 (giant unilamellar vesicles, GUVs)를 사용하여 측정하였다. 광안정성은 통상적으로 반복적인 레이저 조사에 따른 용액 중의 탐침의 흡수 및/또는 발광 스펙트럼의 변화에 의해서 측정되었다. 그러나, 이는 영상 조건 하에서의 직접적인 광안정성 측정방법은 될 수 없는데, 용액 중의 염료 분자들이 조사 도중에 초점으로부터 쉽게 확산되기 때문이다. 이러한 문제점을 방지하기 위해서, 본 발명자들은 확산 속도가 훨씬 느린 GUVs 내에 채워진 염료의 시간에 따른 TPEF 강도를 모니터링하였다. DOPC로부터 성장된 GUVs가 세포질에 대한 모델로 사용되었는데, 이것이 가장 친수성인 소포이기 때문이다.
도 5a에는 25℃에서 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) 인지질로부터 성장되고 제조예 4에 따른 화합물이 표지된 거대 단일층상 소포에 대한 이광자 형광 영상을 도시하였다. 여기광 (λ=840 nm)은 영상의 수평축에 평행하게 편광되었으며, 도면 하단에 표시된 축척 막대는 20 ㎛에 해당된다.
도 5a를 참조하면, 제조예 4에 따른 화합물이 채워진 DOPC GUVs는 편광에 의해서 여기되는 경우에 적도 단면 전반에 걸쳐서 강한 TPEF를 방출한다는 사실을 알 수 있으며, 이는 광선택 효과 (photoselection effect)가 없음을 의미한다. 이러한 사실은 염료가 쉽게 채워지며, GUVs 내에서 무작위로 배향되는 것을 의미한다 (Krasnowska, E. K.; Gratton, E.; Parasassi, T. Biophys . J. 1998, 74, 1984.).
한편, 유사한 결과가 1,4-비스[(E)-4-(디헥실아미노)스티릴]벤조니트릴 (참고 화합물 1) 및 2,5-비스[6-(디헥실아미노)-1-H-인돌-2-일]벤조니트릴 (참고 화합물 2)에 대해서 관찰되었지만, 영상들이 덜 명확하며 이는 제한된 수용성 때문에 염료 함량이 낮기 때문이다 (도 5b 및 5c 참조). 염료가 채워진 GUVs (~40 ㎛)로부터의 TPEF 강도는 TPM 하에서 조사 시간에 따라 감소하였다. 예상한 바와 같이, 광탈색 (photobleaching) 속도는 1차 동역학을 따랐으며 (Kim, H. M.; Yang, W. J.; Kim, C. H.; Park, W.-H.; Jeon, S.-J.; Cho, B. R. Chem . Eur . J. 2005, 11, 6386.; Giloh, H.; Sedat, J. W. Science, 1982, 217, 1252.), 제조예 4의 화합물, 참고 화합물 1 및 참고 화합물 2에 대한 반감기 (t1 /2)는 각각 7.3, 14.5, 및 108분이었다 (도 6 참조).
참고 화합물 2의 반감기가 참고 화합물 1의 반감기보다 2배 더 크다는 사실은 본 발명자들이 DPPC GUVs에 대해서 기존에 보고한 바 (Kim, H. M.; Yang, W. J.; Kim, C. H.; Park, W.-H.; Jeon, S.-J.; Cho, B. R. Chem . Eur . J. 2005, 11, 6386.; Giloh, H.; Sedat, J. W. Science, 1982, 217, 1252.)와 잘 일치하며, 참고 화합물 1 중의 스틸베노이드 C=C 결합보다 인돌린 부위 중의 방향족 C=C 결합의 광반응성이 더 낮다는 사실에 기인한다. 가장 흥미로운 결과는, 제조예 4에 따른 화합물의 반감기가 참고 화합물 2의 그것보다 훨씬 크다는 점이다. 본 발명에 따른 염료가 이와 같이 우수한 광안정성을 갖는 원인은 분명치 않으나, 제조예 4에 따른 화합물의 C-3에 존재하는 2개의 수용체기들이 C=C 결합을 더욱 안정화시켜서 광반 응성을 감소시킨 것으로 판단된다. 더 나아가, 광화학적으로 불활성인 에스테르기들이 부가적인 기여를 하였을 가능성도 있다.
실시예 5. 세포 투과도의 측정
세포 투과도를 측정하기 위해서, A431 세포들을 사용하였다. A431 세포들은 페니실린/스트렙토마이신 및 10% 우 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)으로 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 중에서 배양하였으며, 배양은 37℃ CO2 배양기 중에서 수행하였다. A431 세포들은 무혈청 배지로 3회 세척되었으며, 무혈청 배지 중의 제조예 4에 따른 화합물 5μM와 함께 37℃에서 배양되었다. 3시간 경과 후, 세포들을 3회 세척하고, 3.7% 포름알데히드로 고정한 다음 관찰하였다.무혈청 배지로 세척하였으며, 37℃에서 3시간 동안 무혈청 배지 중에서 5 μM의 제조예 4에 따른 화합물과 함께 배양하였다.
도 7에는 제조예 4에 따른 화합물이 표지된 A431 세포들에 대한 TPEF 영상 (λ=880 nm, 도면 하단의 축척은 30 ㎛)을 도시하였다. 영상은 선명하며, 이는 제조예 4에 따른 화합물이 세포막을 용이하게 투과하였다는 사실을 반증하는 것이고, TPEF 강도는 TPM을 수행할 수 있을 정도로 충분히 강했다.
한편, 제조예 6에 따른 화합물을 단백질 탐침으로 사용하여 포유류 세포 내로의 단백질 함입 (internalization)을 조사하였다. 단백질로는 전구염증성 시토카인 (proinflamatory cytokine) p43 단백질을 사용하였으며, 이는 세포 표면에 결합한 이후에 우 대동맥 내피 세포들 (BAECs) 내로 함입되는 것으로 알려져 있다 (Ko, Y.-G.; Park, H.; Kim, T.; Lee, J.-W.; Park, S. G.; Seol, W.; Kim, J. E.; Lee, W.-H.; Kim, S. H.; Park, J.-E.; Kim, S. J. Biol . Chem . 2001, 276, 23028. (b) Yi, J.-S.; Lee, J.-Y.; Chi, S.-G.; Kim, J.-H.; Park, S. G.; Kim, S.; Ko, Y.-G. J. Cell . Biochem . 2005, 96, 1286.).
p43 단백질은 E.coli BL21 (DE3)에서 His 태그 융합 단백질로서 발현되며, 니켈 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제되었다 (Ko, Y.-G.; Park, H.; Kim, T.; Lee, J.-W.; Park, S. G.; Seol, W.; Kim, J. E.; Lee, W.-H.; Kim, S. H.; Park, J.-E.; Kim, S. J. Biol . Chem . 2001, 276, 23028.). 정제된 500 ㎍의 p43을 4℃에서 4시간 동안 0.8 mM의 제조예 6에 따른 화합물과 접합시킨 다음, 비접합된 화합물들을 제거하기 위해서 Sephadex G75 컬럼 상에 채웠다. 제조예 6에 따른 화합물이 접합된 p43의 존재를 확인하기 위해서, 각각의 분획을 SDS-PAGE에 의해서 분리하였다. 폴리아크릴아미드 겔을 자외선 (302 nm) 하에서 (도 8a), 그리고 Coomassie Blue R-250으로 염색함으로써 (도 8b) 가시화하였다. 세포 내로의 함입을 위한 물질로는 분획 7 및 8을 사용하였다. 도 8a 및 8b로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조예 6에 따른 화합물은 p43에 용이하게 접합되었다.
도 9에는 제조예 6에 따른 화합물이 접합된 p43이 세포 내로 함입되어 축적된 상태 (37℃에서 배양)에서의 이광자 형광 영상 (λ=840 nm, 도면 하단의 축척은 30 ㎛)을 도시하였으며, 도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 이광자 염료가 TP 단백질 탐침으로 매우 유용하다는 사실을 알 수 있다.
실시예 6. 독성 관찰
제조예 4에 따른 화합물의 독성을 측정하기 위해서 제조예 4에 따른 화합물 또는 DMSO로 표지된 A431 세포들의 생존율을 하기 MTT 분석법을 사용하여 비교하였다.
A431을 10% 우 태아 혈청 함유 DMEM으로 96-웰 플레이트 중에서 1일 동안 성장시킨 다음, 무혈청 배지에서 3시간 동안 배양하였다. 세포들을 운반체 대조군 (DMSO) 또는 제조예 4에 따른 화합물과 함께 37℃에서 3시간 동안 더욱 배양하였다. 상기 실험에는 동일한 농도의 DMSO 및 제조예 4에 따른 화합물이 사용되었다 (1×10-5, 5×10-6 및 1×10-6 M). 세포들을 PBS로 2회 세척하고, Dulbecco's modified Eagle's 배지 내에서 제조된 100 ㎕의 MTT (500 ㎍/mL)로 37℃에서 4시간 동안 처리한 다음, 부드럽게 흔들어 주며 100 ㎕ DMSO로 37℃에서 10분 동안 용해시켰다. 용해물의 흡광도를 컴퓨터-제어 마이크로플레이트 분석기를 사용하여 595nm에서 측정하였다.
도 10에는 DMSO 및 제조예 4에 따른 화합물을 서로 다른 농도에서 3시간 동안 세포들과 함께 배양한 경우 세포 생존율에 대한 그래프를 도시하였으며, 도 10을 참조하면 본 발명에 따른 염료는 독성이 거의 없고, 따라서 생체 세포 영상화에 적합한 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 이광자 염료는 높은 δTPA를 갖기 때문에 분자내 전하 수송이 용이하며, 광안정성이 우수하고, 수용성이 뛰어나며, 작은 분자량을 갖기 때문에 세포 투과성이 우수하다는 효과를 갖는다.
Claims (9)
- 화학식 1의 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료:<화학식 1>
상기 식에서,X는 -OCH3, -OH 또는 -N(CH3)2이고,Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다. - 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 이광자 여기 스펙트럼 (nm)의 최대 파장 범위가 780nm 내지 940nm인 것을 특징으로 하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료.
- 화학식 4의 화합물로부터 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 2>
상기 식에서,X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이고,Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다;<화학식 4>
상기 식에서,X는 -OCH3 또는 -N(CH3)2이다. - 제3항에 있어서, 상기 화학식 2 및 화학식 4에서 X가 -N(CH3)2인 경우, 상기 화학식 4의 화합물은 하기 화학식 5의 화합물과 디클로로디시아노퀴논을 반응시켜서 제조되는 것을 특징으로 하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 5>.
- 화학식 6의 화합물로부터 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 3>
상기 식에서,X는 -OH이고,Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다;<화학식 6>
상기 식에서,X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이고,Y는 -COOCH3, -CN 또는 -COOC4H4NO2이다. - 제5항에 있어서, 상기 화학식 6의 화합물은 하기 화학식 7의 화합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 7>
상기 식에서,X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다. - 제6항에 있어서, 상기 화학식 7의 화합물은 하기 화학식 8의 화합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 8>
상기 식에서,X는 t-부틸디메틸실라닐옥시기이다. - 제7항에 있어서, 상기 화학식 8의 화합물은 하기 화학식 9의 화합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 세포의 실시간 모니터링용 이광자 염료의 제조방법:<화학식 9>
상기 식에서,X는 -OH이다. - 제1항 또는 제2항에 따른 이광자 염료를 관찰 대상이 되는 세포질 내로 주입한 후 방출되는 이광자 여기 형광 영상을 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 실시간 모니터링 방법.
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| US20040157231A1 (en) | 2001-07-02 | 2004-08-12 | Niko Meltola | Two-photon absorbing dipyrromethenboron difluoride dyes and their applications |
| JP2005000629A (ja) * | 2003-06-14 | 2005-01-06 | Takehiko Oki | デスクマット及びデスクシート |
| JP2005001231A (ja) * | 2003-06-11 | 2005-01-06 | Toyo Tire & Rubber Co Ltd | ゴム連続混練押出機 |
| JP2005213434A (ja) | 2004-01-30 | 2005-08-11 | Kyoto Univ | ジアリールアミノ基を有するピラン誘導体からなる二光子吸収材料 |
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2007
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| Title |
|---|
| 논문2005.06.29 |
| 논문2005.12.31 |
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