KR101484748B1

KR101484748B1 - 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서 및 이를 이용한 질병 진단 방법

Info

Publication number: KR101484748B1
Application number: KR1020140036462A
Authority: KR
Inventors: 김종승; 이재홍; 히얀시아; 양즈강; 강철훈; 박나영; 정효성
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2015-01-21

Abstract

본 발명은 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서 및 이를 이용한 질병 진단 방법에 관한 것으로 하기 [화학식 1]로 표시되고, 형광 비율척도 및 형광 수명이미지(FLIM)에 의하여 세포 내에서 미토콘드리아의 점도를 정량화할 수 있으며 이로 인하여 미토콘드리아 관련 질병의 진단에 이용이 가능하다.
[화학식 1]

Description

세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서 및 이를 이용한 질병 진단 방법{A self-calibrating bipartite sensor for viscosity measure into cells and method for the diagnosis using the same}

본 발명은 자가 보정이 가능하고 세포 내에서 미토콘드리아의 점도를 정량화할 수 있으며 이로 인하여 미토콘드리아 관련 질병의 진단에 이용이 가능한 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서 및 이를 이용한 질병 진단 방법에 관한 것이다.

세포내 점도는 신호전달 및 생체분자간의 상호작용을 주관하는데 매우 중요한 인자이다. 이는 세포내 막의 단백질-단백질 상호작용에 영향을 주기 때문에 실제로 동맥경화, 당뇨병, 알츠하이머 질환 및 심지어 세포 악성종양의 주요 표지인자로서 작용할 수 있다.

미토콘드리아 매트릭스의 점도는 미토콘드리아 네트워크 기관내 기계적으로 또는 삼투압적으로 유도된 변화의 분자적 결과에 의하여 미토콘드리아의 호흡 상태와 깊이 연관되어 있다. 이는 미토콘드리아 매트릭스 점도의 변화가 대사 분산을 조절할 수 있고, 결과적으로 미토콘드리아 대사를 조절할 수 있다는 것을 의미한다.

세포내 점도 측정을 위하여, 플렉서블 링커, 에너지 도너(donor) 및 에너지 억셉터(acceptor)로 구성된 형광공명에너지전이(Forster resonance energy transfer, FRET) 시스템과 같은 듀얼 형광 잔기를 갖는 센서가 제안되어 왔다.

상기 형광공명에너지전이 시스템은 점도-의존성 플루오로포어의 형광 강도가 점도-독립적 잔기의 것에 대하여 보정(calibration)이 되는 장점을 제공한다. 그러나, 상기 형광공명에너지전이 시스템에서 2개의 플루오로포어의 상대적 성향이 매체, 염색 농도 및 기타 실험적 또는 기구적 인자에 따라 달라질 수 있어서, 점도 측정에 있어서 불명확한 결과가 나타날 수 있다.

따라서, 에너지 도너와 억셉터의 거리가 불확정성을 최소화하도록 고정화되고 점도 변화에 민감한 “분자 회전자(rotor)"를 제공하도록 되어 있는 TBET 카셋트와 같은 분자 쌍을 디자인하는 것이 이상적이다. 또한, 미토콘드리아 가이드 유닛의 추가는 자가-보정 능력을 갖는 미토콘드리아 매트릭스 점도 센서를 제공하는 주요골격일 수 있다.

대한민국 공개특허 제10-2001-0071428호 대한민국 공개특허 제10-2008-0018872호

본 발명의 목적은 자가 보정이 가능하고 세포 내에서 미토콘드리아의 점도를 정량화할 수 있으며 이로 인하여 미토콘드리아 관련 질병의 진단에 이용이 가능한 화합물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 센서를 이용한 질병 진단 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 화합물은 하기 [화학식 1]로 표시된다;

[화학식 1]

.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서는 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함한다.

상기 화합물은 세포내 미토콘드리아의 점도를 측정할 수 있다.

또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세포내 미토콘드리아의 점도를 측정하여 질병을 예측 또는 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법은 (a) 피검체로부터 분리된 조직 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 제공된 샘플에 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 화합물이 첨가된 샘플의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 제조방법은 하기 [반응식 1]에 따라 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 6]의 화합물을 용해시킨 후 포스겐을 첨가하여 교반한 다음 디이소프로필에틸아민(DIPEA), PPh³ ⁺(CH₂)₂NH₂Br^-및 디클로로메탄(DCM)을 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 1]

[화학식 6] [화학식 1].

상기 [화학식 6]의 화합물은 하기 [반응식 2]에 따라 [화학식 7]의 화합물 및 피롤을 질소 분위기하에서 디클로로메탄(DCM)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가한 다음 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디클로로디시아노-p-벤조퀴논(DDQ)을 첨가하고 BF₃-Et₂O 및 Et₃N을 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 2]

[화학식 7] [화학식 6].

상기 [화학식 7]의 화합물은 하기 [반응식 3]에 따라 [화학식 8]의 화합물, 4-포르밀페닐보론산(formylphenylboronic acid), Pd(PPh₃)₄를 혼합한 다음 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 디에톡시메탄을 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 3]

[화학식 8] [화학식 7].

상기 [화학식 8]의 화합물은 하기 [반응식 4]에 따라 [화학식 9]의 화합물에 N-브로모숙신이미드(NBS) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 4]

[화학식 9] [화학식 8].

상기 [화학식 9]의 화합물은 하기 [반응식 5]에 따라 염화아연(ZnCl₂)하에서 [화학식 10]의 화합물에 에틸아세토아세테이트(CH₃COCH₂COOEt) 및 에탄올을 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 5]

[화학식 10] [화학식 9].

상기 [화학식 10]의 화합물은 하기 [반응식 6]에 따라 [화학식 11]의 화합물에 요오도에탄(ICH₂CH₃), 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 반응함으로써 제조된다;

[반응식 6]

[화학식 11] [화학식 10].

본 발명의 화합물은 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 형광 수명(τ₅₁₆)이 점도와 우수한 직선형 관계에 있으므로 형광 비율척도 및 자가-보정이 가능한 형광 수명 이미지(FLIM)에 의하여 세포내의 미토콘드리아 점도를 정량화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 모넨신 및 니스타틴의 처리에 의하여 유도된 미토콘드리아 세포소멸에 대한 점도 변화를 측정할 수 있으며, 미토콘드리아 점도 조사 및 특정 미토콘드리아가 관련된 질병의 진단에 사용이 가능하다.

도 1a 및 도 1b는 [화학식 10]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 [화학식 9]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 [화학식 4]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 그래프이다.
도 4는 용매 점도의 변화에 따른 [화학식 1] 화합물의 (A) 형광 변화 스펙트럼이고, (C) 형광 소멸을 나타낸 그래프이며, 용매 점도 변화에 따른 (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 (D) 형광 수명의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 상이한 비율의 용매에 따른 쿠마린의 형광 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (A) λ_ex= 330 nm, (B) 형광 강도 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프, (C) 점도의 증가로 쿠마린의 형광 감쇠를 나타낸 스펙트럼; (D) 형광 수명 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 (A) 1,4-다이옥산 및 물의 상이한 비율에서 [화학식 1] 화합물의 형광 스펙트럼이고, (C) 1,4-다이옥산 및 물의 상이한 비율에서 [화학식 1] 화합물의 형광 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 (D) 형광 수명 대 용매의 유전상수(ε)간의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 7은 (A) 용매 점도의 증가에 따른 [화학식 1] 화합물의 형광 증가를 나타낸 스펙트럼이고; (B) 용매 비율 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 8은 (A) 상이한 점도의 용매에서 [화학식 2] 화합물의 형광 스펙트럼이고, (C) 상기 [화학식 2] 화합물의 형광수명 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 (D) 형광 수명 대 점도의 관계를 나타낸 그래프이고, 메탄올-글리세롤 용매 시스템에서 [화학식 1] 화합물 및 [화학식 2] 화합물의 (E) 형광 강도 비율 및 (F) 형광 수명 대 점도의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 9는 (A) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 4] 화합물의 형광 스펙트럼이고, (C) 상기 [화학식 4] 화합물의 형광 수명 시간 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율 및 (D) 형광 수명 대 용매 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 10은 (A) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 3] 화합물의 형광 스펙트럼이고, (C) 상기 [화학식 3] 화합물의 형광 수명시간 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율 및 (D) 형광 수명 대 점도의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 11은 [화학식 1]의 화합물, [화학식 1]의 화합물과 Mito-tracker Red(0.5 μM) 또는 [화학식 1]의 화합물과 Lyso-Sensor Blue DND-167(1.0 μM)로 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다.
도 12는 [화학식 1]의 화합물, [화학식 2]의 화합물, [화학식 3]의 화합물 및 각 화합물과 Lyso-Sensor Blue DND-167(1.0 μM)의 조합으로로 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다.
도 13은 [화학식 1]의 화합물, [화학식 2]의 화합물, [화학식 3]의 화합물 및 각 화합물과 Mito-trackerBlue DND-167의 조합으로 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다.
도 14는 헬라세포(HeLa cells)에서 [화학식 1]의 화합물의 공초점 레이저 형광 이미지(B 및 C) 및 ImagePro Plus software 및 형광 지속시간의 이미지에 의해 얻은 비율척도 이미지(DF)이다.
도 15는 헬라세포에서 [화학식 1] 화합물의 형광 수명 이미지이다.
도 16은 720 nm(이광자 여기)에서 여기된 [화학식 1] 화합물, [화학식 2] 화합물 및 [화학식 3] 화합물과 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다.
도 17은 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 1] 화합물의 공초점 레이저 형광 이미지이다.
도 18은 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 2] 화합물의 공초점 레이저 형광 이미지이다.
도 19는 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 3] 화합물의 공초점 레이저 형광 이미지이다.
도 20은 (A) 메탄올에서 [화학식 2] 화합물의 표준화된 흡수 및 형광 스펙트럼이고, (B) 다른 용매에서 [화학식 2] 화합물의 형광 반응을 나타낸 스펙트럼이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 화합물은 하기 [화학식 1]로 표시되며, 이를 포함하여 세포내 점도 측정용 센서로 이용할 수 있다. 상기 세포내 점도 측정용 센서는 자가 보정이 가능하고 살아있는 세포내에서 미토콘드리아의 점도를 정량화할 수 있는 형광 센서이다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 쿠마린-보디피(보로디피로메텐, BODIPY)가 구비된 부분과 페닐 스페이서가 구비된 부분, 예컨대 두 부분으로 이루지고 자가 보정이 가능하다.

구체적으로, 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 형광 리포터로 쿠마린 및 보디피(BODIPY); 페닐 스페이서; 및 미토콘드리아 타켓팅 유닛으로 트리페닐포스포늄;으로 구성된다. 상기 페닐 스페이서와 보디피(BODIPY) 간의 C-C 결합은 자유롭게 회전되므로 저-점도 환경에서 C-C 결합의 회전이 빨라 형광이 억제될 수 있으며, 반대로 고-점도 환경에서 C-C 결합의 회전이 느려 형광이 증진될 수 있다.

본 발명에 따른 [화학식 1]은 측정된 형광 비율척도(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 형광 수명이미지(FLIM, τ₅₁₆)에 의하여 세포 내에서 미토콘드리아의 점도를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라, 모넨신(monensin) 및 니스타틴(nystatin)과 같은 약물에 의한 미토콘드리아 점도의 변화를 입증하기 위해서도 사용될 수 있다.

또한, 상기 [화학식 1]의 화합물은 하기 [반응식 A]의 합성과정으로 합성된다.

[반응식 A]

[화학식 11] [화학식 10] [화학식 9] [화학식 8]

[화학식 7] [화학식 6] [화학식 1]

상기 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서에 포함되는 [화학식 1]의 화합물은 [화학식 11]의 화합물에 요오도에탄(ICH₂CH₃), 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 50 내지 80 ℃에서 1 내지 3시간 동안 교반하여 [화학식 10]의 화합물을 제조한 후, 염화아연(ZnCl₂)하에서 [화학식 10]의 화합물에 에틸아세토아세테이트(CH₃COCH₂COOEt) 및 에탄올을 첨가하여 80 내지 110 ℃에서 10 내지 15시간 동안 환류 교반하여 [화학식 9]의 화합물을 제조한 다음, N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 첨가된 [화학식 9]의 화합물 용액에 N-브로모숙신이미드(NBS)을 천천히 첨가한 후 22 내지 27 ℃에서 10 내지 15시간 동안 교반하여 [화학식 8]의 화합물을 제조하였다. [화학식 8]의 화합물, 4-포르밀페닐보론산 및 Pd(PPh₃)₄을 플라스크에 넣은 후 질소로 30분 동안 플러싱한 다음 디에톡시메탄 및 K₂CO₃이 첨가된 혼합액을 첨가하여 80 내지 110 ℃에서 10 내지 15시간 동안 환류 교반하여 [화학식 7]의 화합물을 제조한 다음, [화학식 7]의 화합물 및 피롤을 질소분위기 하에서 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA) 첨가하여 22 내지 27 ℃에서 교반하고 동일한 온도에서 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)을 첨가한 용액을 첨가하여 30 내지 90분 동안 교반한 후 Et₃N 및 BF₃-Et₂O을 각각 첨가한 다음 1 내지 3시간 동안 교반하여 [화학식 6]의 화합물을 제조한 후, 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 6]의 화합물을 용해시킨 후 -1 내지 1 ℃하에서 포스겐을 천천히 첨가한 다음 22 내지 27 ℃에서 30 내지 90분 동안 교반하고 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 및 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드를 -1 내지 1 ℃하에서 천천히 첨가한 후 22 내지 27 ℃에서 4 내지 8시간 동안 교반하여 제조된다.

이러한 화합물의 구조는 ¹H NMR, ¹³C NMR 등을 통하여 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

< 실시예 >

합성예 1. [화학식 1]로 표시되는 화합물의 합성

1-1. [화학식 10]으로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 6]

[화학식 11] [화학식 10]

[화학식 11]의 화합물에 요오도에탄(ICH₂CH₃), 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 60 ℃에서 2시간 동안 교반하여 [화학식 10]의 화합물(수율: 75%)를 얻었다.

상기 [화학식 10]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 각각 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

1-2. [화학식 9]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 5]

[화학식 10] [화학식 9]

염화아연(ZnCl₂)하에서 [화학식 10]의 화합물에 에틸아세토아세테이트(CH₃COCH₂COOEt) 및 에탄올을 첨가하여 100 ℃에서 12시간 동안 환류 교반하여 [화학식 9]의 화합물(수율: 77%)을 제조하였다.

상기 [화학식 9]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

1-3. [화학식 8]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 4]

[화학식 9] [화학식 8]

DMF(80 ㎖)에 첨가된 [화학식 9]의 화합물(6 g, 30.7 mmol) 용액에 NBS(5.47 g, 30.7 mmol)을 천천히 첨가한 후 25 ℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면, 혼합물을 소금물로 세척하고 에틸아세테이트(EA)로 추출한 다음 추출된 유기물을 Na₂SO₄로 건조한 후 회전 증발기로 농축하였다. 농축된 혼합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(DCM/Ethyl acetate, 20:1, v/v)로 정제하여 [화학식 8]의 화합물 3.4g(수율: 41%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 1.30(t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 2.53(s, 3H, CH₃), 3.21(m, 2H, CH₂), 4.25(s, 1H, NH), 6.42(d, 1H, ArH, J= 4Hz), 6.51(d, 1H, ArH, J= 8 Hz), 7.38(d, 1H, ArH, J= 8 Hz). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃):14.60, 19.41, 38.25, 97.70, 106.62, 110.43, 111.08, 126.17, 151.77, 151.84, 154.61, 158.17.

1-4. [화학식 7]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 3]

[화학식 8] [화학식 7]

[화학식 8]의 화합물(3.4 g, 12.1 mmol), 4-포르밀페닐보론산(2.71 g, 18.15 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄(0.70 g, 0.605 mmol)을 플라스크에 넣은 후 질소로 30분 동안 플러싱한 다음 17 ㎖ 증류수에 200 ㎖ 디에톡시메탄 및 K₂CO₃(5.06 g, 36.3 mmol)이 첨가된 혼합액을 첨가하여 100 ℃에서 15시간 동안 교반하였다. 용매를 진공으로 제거한 후 혼합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(DCM/Ethyl acetate, 20:1, v/v)로 정제하여 [화학식 7]의 화합물 1.34g(수율: 36%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 1.32(t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 2.25(s, 3H, CH₃), 3.25(m, 2H, CH₂), 4.20(s, 1H, NH), 6.53(m, 2H, ArH), 7.47(m, 3H, ArH), 7.96(d, 2H, ArH, J= 8 Hz), 10.06(s, 1H, ArH). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl3):14.47, 16.49, 38.09, 97.68, 110.53, 110.63, 120.37, 126.19, 131.41, 133.51, 141.84, 149.01, 151.57, 155.25, 161.34.

1-5. [화학식 6]으로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 2]

[화학식 7] [화학식 6]

피롤(100 mg, 1.5 mmol) 및 [화학식 7]의 화합물(230 mg, 0.75 mmol)을 질소분위기 하에서 70 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA) 한 방울을 첨가한 다음 25 ℃에서 교반하여 알데하이드가 완전히 소멸될 때 까지 반응하였으며, 이를 TLC로 확인하였다. 동일한 온도에서 19 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)(0.205 g, 1.55 mmol)을 첨가한 용액을 첨가하여 1시간 동안 교반한 후 5 ㎖ Et₃N 및 5 ㎖ BF₃-Et₂O을 각각 첨가한 다음 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 혼합물을 물로 세척하고 Na₂SO₄로 건조한 후 회전 증발기로 농축하였다. 농축된 혼합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(Hexane/Ethyl acetate, 1:2, v/v)로 정제하여 [화학식 6]의 화합물 35.1 mg(수율: 10%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 1.33 (t, 3H, CH₃, J = 8 Hz), 2.32 (s, 3H, CH₃), 3.26 (m, 2H, CH₂), 4.20 (s, 1H, NH), 6.54 (m, 4H, ArH), 7.06 (d, 2H, ArH, J = 4 Hz), 7.49 (t, 3H, ArH, J = 8 Hz), 7.65 (d, 2H, ArH, J = 8 Hz), 7.96 (s, 2H, ArH). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃): 14.68, 16.88, 38.31, 97.88, 110.85, 110.87, 118.74, 120.52, 126.43, 130.66, 131.04, 131.97, 133.25, 135.09, 138.38, 144.29, 147.29, 149.27, 151.76, 155.43, 161.81.

1-6. [화학식 1]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 1]

[화학식 6] [화학식 1]

40 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 6]의 화합물(60 mg, 0.13 mmol)를 용해시킨 후 아이스 배스하에서 포스겐(0.13 ㎖, 0.26 mmol)을 천천히 첨가한 다음 25 ℃에서 1시간 동안 교반하고 용매를 증발시켰다. 그 후 50 ㎖의 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 5 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(0.06 ㎖, 0.39 mmol) 및 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드(100 mg, 0.26 mmol)를 아이스 배스하에서 천천히 첨가하고 아이스 배스를 제거하여 25 ℃에서 6시간 동안 교반하였다. 용매 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 제거하고 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(DCM/MeOH, 15:1, v/v)로 정제하여 [화학식 1]의 화합물 12 mg(수율: 10%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 1.20 (t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 2.40 (s, 3H, CH₃), 3.74 (m, 2H, CH₂), 3.85 (m, 2H, CH₂), 3.96 (m, 2H, CH₂), 6.58 (d, 2H, ArH, J= 4Hz), 7.05 (d, 2H, ArH, J= 4Hz), 7.21 (d, 1H, ArH, J= 4Hz), 7.31 (m, 1H, ArH), 7.51 (m, 1H, ArH), 7.69 (m, 10H, ArH), 7.82 (m, 8H, ArH), 7.96 (s, 2H, ArH). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃):14.11, 17.11, 29.89, 35.63, 44.74, 114.98, 117.96, 118.42, 118.81, 124.03, 125.38, 126.45, 130.64, 130.69, 130.76, 131.98, 133.75, 133.85, 135.06, 135.28, 135.31, 137.62, 144.37, 145.70, 148.65, 153.33, 157.12, 160.97.

< 제조예 >

합성예 2. [화학식 2]로 표시되는 화합물의 합성

2-1. [화학식 2]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 7]

[화학식 6] [화학식 2]

40 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 6]의 화합물(60 mg, 0.13 mmol)를 용해시킨 후 아이스 배스하에서 포스겐(0.13 ㎖, 0.26 mmol)을 천천히 첨가한 다음 25 ℃에서 1시간 동안 교반하고 용매를 증발시켰다. 그 후 50 ㎖의 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 5 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(0.06 ㎖, 0.39 mmol) 및 프로판-1-아민(16 mg, 0.26 mmol)을 아이스 배스하에서 천천히 첨가하고 아이스 배스를 제거하여 25 ℃에서 6시간 동안 교반하였다. 용매 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 제거하고 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(Hexane/Ethyl acetate, 1:2, v/v)로 정제하여 [화학식 2]의 화합물 8 mg(수율: 11%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 0.80 (t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 1.10 (t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 1.40 (m, 2H, CH₂), 2.35 (s, 3H, CH₃), 3.12 (q, 2H, CH₂, J= 8 Hz), 3.76 (q, 2H, CH₂, J= 8 Hz), 4.35 (t, 1H, NH, J= 4 Hz), 6.50 (d, 2H, ArH, J= 4 Hz), 6.96 (d, 2H, ArH, J= 4 Hz), 7.20 (m, 2H, ArH), 7.42 (d, 2H , ArH, J= 4 Hz), 7.60 (d, 2H, ArH, J= 4 Hz), 7.69 (d, 1H, ArH, J= 4 Hz), 7.89 (s, 2H, ArH). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃): 11.59, 14.20, 17.09, 23.51, 42.82, 44.44, 115.65, 118.88, 118.97, 123.97, 126.75, 130.59, 130.76, 131.86, 133.97, 137.07, 144.54, 154.81, 147.96, 153.71, 156.31, 160.47.

합성예 3. [화학식 3]으로 표시되는 화합물의 합성

3-1. [화학식 5]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 8]

[화학식 7] [화학식 5]

2,4-디메틸-1H-피롤(142 mg, 1.5 mmol) 및 [화학식 7]의 화합물(230 mg, 0.75 mmol)을 질소분위기 하에서 75 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA) 한 방울을 첨가한 다음 25 ℃에서 교반하여 알데하이드가 완전히 소멸될 때 까지 반응하였으며, 이를 TLC로 확인하였다. 동일한 온도에서 19 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)(0.205 g, 1.55 mmol)을 첨가한 용액을 첨가하여 1시간 동안 교반한 후 5 ㎖ Et₃N 및 5 ㎖ BF₃-Et₂O을 각각 첨가한 다음 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 혼합물을 물로 세척하고 Na₂SO₄로 건조한 후 회전 증발기로 농축하였다. 농축된 혼합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(Hexane/Ethyl acetate, 1:2, v/v)로 정제하여 [화학식 5]의 화합물 39.4 mg(수율: 10%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 1.32 (t, 3H, CH₃, J = 8 Hz), 1.50 (s, 6H, CH₃), 2.24 (s, 3H, CH₃), 2.57 (s, 6H, CH₃), 3.25 (m, 2H, CH₂), 4.19 (t, 1H, NH, J = 8 Hz), 6.01 (s, 2H, ArH), 6.51 (m, 1H, ArH), 6.54 (m, 1H, ArH), 7.35 (d, 2H, ArH, J = 8 Hz), 7.44 (m, 3H, ArH). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃): 14.70, 14.76, 14.82, 16.69, 97.92, 110.74, 110.88, 121.07, 121.48, 126.30, 127.99, 131.63, 131.66, 134.40, 136.40, 141.69, 143.41, 148.70, 151.58, 155.40, 155.65, 161.62.

3-2. [화학식 3]으로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 9]

[화학식 5] [화학식 3]

35 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 5]의 화합물(50 mg, 0.095 mmol)를 용해시킨 후 아이스 배스하에서 포스겐(0.095 ㎖, 0.19 mmol)을 천천히 첨가한 다음 25 ℃에서 1시간 동안 교반하고 용매를 증발시켰다. 그 후 50 ㎖의 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 3 ㎖ 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(0.045 ㎖, 0.29 mmol) 및 프로판-1-아민(11 mg, 0.19 mmol)을 아이스 배스하에서 천천히 첨가하고 아이스 배스를 제거하여 25 ℃에서 6시간 동안 교반하였다. 용매 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 제거하고 생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(Hexane/Ethyl acetate, 1:2, v/v)로 정제하여 [화학식 3]의 화합물 7 mg(수율: 12%)을 얻었다.

¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃)δ(ppm):δ 0.87 (t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 1.17 (t, 3H, CH₃, J= 8 Hz), 1.47 (m, 8H, CH₃ 및 CH₂), 2.35 (s, 3H, CH₃), 2.57 (s, 6H, CH₃), 3.19 (q, 2H, CH₂, J= 8 Hz), 3.83 (q, 2H, CH₂, J= 8 Hz), 4.38 (t, 1H, NH, J= 4 Hz), 6.02 (s, 2H, Ar), 7.26 (m, 2H, Ar), 7.43 (q, 4H, Ar, J= 8 Hz), 7.73 (d, 1H, Ar, J= 8 Hz). ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): 11.59, 14.22, 14.74, 14.83, 16.89, 23.53, 42.81, 44.44, 115.77, 119.08, 121.60, 123.94, 126.65, 126.79, 128.35, 131.18, 131.55, 135.25, 135.30, 141.16, 143.23, 145.54, 147.34, 153.73, 155.90, 156.33, 160.29.

합성예 4. [화학식 4]로 표시되는 화합물의 합성

[반응식 10]

[화학식 4]

피롤(100 mg) 및 벤즈알데하이드(230 mg)를 질소분위기 하에서 70 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA) 한 방울을 첨가한 다음 25 ℃에서 교반하여 알데하이드가 완전히 소멸될 때 까지 반응하였으며, 이를 TLC로 확인하였다. 동일한 온도에서 19 ㎖ 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)(0.205 g, 1.55 mmol)을 첨가한 용액을 첨가하여 1시간 동안 교반한 후 5 ㎖ Et₃N 및 5 ㎖ BF₃-Et₂O을 각각 첨가한 다음 2시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 혼합물을 물로 세척하고 Na₂SO₄로 건조한 후 회전 증발기로 농축하였다. 농축된 혼합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래프(Hexane/Ethyl acetate, 1:2, v/v)로 정제하여 [화학식 4]의 화합물(수율: 10%)을 얻었다.

상기 [화학식 4]의 화합물에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

시험예 1. [화학식 1]의 화합물에 대한 점도의 변화 및 형광강도의 변화 사이의 관계

도 4는 용매 점도(메탄올-글리세롤 시스템)의 변화에 따른 [화학식 1] 화합물(1.0 μM)의 (A) 형광 스펙트럼의 변화 및 (C) 형광 소멸을 나타낸 그래프이며, 용매 점도 변화에 따른 (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 및 (D) 형광 수명의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 5는 상이한 비율의 메탄올-글리세롤 용매에 따른 쿠마린(1.0 )의 형광 스펙트럼을 나타낸 것으로서, (A) λ_ex= 330 nm; slit width = 3/3; (B) 형광 강도 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프, (C) 점도의 증가로 쿠마린의 형광 감쇠를 나타낸 스펙트럼; (D) 형광 수명 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 6은 (A) 1,4-다이옥산 및 물(0-90% of water)의 상이한 비율에서 [화학식 1] 화합물(1.0 μM)의 형광 스펙트럼이고, (C) 1,4-다이옥산 및 물(0-90% of water)의 상이한 비율에서 [화학식 1] 화합물(1.0 μM)의 형광 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇)과 용매의 유전상수(ε,)간의 관계를 나타낸 그래프이고, (D) 형광 수명과 용매의 유전상수(ε,)간의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 7은 (A) 용매 점도(물-글리세롤 시스템)의 증가에 따른 [화학식 1] 화합물(1.0 μM)의 형광 증가를 나타낸 스펙트럼이고; (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇) 값 및 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 8은 (A) 상이한 점도의 용매에서 [화학식 2] 화합물(1.0 μM)의 형광 스펙트럼이고, (C) 상이한 점도의 용매에서 [화학식 2] 화합물(1.0 μM)의 형광수명 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇)과 점도의 관계를 나타낸 그래프이고, (D) 형광 수명과 점도의 관계를 나타낸 그래프이며, 메탄올-글리세롤 용매 시스템에서 [화학식 1] 화합물 및 [화학식 2] 화합물의 (E) 형광 강도 비율과 점도의 관계를 나타낸 그래프이며, (F) 형광 수명과 점도의 관계를 나타낸 그래프이다. 여기서, 형광 수명시간 검출은 375 nm에서 여기되고, 516 nm에서 검출된 형광 수명은 200 시간-분해 분광측정기로 측정된다.

도 9는 (A) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 4] 화합물의 형광 스펙트럼이고, (C) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 4] 화합물의 형광 수명 시간 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며, (B) 형광 강도 비율과 용매 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이고, (D) 형광 수명과 용매 점도 사이의 관계를 나타낸 그래프이다. 상기 (B) 및 (D)는 직선형 관계이고, 직선형 관계는 스펙트럼 측정이 480 nm인 것에 대한 여기 파장이고, 형광 수명 시간 검출은 375 nm에서 여기되고 플루오 시간 200 시간-분해 분광측정기로 516 nm에서 검출된다.

도 10은 (A) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 3] 화합물(1.0 μM)의 형광 스펙트럼이고, (C) 상이한 비율의 메탄올-글리세롤에서 [화학식 3] 화합물(1.0 μM)의 형광 수명 감쇠를 나타낸 스펙트럼이며(slit width= 3/3), (B) 형광 강도 비율과 점도의 관계를 나타낸 그래프이고, (D) 형광 수명과 점도의 관계를 나타낸 그래프이다.

점도의 변화와 형광강도의 변화 사이의 관계를 조사하기 위하여, 형광 분광법이 수행되고, 합성된 화합물의 형광 수명이 측정된다.

도 4에 도시된 바와 같이, [화학식 1]의 화합물은 427 nm 및 516 nm에서 두 발광 피크가 보이며, 각 발광 강도는 용매 점도에 의해 향상되는 것을 확인하였다.

427 nm에서 쿠마린 잔기의 발광과 관련하여(도 5), 보디피(516 nm)의 녹색 발광은 향상된 용매 점도로 상당히 증가된다(도 4A). 또한, 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇)과 용매 점도(η)간의 관계가 직선형인 것을 확인하였다(R² = 0.995, 도 4B). 그러므로 [화학식 1]의 화합물은 생물학적 시스템을 포함하는 다양한 매체에서 점도를 비율 척도적으로 감지하기 위하여 사용될 수 있다. 그러나 상기 비율이 용매 극성에 의존한다는 것을 알았다(도 6).

또한, 516 nm에서 [화학식 1] 화합물의 형광 수명(τ_f)은 향상된 점도에 의해 점차적으로 향상된다(도 4C). 특히, 직선형 관계는 형광 지속시간(τ_f)과 용매 점도(η) (R² = 0.997) 사이에서 관찰된다(도 4D).

도 7에 도시된 바와 같이, [화학식 2] 화합물 및 [화학식 4] 화합물(도 8 및 9)의 경우와 유사한 관계는 물-글리세롤 시스템에서 얻어졌다.

입체 장애를 견딘 테트라메틸이 치환된 보디피인 [화학식 3] 화합물에 대하여, 형광 강도 비율 및 형광 수명은 예상대로 상대적으로 변화가 없었다(도 10).

시험예 2. [화학식 1]의 화합물에 대한 형광 이미지 측정

도 11은 [화학식 1]의 화합물, [화학식 1]의 화합물과 Mito-tracker Red(0.5 μM) 또는 [화학식 1]의 화합물과 Lyso-Sensor Blue DND-167(1.0 μM)로 각각 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다. (A) 및 (D)는 500-600 nm에서 수집되고 720 nm에서 여기된(이광자 여기) 헬라세포에서 [화학식 1]의 화합물의 형광 이미지이고, (B)는 514 nm에서 여기로 530-570 nm 밴드 패스 필터에 의해 수집된 Mito-Tracker Green FM(0.5 μM)의 형광 이미지이며, (C)는 (A) 및 (B)의 병합된 이미지이고, (E)는 740 nm(이광자 여기)에서 여기에 의해 370-550 nm의 필터에 의하여 수집된 Lyso-Sensor Blue DND-167 (1.0 μM)의 형광 이미지이며, (F)는 (D) 및 (E)의 병합된 이미지이다. 도 11의 스케일 바는 20 μM이다.

도 12는 [화학식 1]의 화합물, [화학식 2]의 화합물, [화학식 3]의 화합물(2.0 μM) 및 상기 각 화합물과 Lyso-Sensor Blue DND-167(1.0 μM)의 조합으로 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다. 또한, Merged은 각 화합물과 Lyso-tracker가 병합된 이미지이다. 720 nm에서 여기되며(이광자 여기), 스케일 바는 20 μm이다.

도 13은 [화학식 1]의 화합물, [화학식 2]의 화합물, [화학식 3]의 화합물(2.0 μM) 및 상기 각 화합물과 Mito-trackerBlue DND-167의 조합으로 처리된 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다. 또한, Merged은 각 화합물과 Mito-tracker가 병합된 이미지이다. 740 nm(이광자 여기)에서 여기시 370-550 nm의 필터에 의해 수집되며, 스케일 바는 20 μm이다.

미토콘드리아 및 리소좀 센서로 공초점 레이저 현미경을 사용하여 얻은 공존은 도 11에서 패널 (A-C) 및 (D-F)로 각각 나타낸다.

도 11의 (C) 및 (F)의 빨간색 부분은 각각 Mito-Tracker 및 Lyso-Sensor로 [화학식 1] 화합물의 공존을 나타내며, [화학식 1]의 화합물이 미토콘드리아(C)에 주로 위치하고 있다는 것을 나타낸다.

반면, 미토콘드리아 타겟팅 유닛이 없는 [화학식 2] 화합물 및 [화학식 3] 화합물은 트리페닐포스포늄 잔기로부터 유래된 [화학식 1]의 화합물이 미토콘드리아를 선호하는 것임을 보여주는 Mito-Tracker 녹색 FM과 강한 빨간색 이미지를 보여주지 못하였다(도 12 및 도 13).

시험예 3. [화학식 1] 화합물의 형광 강도 비율 측정

도 14는 헬라세포에서 [화학식 1]의 화합물(2.0 μM)의 공초점 레이저 형광 이미지(B 및 C) 및 ImagePro Plus software 및 형광 지속시간의 이미지에 의해 얻은 비율척도 이미지(D-F)이다. (A)는 헬라세포의 명시야 이미지이며, (B)는 720 nm에서 여기에 의해 370-470 nm에서 검출된 블루-채널 형광 이미지이고, (C)는 720 nm에서 여기에 의해 500-600 nm에서 검출된 그린-채널 형광 이미지이며, (D)는 ImagePro Plus 소프트웨어에서 이미지 (A)에 의하여 구분되는 이미지 (B)에 의해 얻어진 헬라세포에서 [화학식 1]의 화합물의 비율척도 이미지이고, (E) 및 (F)는 각각 모넨신 및 니스타틴으로 처리된 헬라세포에서 [화학식 1] 화합물의 비율척도 이미지이다.

도 15는 헬라세포에서 [화학식 1] 화합물(2.0 μM)의 형광 수명 이미지이다. (A)는 헬라세포로 배양된 [화학식 1] 화합물이고, (B)는 헬라세포로 [화학식 1] 화합물을 배양한 후 모넨신으로 배양한 것이며, (C)는 헬라세포로 [화학식 1] 화합물을 배양한 후 니스타틴으로 배양한 것이다. 여기 및 검출 파장은 각각 375 및 516 nm이다.

도 16은 720 nm(이광자 여기)에서 여기된 [화학식 1] 화합물, [화학식 2] 화합물 및 [화학식 3] 화합물(2.0 μM)과 헬라세포의 공초점 레이저 형광 현미경 이미지이다. (A), (E) 및 (I)는 헬라세포의 명시야 이미지이고; (B), (F) 및 (J)는 360-460 nm에서 수집된 블루 채널 이미지이며; (C), (G) 및 (K)는 500-600 nm에서 수집된 녹색 채널 형광 이미지이고; (D), (H) 및 (L)은 헬라세포에서 [화학식 1] 화합물, [화학식 2] 화합물 및 [화학식 3] 화합물(2.0 μM)의 형광척도 이미지이다. 형광척도 이미지는 ImageProplus 소프트웨어 스위트에 의해 얻어진다.

도 17은 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴(10.0 μM)으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 1] 화합물(2.0 μM)의 공초점 레이저 형광 이미지이다; (A), (E) 및 (I)는 명시야 이미지이며; (B), (F) 및 (J)는 블루 채널(360-460 nm)이미지이고; (C), (G) 및 (K)는 녹색 채널(500-600 nm) 이미지이며; (D), (H) 및 (L)은 720 nm에서 여기된 형광척도 이미지이다.

도 18은 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴(10.0 μM)으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 2] 화합물(2.0 μM)의 공초점 레이저 형광 이미지이다; (A), (E) 및 (I)는 명시야 이미지이며; (B), (F) 및 (J)는 블루 채널(360-460 nm)이미지이고; (C), (G) 및 (K)는 녹색 채널(500-600 nm) 이미지이며; (D), (H) 및 (L)은 720 nm에서 여기된 형광척도 이미지이다.

도 19는 헬라세포를 모넨신 및 니스타틴(10.0 μM)으로 처리하기 전 및 30분 동안 처리한 후의 [화학식 3] 화합물(2.0 μM)의 공초점 레이저 형광 이미지이다; (A), (E) 및 (I)는 명시야 이미지이며; (B), (F) 및 (J)는 블루 채널(360-460 nm)이미지이고; (C), (G) 및 (K)는 녹색 채널(500-600 nm) 이미지이며; (D), (H) 및 (L)은 720 nm에서 여기된 형광척도 이미지이다.

세포내 미토콘드리아 점도 이미지에 대한 센서([화학식 1]의 화합물)를 검증하기 위하여, 헬라세포의 공초점 레이저 형광 이미지는 서로 다른 두 이온 투과 담체(모넨신 및 니스타틴)의 존재에서 획득하였다. 상기 모넨신 및 니스타틴은 구조 변화 또는 미토콘드리아의 스웰링(swelling)에 의하여 미토콘드리아의 오작동을 유발하는 것으로 잘 알려졌다.

[화학식 1] 화합물의 쿠마린 및 보디피 발광을 기반으로 하는 세포 이미지는 도 14B 및 도 14C에 도시되었다. 도 14D는 도 14B 및 도 14B에서 얻은 형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇)을 기반으로 하고, ImagePro Plus 소프트웨어를 사용한 모조 착색된 비율척도 이미지이다. 평균 형광비율은 약 2.17이다.

도 4B에 도시된 바와 같이, 형광 강도 비율과 점도 간의 직선형관계에서 헬라세포에 있는 미토콘드리아의 평균 점도는 약 62.8 cP로 측정되었다. 모넨신 및 니스타틴으로 처리시, 이온 밸런스의 중단을 통해 미토콘드리아 스웰링의 원인이 될 수 있다. 도 14D의 비율척도 이미지는 분명히 향상된 비율을 나타낸다(도 15E, 15F 및 도 16-19).

형광 강도 비율(I₅₁₆/I₄₂₇)값은 각각 모넨신 및 니스타틴으로 처리시 90.5 및 109 cP에 해당하는 2.44 ± 0.50 및 2.62 ± 0.48인 것을 확인하였다.

이러한 결과는 이온 투과 담체가 처리된 미토콘드리아의 점도 증가는 이전의 연구결과와 동일하고, 이러한 이온 투과 담체는 초미세구조 변화 또는 미토콘드리아의 스웰링 또는 미토콘드리아 신진대사의 대규모 변경을 유도할 수 있음을 나타낸다.

시험예 4. [화학식 1] 화합물의 형광 수명이미지 측정

도 14에 도시된 바와 같이 미토콘드리아 점도에 대한 비율척도 측정의 결과를 정당화하기 위하여, 형광 수명이미지(FLIM) 실험이 도 15A에 도시된 바와 같이 수행되었다.

헬라세포에서 [화학식 1] 화합물의 미토콘드리아 형광 수명은 도 4D에 도시된 바와 같이 직선형에 따라 약 67.5 cP의 점도를 가르키는 약 1.4 ns로 측정된다. 또한, 모넨신 및 니스타틴으로 처리시 미토콘드리아에 있는 [화학식 1] 화합물의 형광수명에 대하여 유사한 향상이 관찰되었다(도 15B 및 도 15C). 상기 형광수명은 보고된 미토콘드리아 점도(황소개구리 심근 세포에서 54 ± 9 cP)와 비교될 수 있는 결과로 각각 약 80.8 cP(B) 및 112 cP(C)의 점도 값에 해당하는 약 1.55 ns(도 15B, 모넨신) 및 1.90 ns (도 15C, 니스타틴)이다.

[화학식 1] 화합물이 두 가지 다른 방법(예컨대, 형광 비율척도 또는 형광 수명이미지)에 의하여 살아있는 세포에서 세포 사멸을 담당하는 미토콘드리아 점도를 측정할 수 있는지 확인하였다.

본 발명에 따른 [화학식 1] 화합물은 형광 비율척도 이미지뿐만 아니라 높은 정확성 및 신뢰성의 형광 수명이미지(FLIM)에 의하여 미토콘드리아 점도를 센싱할 수 있다.

하기 [반응식 11]은 형광 비율척도 이미지 및 형광 수명이미지(FLIM)에 대하여 헬라세포에서 미토콘드리아 점도에 대한 [화학식 1] 화합물의 센싱 메카니즘을 요약한 것이다.

[반응식 11]

[화학식 1] 화합물은 형광물질 부분에서 약한 발광을 보이고, 보디피 발광은 페닐과 보디피 유닛 사이의 C-C 결합의 빠른 회전으로 ?칭된다(반응식 11의 왼쪽 그림). 또한, 모넨신 및/또는 니스타틴으로 처리시, 초미세구조 변화 또는 스웰링을 겪음으로써 점도 증가가 유도되어 CC 결합 회전 속도가 느려지며, 이에 따라 보디피에서 형광이 강화된다.

시험예 5. 비교예에서 제조된 화합물들의 특성 측정

도 20은 (A) 메탄올에서 [화학식 2] 화합물의 표준화된 흡수 및 형광 스펙트럼이고, (B) 다른 용매에서 [화학식 2] 화합물(1.0 μM)의 형광 반응을 나타낸 스펙트럼이다; 330 nm에서 여기되고 슬릿 폭은 3/5이다.

[화학식 2] 화합물은 두 개의 다른 흡수 및 방출 밴드를 보여주고, Gaussian 09 소프트웨어37을 사용하여 이론적인 계산에 의해 결정된 쿠마린 및 보디피 잔기에 의해 주로 기여한다(도 20A). 메탄올에서, 쿠마린 및 보디피 부분의 발광은 각각 427 및 516 nm이다.

발광 밴드가 다양한 용매에서 상대적으로 변경되지 않았지만, 글리세롤 매체에서는 변경되는 것으로 나타났다(도 20B).

하기 [표 1]은 다양한 점도와 용매에서 [화학식 2] 화합물 내지 [화학식 4] 화합물의 형광 양자 수율을 나타낸 것이다.

용매	ε^a	η/cp^b	Φ_f ^c
			[화학식2]		[화학식3]		[화학식4]
			쿠마린	보디피	쿠마린	보디피	보디피
Dioxane	2.2	1.54	0.0084	0.018	0.01	0.41	0.029
THF	7.6	0.53	0.0086	0.0095	0.0093	0.40	0.023
DCM	9.08	0.43	0.0061	0.013	0.0068	0.445	0.029
Acetone	20.7	0.32	0.0073	0.0061	0.0097	0.33	0.015
EtOH	24.3	1.20	0.0079	0.011	0.01	0.43	0.022
MeOH	32.63	0.60	0.008	0.0077	0.01	0.39	0.018
MeCN	37.5	0.37	0.0073	0.0075	0.0086	0.32	0.015
DMSO	48.9	2.24	0.018	0.0083	0.01	0.41	0.04
Glycerol	42.5	945.35	0.012	0.40	0.013	0.675	0.62
^a는 용매의 유전상수; ^b는 20 ℃에서 용매의 점도; ^c는 참고 표준으로 Rhodamine B (Фs= 0.49 in methanol)와 상이한 용매에서 화합물의 형광양자수율임.

위 표 1에 나타낸 바와 같이, [화학식 2] 화합물의 양자 수율은 낮은 점도 매체, 용매 극성(예컨대, 메탄올에서 η = 0.60 cP, ε = 32.63)에 관계없이 0.02보다 낮다. 점성 글리세롤(η = 945.35 cP, ε = 42.5)에서, 화합물은 높은 형광을 보이며, 0.40의 양자수율을 나타낸다.

또한, 테트라메틸 잔기를 포함하는 [화학식 3] 화합물의 양자 수율은 용매 점도에 관계없이 모두 0.3이상이다.

이러한 결과는 보디피 및 페닐 유닛간의 C-C 결합의 점도-의존 회전에 기인하며, 여기서 C-C 결합을 통한 회전은 글리세롤과 같은 점도가 높은 용매의 존재에서 제한된다. 또한, 여기된 에너지는 회전하는 동안 비방사 에너지의 소모없이 발광을 위하여 남겨진다.

[화학식 3] 화합물에서, 회전운동의 이러한 제한은 용매 점도에 관계없이 강한 발광을 초래하여 보디피로 강요된다. 또한, 동물에 적용하기 위하여 이광자 흡수 특성과 30 GM 이광자 단면(740 nm in 50:50 v/v 메탄올-글리세롤)을 가지는 [화학식 2] 화합물에서 쿠마린 잔기가 중요하다.

-양자계산

모든 양자-화학 계산은 Gaussian 09 스위트를 사용하며, Han 및 Peng의 연구에 이용된 매개변수를 사용하여 수행하였다.

염료의 형상 최적화는 Lee-Yang-Parr 기울기 보정 상관관계 기능(B3-LYP 기능) 및 6-31G **기초 세트로 Becke’s 3개의 매개변수 하이브리드 교환기능과 함께 밀도기능이론(DFT)을 사용하여 수행하였으며, 결합각/각도/이면각에 아무런 제약이 계산에 적용되지 않고 모든 원자를 자유롭게 최대한 활용하였다.

전자전이 에너지 및 해당 진동자 강도는 B3LYP/6-31G ** 레벨에서 시간에 따른 밀도 함수이론(TD-DFT)으로 계산된다.

-흡수 및 형광 양자 수율 측정

흡수 스펙트럼은 Lamda LS35 분광 광도계로 측정되며, 형광 스펙트럼은 FP-6500(Jasco, Japan) 분광 광도계로 수득하였다.

상대적 형광 양자 수율은 standard9와 같은 Rhodamine B로 나타내고 다음 수학식을 이용하여 계산된다:

[수학식]

여기서, Ф은 양자 수율이며, F는 보정된 발광 스펙트럼하에서 통합 영역이고; A는 여기 파장에서의 흡광도이며; λex는 여기 파장이고; n은 용액의 굴절율(용액의 낮은 농도(10^-7-10^-8 mol/L)로 인하여 용액의 굴절율은 용매들로 대체된다)이며; x 및 s는 각각 표준을 참조한다.

-점도측정, 형광 스펙트럼 측정 및 형광 수명 감지

용매는 다른 비율로 메탄올-글리세롤 및 탈이온수-글리세롤 시스템을 혼합하여 얻는다. 측정은 NDJ-7 회전 점도계로 수행하고, 점도 값이 기록된다.

[화학식 1] 화합물 내지 [화학식 4] 화합물의 상이한 점도 용액은 염료(1.0 μM)의 최종 농도를 얻기 위하여 10 ㎖의 용매 혼합물(메탄올-글리세롤 및 탈이온수-글리세롤 시스템)을 스톡 용액(1.0 mM)에 첨가하여 제조된다.

용액은 기포를 제거하기 위하여 5분 동안 초음파 처리하며, 일정한 온도에서 1시간 동안 방치 후, 용액은 UV분광 광도계 및 형광 광도계로 측정된다.

플루오 시간(Fluo Time) 200 수명 플루오미터(fluometer)는 375 nm에서 여기 파장 및 516 nm에서 검출로 화합물의 형광 수명을 얻기 위하여 사용된다.

-세포 배양 및 이미지

헬라세포(Hela cells)는 10% FCS(Invitrogen)으로 보강된 DEME(Invitrogen)에서 배양된다.

이미지 촬영하기 전, 세포는 24-웰 평평한 접시에 씨드되며, 다음날 세포는 5% CO₂하 37 ℃에서 5시간 동안 5.0 μ염료로 배양되고, PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하였다.

헬라세포주는 실시예 및 비교예에 따라 제조된 화합물로 배양되고, 100 × 대물렌즈가 구비된 Leica TCS-SP2 공초점 형광 현미경으로 관찰되었다. 그 후 헬라세포에서 상기 화합물의 형광 강도 및 형광 수명은 TCS-SP2 공초점 형광 현미경 및 FLIM 장비로 관찰되었다.

-형광 수명이미지에 대한 실험 정보

형광 수명이미지(FLIM)는 60x 대물렌즈가 구비된 전도형 스캔 공초점 현미경(MicroTime-200, Picoquant, Germany)을 사용하여 실시하며(NA = 1.2), 싱글모드 펄스 다이오드 레이저(반최대에서 전체 폭으로 ~240 ps의 펄스 폭을 갖는 375 nm 및 ~5 μW의 평균 전력)는 여기원으로 사용된다.

디클로익 미러(Z375RDC, AHF), 롱 패스 필터(HQ405lp, AHF), 50 μm 핀홀, 520 ± 5 nm의 밴드 통과 필터 및 애벌랜치(avalanche) 포토다이오드 검출기(PDM series, MPD)는 세포로부터 방출을 수집하는데 사용되었다. FLIM 측정은 각 샘플에 대해 여러번 수행한다.

시간분해 형광감쇠곡선은 FLIM 이미지로부터 얻으며, 형광 수명은 SymPhoTime 소프트웨어(ver. 5.1.3)를 사용하여 적당한 비선형 최소 제곱법에 따라 평가하였다.

두 지수 붕괴 모델;

여기서 I(t)은 시간-의존 형광 강도이고, A는 진폭이며, τ는 수명으로 커브 피팅으로 사용된다. 모든 수명 값은

으로 정의되는 진폭 가중 평균 수명,

를 의미한다.

Claims

하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물;
[화학식 1]

.
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함하는 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서;
[화학식 1]

.
제2항에 있어서, 상기 화합물은 세포내 미토콘드리아의 점도를 측정하는 것을 특징으로 하는 세포내 점도 측정용 듀얼 구조 센서.
(a) 피검체로부터 분리된 조직 샘플을 제공하는 단계;
(b) 상기 제공된 샘플에 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 화합물이 첨가된 샘플의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 세포내 미토콘드리아의 점도를 측정하여 질병을 예측 또는 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법;
[화학식 1]
하기 [반응식 1]에 따라 디클로로메탄(DCM)에 [화학식 6]의 화합물을 용해시킨 후 포스겐을 첨가하여 교반한 다음 디이소프로필에틸아민(DIPEA), PPh³ ⁺(CH₂)₂NH₂Br^-및 디클로로메탄(DCM)을 첨가하여 반응함으로써 제조되는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 제조방법;
[반응식 1]

[화학식 6] [화학식 1].
제5항에 있어서, 상기 [화학식 6]의 화합물은 하기 [반응식 2]에 따라 [화학식 7]의 화합물 및 피롤을 질소 분위기하에서 디클로로메탄(DCM)에 용해한 후 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가한 다음 디클로로메탄(DCM)에 용해된 디클로로디시아노-p-벤조퀴논(DDQ)을 첨가하고 BF₃-Et₂O 및 Et₃N을 첨가하여 반응함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법;
[반응식 2]

[화학식 7] [화학식 6].
제6항에 있어서, 상기 [화학식 7]의 화합물은 하기 [반응식 3]에 따라 [화학식 8]의 화합물, 4-포르밀페닐보론산(formylphenylboronic acid), Pd(PPh₃)₄를 혼합한 다음 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 디에톡시메탄을 첨가하여 반응함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법;
[반응식 3]

[화학식 8] [화학식 7].
제7항에 있어서, 상기 [화학식 8]의 화합물은 하기 [반응식 4]에 따라 [화학식 9]의 화합물에 N-브로모숙신이미드(NBS) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 반응함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법;
[반응식 4]

[화학식 9] [화학식 8].
제8항에 있어서, 상기 [화학식 9]의 화합물은 하기 [반응식 5]에 따라 염화아연(ZnCl₂)하에서 [화학식 10]의 화합물에 에틸아세토아세테이트(CH₃COCH₂COOEt) 및 에탄올을 첨가하여 반응함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법;
[반응식 5]

[화학식 10] [화학식 9].
제9항에 있어서, 상기 [화학식 10]의 화합물은 하기 [반응식 6]에 따라 [화학식 11]의 화합물에 요오도에탄(ICH₂CH₃), 탄산칼륨(K₂CO₃) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하여 반응함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법;
[반응식 6]

[화학식 11] [화학식 10].