CN111116573B - 一种双通道下同时检测dna和rna的近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双通道下同时检测dna和rna的近红外荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示；其中，Ar为芳香环或芳香杂环；R1和R2各自独立地为氢、N‑哌嗪、N‑甲基哌嗪、‑NH(CH2)nR3、‑NR3R4，其中n为1～5中任意一个整数，R3和R4各自独立地为氢、C1～5烷基或C1～5卤代烷基；A‑为卤离子、对甲苯磺酸离子。本发明所述荧光探针在双通道下可以在体外和细胞内同时检测DNA和RNA；同时所述荧光探针具有快速合成，近红外发射波长，光稳定性好，检测灵敏度高等特点，便于推广应用。
Figure DDA0002350778850000011

Description

一种双通道下同时检测DNA和RNA的近红外荧光探针及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及DNA和RNA检测技术领域，更具体地，涉及一种双通道下同时检测DNA和RNA的近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
核酸是所有已知生命形式必不可少的组成物质，也是DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的总称，其由核苷酸组成，包括三部分组成单体：5-碳糖，磷酸基和含氮碱基。DNA是研究最为广泛的核酸，通常采用右手螺旋，双螺旋的结构，并由腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)碱基配对组成。与DNA相似，RNA包含A，G和C，但是胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)取代。DNA和RNA在生命过程中都至关重要，通过复制，转录和翻译来存储和转移遗传信息。近些年来，各种分析工具，例如紫外可见吸收光谱，圆二色性(CD)光谱，凝胶电泳，DNA足印测定，粘度测量，等温量热法(ITC)，质谱分析，X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱已用于研究核酸结构及其与小分子的相互作用。但是，大多数这些光谱技术仅能在体外使用，不适合用于体内。
荧光成像技术是一种通过对荧光染料和荧光蛋白的成像来研究分子过程和结构的技术，可以以高空间分辨率无创地观察生物过程，并且在包括生物成像和诊断应用在内的现代活跃研究中发挥着至关重要的作用。荧光探针技术的另一个优点是可以实时监测活细胞中生物大分子的结构重组和生物学功能，具有高时间和空间分辨率。与其他生物分子相比，可用于核酸的荧光探针相对很少，并且受其对核酸的结构和构象变化的选择性和敏感性的限制。
目前已经报道了许多在可见光谱的较低波长区域发射的小分子荧光核酸探针。但是，来自细胞生物分子的自发荧光会导致高背景信号，从而导致可见(蓝色和绿色)区域的较低波长中的高信噪比。因此，对于体内或原位观察，人们通常会选择具有在可见光区域的较长波长中吸收并且在红色或近红外(NIR)区域中发射的小分子荧光探针。同时，生物体中许多生理过程涉及多个信号分子的同时参与，为了了解这些信号分子的功能及其在疾病中的作用机制，发展能够同时研究多个信号分子的荧光探针非常重要。然而，人们在设计荧光探针时倾向于设计选择性针对单个分析物的探针，很少有报道能够成像两种分析物的荧光探针。本发明提供了一种可在双通道下同时检测DNA和RNA的近红外荧光探针(635-700nm)，可有效克服上述缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中缺乏同时检测DNA和RNA的荧光探针的不足，提供一种双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针。本发明所述荧光探针型的发射波长在近红外发射区域，大大减少背景信号，具有良好的光稳定性，灵敏的检测限，并可以在细胞水平同时对DNA和RNA进行检测。
本发明的另一目的在于提供所述双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针，其结构如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002350778830000021
其中，Ar为芳香环或芳香杂环；R1和R2各自独立地为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪、-NH(CH2)nR3、-NR3R4，其中n为1～5中任意一个整数，R3和R4各自独立地为氢、C1～5烷基或C1～5卤代烷基；A-为卤离子、对甲苯磺酸离子。
优选地，所述Ar为
Figure BDA0002350778830000022
Figure BDA0002350778830000023
优选地，当R1为氢时，R2为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪、-NH(CH2)nR3、-NR3R4；当R2为氢时，R1为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪、-NH(CH2)nR3、-NR3R4；其中n为1～5中任意一个整数，R3和R4各自独立地为氢、C1～5烷基或C1～5卤代烷基。
优选地，所述R1和R2各自独立地为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪、-NH(CH2)nR3、-NR3R4，其中n为1～5中任意一个整数，R3和R4各自独立地为氢、甲基、乙基、丙级、丁基、三氟甲基、三氟乙基或三氟丙基。
优选地，所述R1和R2各自独立地为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪、N,N-二甲基、N,N-二乙基、N,N-二丙基、N,N-二三氟甲基、N,N-二三氟乙基或N,N-二三氟丙基。
优选地，所述R1和R2各自独立地为氢、N-哌嗪、N-甲基哌嗪或N,N-二甲基。
优选地，A-为卤离子或CH3COO-。
更优选地，所述荧光探针的结构如以下结构之一所示：
Figure BDA0002350778830000031
本发明同时还保护所述双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针的制备方法，式(Ⅰ)化合物的制备过程包括：
S1.以5-溴-2-甲基苯并噻唑或6-溴-2-甲基苯并噻唑为原料，与R1N-Boc或R2N-Boc反应得到中间体1-1或1-2；
S2.中间体1-1或1-2与卤甲烷反应，得中间体2-1或2-2；
S3.中间体2-1或2-2与芳香醛反应，得中间体3-1或3-2；
S4.中间体3-1或3-2脱去叔丁基，即可得到A-为卤离子的目标化合物；或中间体1-1或1-2与对甲苯磺酸甲酯反应，再按照S3、S4路线即可得到A-为对甲苯磺酸根离子的目标化合物。
其中，中间体1-1、1-2、2-1、2-2、3-1和3-2的结构如下所示：
Figure BDA0002350778830000041
优选地，式(Ⅱ)化合物的制备过程包括：
S1.以2-甲基-beta-萘并噻唑为原料，与卤甲烷反应，得到中间体
Figure BDA0002350778830000042
S2.中间体
Figure BDA0002350778830000043
与芳香醛反应得到最终化合物
Figure BDA0002350778830000044
所述荧光探针在细胞内DNA和/或RNA检测中的应用也在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述荧光探针在双通道下可以在体外和细胞内同时检测DNA和RNA；同时所述荧光探针具有快速合成，近红外发射波长，光稳定性好，检测灵敏度高等特点，便于推广应用。
附图说明
图1为化合物BZ-7分别滴定DNA提取液和RNA提取液的紫外可见吸收光谱。
图2为化合物BZ-7分别滴定DNA提取液和RNA提取液在不同激光波长下的荧光光谱图。
图3为化合物BZ-7在560nm和640nm激发下的激光共聚焦显微成像。
图4为化合物BZ-7在加入DNase I或RNase A后的激光共聚焦显微成像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1化合物BZ-1的合成
(a)将1g 5-溴-2-甲基苯并噻唑和无水的1,4-二氧六环加入耐压管中，在手套箱中氩气条件下加入4.07g N-Boc-哌嗪、3.5g碳酸铯、20mg三二亚苄基丙酮二钯、50mg 2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯，混合物在95℃下加热24h。过滤反应液去除滤渣，滤液用柱层层析法纯化，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷(1：30)，得到浅黄色固体1.28g，即中间体1。
(b)取0.3g中间体1溶于2mL乙腈中，加0.2mL CH3I,在耐压管中70℃条件下加热24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到0.34g浅黄色固体，即中间体2。
Figure BDA0002350778830000051
(c)取2g 4-氟水杨醛于耐压管中，加入1.7mL N-甲基哌嗪，2g碳酸钾和5mL N，N-二甲基甲酰胺，在手套箱中氩气条件下，130℃加热24h。冷却至室温后，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩至少量液体后用柱层层析法纯化，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷(1：10)，得到1.5g黄色油状物，即中间体3。
(d)将1g中间体3溶于30mL无水乙醇中，加入1.44mL丙二酸二乙酯和两滴哌啶，回流温度下反应12h。减压浓缩至少量液体后加15mL冰乙酸和15mL浓盐酸，继续反应12h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1M NaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到0.74g浅绿色固体，即中间体4。
(e)取1mL无水N，N-二甲基甲酰胺，在冰浴和氮气保护下，逐滴加入三氯氧磷(2mL)，搅拌30min，逐滴加入中间体4的溶液中(200mg溶解于0.5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中)，搅拌10min后升高温度至60℃，反应12h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1MNaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到粗品，用柱层层析法纯化，洗脱剂为乙腈/二氯甲烷(1：4),得到130mg红色固体，即中间体5。
Figure BDA0002350778830000061
(f)取0.12g中间体2和0.1g中间体5加入圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇，回流下搅拌24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到0.14g红褐色固体，即中间体6。
(g)取0.14g中间体6溶于盐酸和二氯甲烷的混合溶剂中(盐酸：二氯甲烷为1：3)，室温下搅拌12h。将反应液减压浓缩去除溶剂得到100mg红褐色固体，即中间体7。
Figure BDA0002350778830000062
以中间体2为原料，采用步骤f)和步骤g)同样的方法，将上述4-N-甲基哌嗪-香豆素醛按照表1中的芳香醛进行替换，即可得到化合物BZ-2。采用同样的方法和步骤，用化合物6-溴-2-甲基苯并噻唑替换步骤a)中的5-溴-2-甲基苯并噻唑为原料，与表1中的芳香醛反应，即可得到化合物BZ-3和BZ-4。
实施例2化合物BZ-5的合成
(a)将1.2g 5-溴-2-甲基苯并噻唑和20mL无水的1,4-二氧六环加入耐压管中，在手套箱中氩气条件下加入2.4mL二乙胺、3.5g碳酸铯、120mg三二亚苄基丙酮二钯、60mg 2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯，混合物在95℃下加热24h。过滤反应液去除滤渣，滤液用柱层层析法纯化，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷(1：250)，得到浅黄色固体1.3g，即中间体7。
(b)取500mg中间体7溶于2mL乙腈中，加0.5mL CH3I,在耐压管中70℃条件下加热24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到0.42g浅黄色固体，即中间体8。
(c)取100mg中间体8和70mg N,N-二乙基香豆素醛于圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇，回流下反应24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到65mg红褐色固体，即化合物BZ-5。
Figure BDA0002350778830000071
以中间体8为原料，采用步骤c)同样的方法，将上述N,N-二乙基香豆素醛按照表1中的芳香醛进行替换，即可得到化合物BZ-6。
实施例3化合物BZ-7的合成
(a)取2mL间氨基苯甲醚和24mL 1-溴-3-氯丙烷于三颈烧瓶中，加入10.76g无水碳酸氢铵，N2保护下，140℃加热15h。冷却至室温后，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩至少量液体后加入2mL 5％HI，4mL HCl和10mL H2O，回流下反应24h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1M NaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到1.5g红褐色固体，即中间体9。
(b)取2mL无水N，N-二甲基甲酰胺，在冰浴和氮气保护下，逐滴加入三氯氧磷(4mL)，搅拌30min，逐滴加入中间体9的溶液中(1g中间体9溶解于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺中)，搅拌10min后升高温度至60℃，反应12h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1M NaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到粗品，用柱层层析法纯化，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷(1：60),得到0.9g浅绿色固体，即中间体10。
(c)将0.5g中间体10溶于4mL无水乙醇中，加入0.8mL丙二酸二乙酯和一滴哌啶，回流温度下反应12h。减压浓缩至少量液体后加3mL冰乙酸和3mL浓盐酸，继续反应12h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1M NaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到0.51g红色固体，即中间体11。
(d)取1mL无水N，N-二甲基甲酰胺，在冰浴和氮气保护下，逐滴加入三氯氧磷(2mL)，搅拌30min，逐滴加入中间体11的溶液中(200mg溶解于0.5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中)，搅拌10min后升高温度至60℃，反应12h。冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，加入1MNaOH调PH为5～6，静置一段时间后，有沉淀析出，将反应液抽滤，干燥后得到粗品，用柱层层析法纯化，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷(1：60),得到130mg红色固体，即中间体12。
Figure BDA0002350778830000081
(e)取2-甲基-苯并噻唑1.2g溶于5mL乙腈中，加入1.0mL CH3I，80℃下加热12h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到2.15g白色固体，即中间体13。
Figure BDA0002350778830000082
(f)取100mg中间体13和70mg中间体12于圆底烧瓶中，加入2mL无水乙醇，回流下反应24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到55mg红褐色固体，即化合物BZ-7。
Figure BDA0002350778830000083
参照上述过程，替换上述中间体12，即可得到化合物BZ-8。
实施例4化合物BZ-10的合成
(a)取2-甲基-beta-萘并噻唑1g溶于5mL乙腈中，加入0.6mL CH3I，80℃下加热12h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤三次，真空干燥后得到1.38g白色固体，即中间体14。
(b)取100mg中间体14和100mg N,N-二甲基丙胺-吲哚-3-甲醛于圆底烧瓶中，加入2mL无水乙醇，回流下反应24h。冷却至室温后，反应液减压抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤三次，真空干燥后得到50mg红褐色固体，即化合物BZ-10。
Figure BDA0002350778830000091
参照上述过程，替换上述N,N-二甲基丙胺-吲哚-3-甲醛，即可得到化合物BZ-9。化合物BZ-1～BZ-10的结构、外观和核磁共振氢谱数据如表1所示。
表1化合物BZ-1～BZ-10的结构、外观、氢谱和高分辨质谱数据
Figure BDA0002350778830000092
Figure BDA0002350778830000101
Figure BDA0002350778830000111
性能测试实验
以荧光探针BZ-7为代表，测试BZ-7在溶液中和固定细胞中双通道下同时检测DNA和RNA的能力。
(1)测试荧光探针BZ-7对DNA和RNA的体外识别作用
DNA和RNA为从Hela细胞中提取的总DNA和总RNA，用超微量紫外光谱仪测定浓度。
以化合物BZ-7为例测试，将其用DMSO溶解，配成10mM的储存液，再用Tris-HCl的缓冲液(PH7.4，10mM Tris，100mM KCl)稀释成1uM浓度的荧光探针溶液用于测试。
①向配置好的1uM的荧光探针BZ-7的缓冲溶液中滴加DNA和RNA提取液，随着滴加量的增加，混合液的紫外吸收光谱结果如图1所示。
结果显示：化合物BZ-7的最大吸收峰随着DNA和RNA的加入呈现了红移的趋势，加入DNA后，化合物BZ-7的最大吸收峰出现了10-20nm左右的红移；加入RNA后，化合物BZ-7的最大吸收峰由555nm处红移至610nm左右。
②分别向1uM的化合物BZ-7的工作溶液中滴加DNA和RNA提取液，测定其在激发波长为560nm和激发波长为640nm时的荧光光谱，测定结果如图2所示。
结果显示：激发波长为560nm时，化合物BZ-7对DNA的荧光响应强度高于RNA，且随着滴定浓度的增加，荧光强度逐渐增强；激发波长为640nm时，化合物BZ-7对RNA的荧光响应强度高于DNA，且随着滴定浓度的增加，荧光强度逐渐增强。证明化合物BZ-7在不同通道激发下对DNA和RNA具有不同的荧光响应表现。
(2)测试荧光探针BZ-7对细胞内DNA和RNA的同时检测能力
(1)荧光探针BZ-7对固定细胞中的DNA和RNA的检测
将Hela细胞(人宫颈癌细胞)放在培养基(DMEM培养液和10％胚牛血清)中，放置于条件为37℃、5％CO2和20％O2的培养箱中培养24～48h。用4％多聚甲醛将细胞固定30min，。将处理好的细胞分组用于如下实验：
①取化合物BZ-7的储备液用PBS缓冲液配置成1μM的工作溶液，加入到上述处理好的细胞中，37℃孵育30min，使用激光共聚焦超高分辨显微镜进行成像，将激光波长为561nm和波长640nm两个通道得的荧光信号重叠，得到图3；
从图3可以看出，化合物BZ-7在两个通道下呈现完全不同的成像结果。从图3A中可知，激发波长为561nm时，探针BZ-7的荧光信号主要分布在细胞核。从图3B中可知激发波长为640nm时，探针BZ-7的荧光信号主要分布在细胞质。图3C为可见光下的结果。图3D为两个激光通道和可见光叠加的结果。
②将固定细胞用0.2％Triton-100孵育30min，再加入200units mL-1的DNase I并在37℃孵育3h后，用PBS洗三次，最后加入1μM荧光探针BZ-7的工作溶液37℃孵育30min，PBS洗三次后进行荧光成像，结果见图4B；
③将固定细胞用0.2％Triton-100孵育30min，再加入200units mL-1的RNase A并在37℃孵育3h后，用PBS洗三次，最后加入1μM荧光探针BZ-7的工作溶液37℃孵育30min，PBS洗三次后进行荧光成像，结果见图4C；
结果显示：由图4B可知，DNase I处理后，激发波长为560nm通道下探针BZ-7的荧光信号完全消失，而激发波长为640nm通道下探针BZ-7的荧光信号几乎不受影响，说明探针BZ-7在激发波长为560nm通道下成像的是DNA。由图4C可知，RNase A处理后，激发波长为640nm通道下探针BZ-7的荧光信号完全消失，而激发波长为560nm通道下探针BZ-7的荧光信号几乎不受影响，说明探针BZ-7在激发波长为640nm通道下成像的是RNA。以上结果说本发明所述探针在细胞内双通道下能同时检测DNA和RNA。
上述实验结果表明本发明所述荧光探针具有在双通道下同时检测DNA和RNA的性质，并且具有近红外区域的发射波长。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种双通道下细胞内同时检测DNA和RNA的荧光探针，其特征在于，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure 85960DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，Ar为
Figure 396856DEST_PATH_IMAGE002
；R1和R2各自独立地为氢；A- 为碘离子。
2.权利要求1所述荧光探针在制备细胞内DNA和/或RNA检测试剂中的应用。
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