CN112174991B - 近红外区第二窗口激发和发射的荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体为近红外区第二窗口激发和发射的荧光染料及其制备方法和应用。本发明荧光染料是具有THPP通式结构的有机小分子双硼二吡咯荧光染料；其合成方法包括：由连有取代基的噻吩腈与丁二酸二异丙酯反应制得化合物I(吡咯并吡咯二酮)；由化合物I与活泼亚甲基缩合剂缩合得到化合物II；由化合物II和硼配体反应生成化合物III即THPP系列染料；本发明的荧光染料具有高光稳定性和化学稳定性，可用于制备生物体血管和脏器成像剂，包括制备脑部和身体血管以及深层组织脏器的造影剂，实现深层器官的精准监控。

Description

近红外区第二窗口激发和发射的荧光染料及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一类有机小分子荧光染料及其制备方法和应用。

背景技术

生物医学活体成像可提供大量生理和病理的相关信息，而这些信息难以在细胞和组织水平上通过体外或离体成像方式获得。人体疾病的动物模型体内成像可以作为基础研究与临床转化的重要纽带，同时临床成像是被医院用于诊断、监测疾病、手术导航以及疗效评估的常用方法。基础科学的新发现不仅激励了新的临床成像方式的开发，比如计算机断层扫描(CT)，磁共振成像(MRI)，正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)以及超声波扫描仪等，而且促进了探针的开发，如用于CT的碘/钡基造影剂，用于磁共振成像的Ga基试剂和用于正电子发射断层扫描的氟脱氧葡萄糖(FDG)/氟胸苷的造影剂(FLT)放射性代谢指示剂等。荧光成像在医学诊断，药物递送和手术导航中尤其重要，特别是对于最新的近红外区第二窗口(900-1700nm)，荧光散射和组织自发荧光少，因此在深层组织中可以实现具有高信噪比和高时空分辨率的成像。然而与无机探针相比，迄今为止近红外II区有机荧光探针的应用仍然因其荧光强度低而受到局限，深层内脏的荧光成像鲜有报道。影响荧光染料发光强度的主要因素是摩尔消光系数和荧光量子产率。近期的研究大多集中于给体-受体-给体结构分子和菁类(多甲川类)染料分子。菁类染料具有较高的摩尔消光系数(～10⁵L*mol^-1*cm^-1)，与给体-受体-给体分子体系相比高一个数量级，在荧光量子产率接近的情况下，摩尔消光系数越高，成像效果也越好。但是，菁类染料在极性溶剂特别是在水溶液中会出现吸收峰“扁平化”甚至消失的现象，这使得其在活体成像的应用受到限制。此外，菁类染料由于其分子内甲川链上电荷的影响，其光稳定性和化学稳定性等都较差，这极大限制了其在成像领域的应用，因此目前为止，还未报道高光稳定性、化学稳定性和高摩尔消光系数的近红外区第二窗口的有机染料实现活体脏器成像的跟踪。

发明内容

本发明目的在于提供一种合成路线简单、生物相容性好，光稳定性和化学稳定性高的近红外第二窗口激发和发射的荧光染料及其制备方法，以及在制备血管和脏器成像造影剂中的应用。

本发明提供的近红外第二窗口激发和发射的荧光染料，是一种有机小分子材料，具体为双硼二吡咯荧光染料，记为THPP染料，包括THPP-A、THPP-B和THPP-C：

(1)本发明荧光染料的核心结构是在前人研究的基础上扩展创新设计出一类新的双硼二吡咯类染料化合物结构，并完成了合成路线的探讨研究，该合成路线和化合物结构未见文献报道，具体合成路线是为氰基噻吩缩合生成吡咯并吡咯二酮，再与氰甲基芳环缩合后与硼配体配位；

(2)本发明针对现有染料，如菁类染料光稳定性和化学稳定性差，吸收易淬灭等问题，合成了能同时对血管和脏器等部位稳定清晰检测的荧光染料。该染料实现了对小鼠头部和身体血管的成像；

(3)本发明合成了一系列高摩尔消光系数、抗吸收淬灭的荧光染料，荧光强度相比于其他染料有明显提高，因此可用于深层脏器如心脏、肺脏、肾脏等的高分辨成像。

本发明首先提供一种高化学稳定性和光稳定性的近红外区第二窗口激发和发射的荧光染料，其化合物结构通式如下：

其中：

R₁和R₂各自独立选自H、F、Cl、Br和I等类卤素原子，或者OC_1-20、NH(C_1-20)、N(C_1-20)₂等长烷氧(氨)基链，亦或者苯、噻吩、吡咯、呋喃、吡啶等芳环及其衍生物；

R₃、R₄、R₉和R₁₀各自独立选自H、F、Cl、Br和I等类卤素原，C_1-20烷基或者乙撑二氧噻吩等官能团；

R₅、R₆、R₇和R₈各自独立选自F、C_1-20烷基或者Ph等官能团；

R₁₁、R₁₂各自独立选自H、F、Cl、Br和I等类卤素原子；

R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇、R₁₈、R₁₉、R₂₀各自独立选自H、F、Cl、Br和I等类卤素原子，或者苯、噻吩、吡咯、呋喃、吡啶等芳环及其衍生物。

本发明中使用相关术语“烷基”包括直链和支链烷基；术语“类卤素”包括氰基、硫氰基和异硫氰基。

本发明的染料的母体结构上取代基的作用，一方面是调节染料吸收和发射光谱，另一方面是为了调整染料在溶剂中的溶解性。

通过优化后的性能较为优秀的分子的结构如下。

本发明提供的上述化合物的制备方法，具体步骤为：

(1)连有取代基R₁、R₃和R₉或R₁、R₃和R₉的噻吩腈与丁二酸二异丙酯反应制得化合物I(吡咯并吡咯二酮)，反应温度100～150℃，反应时间为8～24小时，反应溶剂选择叔戊醇或异戊醇，碱性化合物为金属钠与溶剂反应生成醇钠或者叔丁醇钾，闭环缩合剂为丁二酸二乙酯、丁二酸二丙酯、丁二酸二异丙酯和丁二酸二正丁酯；噻吩腈和闭环缩合剂投料摩尔比为2:1～2.5:1；其反应路线为：

(2)化合物I与活泼亚甲基缩合剂缩合得到化合物II，其中，反应溶剂为甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯或三甲苯，反应温度100～120℃，反应时间为3～10小时，反应用酰胺活化剂为三氯氧磷，亚甲基缩合剂为氰甲基吡啶、氰甲基喹啉或氰甲基喹喔啉，化合物I和亚甲基缩合剂投料摩尔比为1:2.5～1:4；其反应路线为：

(3)化合物II和硼配体反应生成化合物III(THPP系列染料)；其中，反应溶剂为氯萘，甲苯或者二甲苯，反应温度100～200℃，反应时间为1～5小时，反应用硼配体为三氟化硼乙醚、二烷基硼氯硼、二苯基氯硼或四苯基硼酐，化合物II和硼配体投料摩尔比为1:3～1:5；反应路线为：

本发明制备得到有机小分子荧光染料为双硼二吡咯荧光染料，记为THPP染料。THPP染料可用于制备生物体血管和脏器成像造影剂，例如制备脑部和身体血管以及深层组织脏器的造影剂，实现深层器官的精准监控。

本发明的THPP染料，在有机相中如二氯甲烷四氢呋喃等，最大吸收峰位于900nm处，用808nm的激光器激发，能够观察到920nm处的荧光发射峰(图1)；在F127制备的胶束中，吸收最大吸收峰位于970nm处，用808nm的激光器激发，能够观察到998nm处的荧光发射峰；在固体状态下，用808nm的激光器激发，能够观察到1152nm处的荧光发射峰(图2)。

本发明的THPP染料，通过薄膜水化法将THPP包裹于F127胶束溶于纯水溶液中，在超高功率980nm飞秒激光器的激发下五小时内稳定不变(图3)。

本发明的THPP染料，在980nm激光器激发下，通过薄膜水化法将THPP包裹于F127胶束溶于纯水溶液中，在不同活性氧物种和活性氮物种中具有极高的稳定性(图4)。

本发明的THPP染料，在正己烷中溶液中的荧光量子产率为3.％(表1)，在四氢呋喃和水混合溶液中为3.5％。

附图说明

图1为808nm激发，染料THPP的吸收和荧光发射谱图。

图2为808nm激发，染料THPP胶束和固体的吸收和荧光发射谱图。

图3为980nm飞秒激光器激发，染料THPP胶束光稳定性实验。

图4为980nm激发，染料THPP胶束化学稳定性。

图5为980nm激发，染料THPP胶束脑部和身体血管成像。

图6为980nm激发，染料THPP胶束深层器官组织成像。

具体实施方式

实施例1，THPP染料的制备。具体步骤如下。

(1)化合物T2的合成

在氩气保护的0℃环境下，向DMF(80mL)溶剂中缓慢加入三氯氧磷(35mL)制备Vilsmeier-Haack试剂，反应体系保持0℃并持续搅拌1h，再逐滴加入溴代己基噻吩(T1,4.94g,20mmol)。反应混合物持续搅拌并升温至90℃。10h后，体系缓慢冷却至室温，向反应液中加入500mL冰水淬灭反应，通过加入饱和氢氧化钠溶液中和反应体系，并用二氯甲烷萃取三次。合并有机相用盐水洗涤，有机相经过无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩得到粗产物T2。剩余物通过硅胶柱层析石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))得到黄色液体4.67g(85％)。

(2)化合物T3和T4的合成

向无水乙腈溶剂中依次加入T2(2.74g,10mmol)三乙胺(1.52g,15mmol)以及盐酸羟胺(1.04g,15mmol)，反应体系加热至回流并搅拌10h得到粗产物T3。向反应体系中加入邻苯二甲酸酐(4.5g,30mmol)，整个反应体系保持回流5h。反应完毕后冷却至室温，用5％的氨水中和，并用正己烷萃取三次。合并有机相并用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩得到粗产物T4。剩余物通过硅胶柱层析石油醚-二氯甲烷(3:1(v/v))得到黄色液体2.17g(80％)。

(3)化合物1的合成

在氩气保护下，向溶解了T4(2.72g,10mmol)和三苯胺硼酸(4.5g,15mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中依次加入2mol/L碳酸钾溶液(100mL)，四(三苯基膦)钯(0.39g,0.35mmol)催化剂，并加热回流12h。反应完毕后，反应混合物倒入盐水并用二氯甲烷萃取三次。收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到粗产物1。剩余物通过硅胶柱层析石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))得到黄色固体3.58g(82％)。

(4)化合物3的合成

在氩气保护下，向叔丁醇(25mL)中加入金属钠(0.35g,15mmol，易制爆)并加热回流8h。向反应体系中一次性加入化合物1(2.18g,5mmol)，再通过蠕动泵缓慢注射丁二酸二异丙酯(0.47g,2.3mmol)约3h，注射完毕后反应物继续搅拌回流过夜。向反应体系中加入甲醇(10mL)和甲酸(2mL)混合溶液进行淬灭并抽滤。黑色滤饼通过甲醇反复洗涤直至变为紫色。剩余物固体通过真空干燥箱干燥得到0.71g(31％)粗产物3(吡咯并吡咯二酮，DPP)。DPP溶解性较差因此不做进一步提纯。

(5)化合物T6和4的合成

向四氢呋喃(100mL)中缓慢加入氰化钠(57％in mineral oil,10.7g,254mmol)，搅拌20min后缓慢加入氰基乙酸叔丁酯(28.3g,200mmol)并在室温条件下搅拌1h。反应完成后，向体系中加入化合物T5(29.7g,180mmol)并搅拌过夜至大量固体析出。反应液倒入水和乙酸的混合溶液中和，并用二氯甲烷萃取三次，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到黄色固体粗产物T6，用石油醚洗涤粗产物并通过真空干燥得到纯度较高的T6。室温下，化合物T6溶解于二氯甲烷(120mL)中，氩气保护下向溶液中逐滴加入三氟乙酸(60mL)并搅拌10h。反应通过薄层层析石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))跟踪直到化合物T6反应完全。反应完全后，混合物用碳酸钠溶液中和并用饱和食盐水洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到粗产物4。剩余物通过硅胶柱层析石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))得到淡黄色固体6.08g(20％)。

(6)化合物5的合成

氩气保护下，化合物3(0.91g 1mmol)和化合物4(0.51g,3mmol)溶解于甲苯(50mL)溶剂中并加热至回流。回流30min后加入三氯氧磷(0.15g,10mmol)，并继续回流6h。反应完毕后体系冷却至室温，通过旋蒸除去甲苯和过量三氯氧磷。剩余物用甲醇超声洗涤并过滤直至滤液无色，滤饼通过硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(100:1(v/v))得到黑色固体0.25g(20％)。

(7)化合物T8和6的合成

化合物T7(5g,22.2mmol)溶解于甲醇(80mL)和丙酮(80mL)的混合溶剂中，并加入稀盐酸(1mol/L,60mL)搅拌三小时。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤。收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到化合物T8。化合物T8进一步加热至150℃并抽真空5h，冷却后得到化合物6米色固体3.3g(85％)。

(8)化合物THPP的合成

氩气保护下，化合物5(0.13g,0.1mmol)和化合物6(0.35g,1mmol)溶解于氯萘(30mL)并加热至200℃持续1h，薄层层析石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))继续跟踪反应过程直至化合物5反应完全。反应完全后体系冷却至室温，混合溶液直接硅胶柱层析，石油醚洗脱直至氯萘除尽，再用石油醚-二氯甲烷(1:1(v/v))洗脱，得到化合物THPP棕色固体0.03g(19％)。

实施例2，双硼二吡咯荧光染料THPP在小鼠血管成像中的应用。具体步骤如下：

将小鼠麻醉后，尾静脉注射200μL浓度为100μmol/L的THPP胶束的生理盐水溶液，用980nm外置激光器照射小鼠脑部或者身体，激光器功率50mW/cm²,曝光时间50ms(参见图3)。

实施例3，双硼二吡咯荧光染料THPP在小鼠器官成像中的应用，具体步骤如下：

将小鼠麻醉后，尾静脉注射200μL浓度为200μmol/L的THPP胶束的生理盐水溶液，用980nm外置激光器照射小鼠肺部或者心脏，激光器功率50mW/cm²,曝光时间50ms(参见图4)。

表1.THPP染料在不同溶剂和状态中的光学性质

[a]相对荧光量子产率计算方法以IR-26化合物在1,2-二氯乙烷(0.05％)为标准。

Claims (3)

1.一种近红外区第二窗口激发和发射的荧光染料，其特征在于，为双硼二吡咯荧光染料，记为THPP染料，其结构式为：

。

2.如权利要求1所述的荧光染料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）化合物T2的合成

在氩气保护的0 ℃环境下，向80 mL DMF溶剂中缓慢加入35 mL三氯氧磷制备Vilsmeier-Haack试剂，反应体系保持0 ℃并持续搅拌1h，再逐滴加入4.94 g,20 mmol的溴代己基噻吩；反应混合物持续搅拌并升温至90 ℃，10h后，体系缓慢冷却至室温，向反应液中加入500 mL冰水淬灭反应，通过加入饱和氢氧化钠溶液中和反应体系，并用二氯甲烷萃取三次；合并有机相用盐水洗涤，有机相经过无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩得到粗产物T2；剩余物通过硅胶柱层析体积比1:1的石油醚-二氯甲烷得到黄色液体4.67g；

；

（2）化合物T3和T4的合成

向无水乙腈溶剂中依次加入2.74 g,10 mmol T2，1.52 g, 15 mmol 三乙胺以及1.04g, 15 mmol盐酸羟胺，反应体系加热至回流并搅拌10h得到粗产物T3；向反应体系中加入4.5 g, 30 mmol邻苯二甲酸酐，整个反应体系保持回流5h；反应完毕后冷却至室温，用5%的氨水中和，并用正己烷萃取三次；合并有机相并用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩得到粗产物T4；剩余物通过硅胶柱层析体积比3:1的石油醚-二氯甲烷得到黄色液体2.17g；

；

（3）化合物1的合成

在氩气保护下，向溶解了2.72 g, 10 mmol T4和4.5 g, 15 mmol三苯胺硼酸的100 mL四氢呋喃溶液中依次加入100mL ,2mol/L碳酸钾溶液，0.39 g, 0.35 mmol四（三苯基膦）钯催化剂，并加热回流12h；反应完毕后，反应混合物倒入盐水并用二氯甲烷萃取三次；收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到粗产物1；剩余物通过硅胶柱层析体积比1:1石油醚-二氯甲烷得到黄色固体3.58g；

；

（4）化合物3的合成

在氩气保护下，向25mL叔丁醇中加入0.35 g, 15 mmol金属钠，并加热回流8 h；向反应体系中一次性加入2.18 g, 5 mmol化合物1，再通过蠕动泵缓慢注射0.47 g, 2.3 mmol丁二酸二异丙酯3h，注射完毕后反应物继续搅拌回流过夜；向反应体系中加入10mL甲醇和2mL甲酸混合溶液进行淬灭并抽滤；黑色滤饼通过甲醇反复洗涤直至变为紫色；剩余物固体通过真空干燥箱干燥得到0.71g粗产物3，即吡咯并吡咯二酮，记为DPP；

；

（5）化合物T6和4的合成

向100mL四氢呋喃中缓慢加入57% in mineral oil, 10.7 g, 254 mmol氰化钠，搅拌20min后缓慢加入28.3 g, 200 mmol氰基乙酸叔丁酯，并在室温条件下搅拌1h；反应完成后，向体系中加入29.7 g, 180 mmol化合物T5，并搅拌过夜至大量固体析出；反应液倒入水和乙酸的混合溶液中和，并用二氯甲烷萃取三次，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到黄色固体粗产物T6，用石油醚洗涤粗产物并通过真空干燥得到纯度较高的T6；室温下，化合物T6溶解于120mL二氯甲烷中，氩气保护下向溶液中逐滴加入60mL三氟乙酸，并搅拌10h；反应通过薄层层析体积比1:1的石油醚-二氯甲烷跟踪直到化合物T6反应完全；反应完全后，混合物用碳酸钠溶液中和并用饱和食盐水洗涤，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到粗产物4；剩余物通过硅胶柱层析体积比1:1的石油醚-二氯甲烷得到淡黄色固体6.08g；

；

（6）化合物5的合成

氩气保护下，0.91 g 1 mmol化合物3和0.51 g, 3 mmol化合物4溶解于50mL甲苯溶剂中并加热至回流；回流30min后加入0.15 g, 10 mmol三氯氧磷，并继续回流6h；反应完毕后体系冷却至室温，通过旋蒸除去甲苯和过量三氯氧磷；剩余物用甲醇超声洗涤并过滤直至滤液无色，滤饼通过硅胶柱层析体积比100:1的二氯甲烷-甲醇得到黑色固体0.25g；

；

（7）化合物T8和6的合成

5 g, 22.2 mmol化合物T7 溶解于80 mL甲醇和80 mL丙酮的混合溶剂中，并加入1mol/L, 60 mL稀盐酸搅拌三小时；反应混合物用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤；收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到化合物T8；化合物T8进一步加热至150 ℃并抽真空5h，冷却后得到化合物6米色固体3.3g；

；

（8）化合物THPP的合成

氩气保护下，0.13 g, 0.1 mmol化合物5和化合物0.35 g, 1 mmol 6溶解于30 mL氯萘并加热至200℃持续1h，薄层层析体积比1:1的石油醚-二氯甲烷继续跟踪反应过程直至化合物5反应完全；反应完全后体系冷却至室温，混合溶液直接硅胶柱层析，石油醚洗脱直至氯萘除尽，再用体积比1:1的石油醚-二氯甲烷洗脱，得到化合物THPP棕色固体0.03 g；

。

3.如权利要求1所述的荧光染料在制备生物体血管和脏器成像剂中的应用。

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