CN115925664B

CN115925664B - 一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN115925664B
Application number: CN202310016260.7A
Authority: CN
Inventors: 刘超; 鲁朝霞; 孙会; 陈家树; 孙金月; 张静; 孙书涛
Original assignee: Shandong Huatai Nutrition And Health Industry Technology Research Institute Co ltd
Current assignee: Shandong Huatai Nutrition And Health Industry Technology Research Institute Co ltd
Priority date: 2023-01-06
Filing date: 2023-01-06
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2043-01-06
Also published as: CN115925664A

Abstract

本发明属于特异性荧光检测技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针及其制备方法、应用。该近红外荧光探针的结构式如下：

。本发明制备的探针分子有效地降低了自吸收，且最大发射波长位于近红外区，有效地减少了荧光成像中的背景荧光，稳定性好，在酸性、中性、碱性等宽pH范围内荧光强度稳定；进行应用后，活细胞和小鼠染色效果良好，染色时间短，染色效率高。本发明提供的制备方法，合成步骤相对简单，产率较高，容易纯化。

Description

一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于特异性荧光检测技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针及其制备方法、应用。

背景技术

目前，荧光成像技术已经发展成为动态监控活细胞及活体中生物分子事件的最重要手段。新型荧光成像传感器的发展极大地促进了细胞生物学以及医学诊断成像等的进步。

荧光分析技术因其操作简单、不破坏样品、瞬时响应、良好的时空分辨率、高灵敏度和选择性以及实时检测和成像而受到了广泛的关注。然而，大多数荧光染料，如罗丹明、荧光素、花菁和恶嗪，表现出较小的Stokes位移。通过缩小HOMO−LUMO间隙，人们确实观察到了红移发射，但不可预测的Stokes位移变化。激发光谱和发射光谱之间的干扰会导致生物样品的信噪比较差和自猝灭。因此，新一代的荧光染料需要一个大的斯托克斯位移来实现精确的成像和精确的传感。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针，该探针具有近红外最大发射波长(Em>810 nm)，并且拥有极大的斯托克斯位移(>290 nm)。

本发明还提供了一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针的制备方法。

本发明的另一目的为提供了上述近红外荧光探针在细胞染色中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针，其结构式如下：

。

本发明还提供了上述近红外荧光探针的制备方法，制备路线为：

。

进一步的，本发明提供的制备方法具体包括以下步骤：

（1）中间体PBT的合成：将4-碘酚溶解在DMF溶液中，得4-碘酚溶液，然后加入丙烯醛二乙基乙醛、nBu₄NOAc、K₂CO₃、KCl和Pd(OAc)₂；将混合物搅拌条件下反应后冷却至室温，缓慢加入2 N盐酸，用乙酸乙酯提取混合物后干燥、减压浓缩纯化，得到中间体PBT；

（2）化合物2的合成：NaH溶解于四氢呋喃得NaH溶液，加入2-羟基苯乙酮和乙酸乙酯的混合溶液中；再次加入四氢呋喃，回流加热；反应完成后，将混合物冷却到室温，加水稀释，调节pH ，用乙酸乙酯萃取；有机层用1N盐酸洗涤，浓缩干燥；粗产物经纯化，得到化合物2；

（3）化合物3的合成：化合物2用醋酸和硫酸溶解得混合物，将混合物通过回流加热，然后倒入冰水中，调节pH，然后用二氯甲烷萃取；萃取后的有机层进行一次洗涤、二次洗涤，浓缩至干燥，粗产物经纯化，得到化合物3；

（4）化合物4的合成：化合物3与丙二腈在乙酸酐中溶解，进行一次回流加热；然后加入水，进行二次回流加热；反应完成后，将混合物冷却至室温并过滤，洗涤纯化，得到化合物4；

（5）DCM-OH的合成：化合物4和PBT用甲苯溶解，然后加入哌啶和乙腈，将反应混合物回流加热，反应完成后，将混合物冷却至室温并过滤纯化，得到DCM-OH；

（6）荧光探针的合成：将DCM-OH溶解于干式二氯甲烷中，滴加二甲基硫代氨基甲酰基氯，然后加入N-二异丙基乙胺后，室温下搅拌反应，TCL追踪至反应完全，反应溶液在减压下蒸发后纯化，得到目标产物DCM-SN。

进一步的，步骤（1）中，所述4-碘酚、丙烯醛二乙基乙醛、nBu₄NOAc、K₂CO₃、KCl、Pd(OAc)₂的摩尔比为0.5:1.5:1:0.75:0.5:0.015；所述4-碘酚溶液的浓度为0.25mol/L；所述反应为在90℃下搅拌5h。

进一步的，步骤（2）中，所述NaH溶液的浓度为2.2mol/L；所述NaH和2-羟基苯乙酮的摩尔比为4:1；所述2-羟基苯乙酮和乙酸乙酯的摩尔比为1：3；所述pH调节至6；所述回流加热的温度为60℃，时间为6h。

进一步的，步骤（3）中，每1g化合物2中加入15mL醋酸和0.6mL硫酸；所述回流加热的温度为60℃，时间为30min；所述冰水和醋酸的体积比为20:3；所述pH为8；所述一次洗涤用的溶剂为饱和Na₂CO₃溶液；所述二次洗涤为饱和NaCl溶液。

进一步的，步骤（4）中，化合物3和丙二腈的摩尔比为1:1.4-1.5；所述化合物3在乙酸酐中的摩尔浓度为0.56mol/L；所述一次回流加热的温度为60℃，时间为12h；所述乙酸酐和水的体积比为1:1；所述二次回流加热的温度为60℃，时间为30min。

进一步的，步骤（5）中，所述化合物4和PBT的质量比为4:3；所述化合物4在甲苯中的摩尔浓度为0.048mol/L；所述哌啶和乙腈的体积比为1:1；所述化合物4和哌啶的质量体积比为0.2g：0.5mL；所述回流加热的温度为60℃，时间为16h。

进一步的，步骤（6）中，所述DCM-OH在干式二氯甲烷中的0.022g/mL；所述DCM-OH和二甲基硫代氨基甲酰基氯的摩尔比为1:10；所述干式二氯甲烷和N-二异丙基乙胺的体积比为30:1。

本发明还提供了一种上述近红外荧光探针在细胞染色中的应用。

本发明制备的具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针，具有近红外最大发射波长(Em>810 nm)，并且拥有非比寻常的大斯托克斯位移(>290 nm)；可以应用于活细胞及小鼠活体染色，用于荧光成像。具体应用时，可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或乙腈、乙醇等有机溶剂中进行应用。

本发明分别研究了该荧光探针在pH＝7.4的全缓冲液中的光物理性质，并将其用于细胞和小鼠成像实验。细胞染色方法是：将培养好的细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵育，孵育一定的时间后将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦成像。

小鼠染色方法是：使用λ-卡拉胶构建关节炎模型的小鼠，将含有探针分子的水溶液注入小鼠关节炎部位，注射后一定时间内进行激光共聚焦成像。实验结果表明：染色效果良好，染色时间较短(30 min)，染色效率较高。

本发明的有益效果为：

(1)本发明制备的探针分子最大紫外吸收和荧光发射波长分别为：λ_ex=520 nm，λ_em=818 nm)，斯托克斯位移>290nm，有效地降低了自吸收。

(2)本发明制备的探针最大发射波长位于近红外区，有效地减少了荧光成像中的背景荧光，且稳定性好，在酸性、中性、碱性等宽pH范围内荧光强度稳定。

(3)本发明制备的探针进行应用后，活细胞和小鼠染色效果良好，染色时间短(30min)，染色效率高。

(4)本发明提供的制备方法，合成步骤相对简单，产率较高，容易纯化。

附图说明

图1为本发明探针DCM-SN在有或无ClO-（50 μM）的紫外-可见吸收光谱。

图2为本发明探针DCM-SN与ClO-(0-100 μM)共孵育10分钟的荧光光谱图。

图3为本发明探针DCM-SN在816 nm处的荧光强度与ClO-浓度关系(0.5、10、20、40、60、80、100 μM)图。

图4为本发明探针DCM-SN在820 nm处的发射强度与ClO -浓度( 0 ~ 40 uM)线性关系图。

图5为本发明的探针DCM-SN在不同pH值下荧光强度，横坐标为不同pH值，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的探针DCM-SN对H460细胞的荧光染色成像图；其中：A为H460细胞与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；B为H460细胞与10 mM 自由基引发剂ABAH孵育24h后与探针DCM-SN共孵育3h； C为H460细胞与10 mM LPS、PMA孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；D为H460细胞与500 mM NaOCl溶液孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h。

图7为本发明的探针DCM-SN对RAW264.7细胞的荧光染色成像图；其中： A为RAW264.7细胞与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；B为RAW264.7细胞与10 mM自由基引发剂 ABAH孵育24h后与探针DCM-SN共孵育3h；C为RAW264.7细胞与10 mM LPS、PMA孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；D为RAW264.7细胞与10 mM LPS、PMA、ABAH溶液孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h。

图8为本发明的探针DCM-SN对HepG2细胞的荧光染色成像图；其中，A为HepG2细胞与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；B为HepG2细胞与10 mM 自由基引发剂ABAH孵育24h后与探针DCM-SN共孵育3h；C为HepG2细胞与10 mM LPS、PMA孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h；D为HepG2细胞与10 mM LPS、PMA、ABAH溶液孵育24h后与10 μM探针DCM-SN共孵育3h。

图9为本发明的探针DCM-SN对小鼠的荧光染色成像图。

图10为本发明的探针DCM-SN对小鼠的荧光强度量化图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1荧光探针的合成

（1）中间体PBT的合成：在4-碘酚（0.5 mmol）溶解在DMF溶液中（2.0 mL），加入丙烯醛二乙基乙醛（0.23 mL，1.5 mmol）、nBu₄NOAc（0.302 g，1.0 mmol）、K₂CO₃（0.104 g，0.75mmol）、KCl（0.037 g，0.5 mmol）和Pd(OAc)₂（0.003 g，0.015 mmol）；将混合物在90℃下搅拌5 h，冷却至室温后，缓慢加入2 N盐酸，用乙酸乙酯提取混合物，然后，在无水硫酸钠上干燥，减压浓缩，用石油醚/乙酸洗脱闪柱层析纯化，得到化合物PBT；

中间体PBT的核磁表征如下：

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 9.57 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 7.42 (s, 1H),7.38–7.34 (m, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.53 (dt, J = 16.4, 8.2 Hz, 2H). ¹³C NMR (151MHz, CDCl₃) δ 194.16, 159.05, 153.32, 130.71, 126.65, 126.25, 116.21.

（2）化合物2的合成：NaH（60%，3.5 g，88 mmol）溶解于40 ml四氢呋喃，加入2-羟基苯乙酮（2.7 ml，22 mmol）和乙酸乙酯（6.5 ml，66 mmol）的混合溶液中；用20 ml四氢呋喃溶解，加入混合物，60℃回流加热6h；反应完成后，将混合物冷却到室温，然后用50 mL水稀释；用1N盐酸调节至pH = 6，用乙酸乙酯（3×100 ml）萃取，有机层用1N盐酸（60 ml）洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩至干燥，粗产物经硅胶（石油醚：乙酸乙酯=10：1)柱层析纯化，得到化合物2为白色固体（3.2 g，81%）；

化合物2的核磁表征如下：

1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 14.97 (s, 1H), 7.62 (d, J = 7.7 Hz, 1H),7.37 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 7.8, 7.4Hz, 1H), 4.10 (s, 1H), 2.98–2.90 (m, 1H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 195.41,183.02, 162.47, 135.72, 128.53, 119.03, 118.65, 117.82, 54.43, 30.59.

（3）化合物3的合成：化合物2（1.0 g，5.6 mmol）用15 ml醋酸酸和硫酸（98%，0.60ml，11 mmol）溶解，将混合物通过60℃回流加热30 min，然后倒入100毫升冰水中，然后用饱和Na₂CO₃溶液调节混合物至pH = 8，然后用二氯甲烷（3×100 ml）萃取。有机层用饱和Na₂CO₃溶液（60 ml）洗涤，然后用NaCl溶液（100 ml）洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩至干燥，粗产物经硅胶（石油醚：二氯甲烷=2：1)柱层析纯化，得到化合物3为白色固体（0.64 g，71%）；

化合物3的核磁表征如下：

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ8.15–7.99 (m, 1H), 7.55 (ddd, J = 8.5, 5.0,1.7 Hz, 1H), 7.33–7.30 (m, 1H), 7.28 (t, J = 3.4 Hz, 1H), 6.10–6.08 (m, 1H),2.31–2.28 (m, 3H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ 178.18, 166.26, 156.37, 133.42,125.46, 124.85, 123.40, 117.75, 110.42, 20.51.

（4）化合物4的合成：化合物3（0.90 g，5.6 mmol）与丙二腈（0.52 g，7.9 mmol）在10 ml乙酸酐中溶解，60℃回流加热12 h；然后加入10 ml水，将混合物在回流后再加热30min，反应完成后，将混合物冷却至室温并过滤，用水洗涤，用硅胶（石油醚：二氯甲烷=1：1）柱色谱层析纯化，得到化合物4为浅黄色固体（0.60 g，51%）；

化合物4的核磁表征如下：

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.42–7.33 (m, 1H), 7.20–7.16 (m, 1H), 6.84(t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 15.8, 7.8 Hz, 1H), 4.60 (s, 1H), 1.99 –1.16 (m, 3H). ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ 194.17, 159.04, 153.32, 130.71,126.65, 126.25, 116.21, 63.11, 22.57.

（5）DCM-OH的合成：化合物4 (0.20 g，0.96 mmol）和PBT（0.15 g，1.1 mmol）用20mL甲苯溶解，然后加入0.5 mL哌啶和0.5 mL乙腈；将反应混合物60℃回流加热16 h，反应完成后，将混合物冷却至室温并过滤。用硅胶（石油醚：乙酸乙酯=2：1）柱层析纯化固体，得到DCM-OH为红色固体（0.43 g，52%）；

化合物DCM-OH的核磁表征如下：

¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ9.79 (s, 1H), 7.78–7.74 (m, 4H), 7.46 (t, J =8.1 Hz, 3H), 7.07 (s, 1H), 6.94 (d, J = 8.3 Hz, 3H), 6.83–6.79 (m, 3H), 6.72(d, J = 10.6 Hz, 2H).¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ194.17, 159.04, 153.32, 150.54,142.61, 142.03, 130.71, 129.89, 129.64, 129.19, 126.65, 126.25, 116.21,115.41, 115.07, 114.95, 61.08.

（6）荧光探针的合成：将DCM-OH（0.33 g，1 mmol）溶解于干式二氯甲烷（15 mL）中，然后滴加加入二甲基硫代氨基甲酰基氯（1.24 g，10 mmol）；加入0.5 mL N-二异丙基乙胺后，搅拌反应，直到室温下材料耗尽。反应溶液在减压下蒸发，用二氯甲烷作为洗脱液纯化，得到DCM-SN（0.21 g，52%）。

荧光探针的核磁表征如下：

¹H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.46 (d, J = 8.4 Hz, 0H), 7.36–7.33 (m, 0H),7.07 (s, 0H), 7.02–6.99 (m, 0H), 6.94 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 7.6Hz, 0H), 6.81 (s, 0H), 6.73 (s, 0H), 3.38 (s, 1H). ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ191.43, 180.33, 158.98, 153.21, 152.43, 141.42, 141.22, 132.73, 132.55,129.75, 129.75, 116.29, 116.28, 106.73, 106.17, 59.64, 44.14.

实施例2 探针荧光效果实验：

(1)探针的紫外吸收和荧光发射实验：(紫外吸收所用仪器为普析TU-1900紫外可见吸收分光光度计，荧光检测所用仪器为FLS-920爱丁堡荧光光谱仪)

将实施例1制备的荧光探针(10 μM)，加入全缓冲(universal buffer solution，pH＝7.4，10mM)，测量其紫外吸收：荧光探针(Absmax＝520 nm)。然后以其最大吸收为激发波长，测量其荧光发射光谱图：荧光探针(Emmax＝816 nm)。测试结果如图1-图4所示，可以看出，探针发射波长在近红外区，并且它们的斯托克斯位移大于290 nm。

(2)荧光探针不同pH值下的荧光强度实验：

将实施例1制备的荧光探针(10μM)，分别测试其在不同pH值(全缓冲，10mM)下的荧光强度，结果如图5所示，图5为加入60 μM CIO-后DCM-SN在820 nm处的荧光强度随ph的变化，可以看出，荧光探针在不同pH范围内，荧光强度变化不明显，稳定性较好。

(3)荧光探针对活细胞的染色成像实验：

H460细胞，RAW264.7细胞，HepG2细胞由高糖的DMEM培养液培养，分别加入30μM探针的缓冲液(PBS缓冲液，pH＝7.4，10mM)，37℃中孵育10分钟，然后将细胞用灭菌过的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦荧光成像，H460，HepG2，RAW 264.7细胞内源性HCIO/CIO^-成像结果如图6、图7、图8所示，可以看出，荧光探针对三种活细胞染色效果较好。

(4)在小鼠体内成像过程中，将λ-卡拉胶（50 μL，10 mg / mL）注射到小鼠的一个后肢，建立小鼠关节炎炎症模型。同时，给小鼠的另一只后肢注射等量的生理盐水作为对照组。4小时后，将DCM-SN（50 μL 10 μM）注射到小鼠的双后肢，并在小动物活体成像仪中进一步成像小鼠，结果如图9、图10所示，可以看出，本发明制备的荧光探针对小鼠染色效果良好。

Claims

1.一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针，其特征在于，其结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，制备路线为：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述4-碘酚、丙烯醛二乙基乙醛、nBu₄NOAc、K₂CO₃、KCl、Pd(OAc)₂的摩尔比为0.5:1.5:1:0.75:0.5:0.015；所述4-碘酚溶液的浓度为0.25mol/L；所述反应为在90℃下搅拌5h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述NaH溶液的浓度为2.2mol/L；所述NaH和2-羟基苯乙酮的摩尔比为4:1；所述2-羟基苯乙酮和乙酸乙酯的摩尔比为1：3；所述pH调节至6；所述回流加热的温度为60℃，时间为6h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，每1g化合物2中加入15mL醋酸和0.6mL硫酸；所述回流加热的温度为60℃，时间为30min；所述冰水和醋酸的体积比为20:3；所述pH为8；所述一次洗涤用的溶剂为饱和Na₂CO₃溶液；所述二次洗涤为饱和NaCl溶液。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，化合物3和丙二腈的摩尔比为1:1.4-1.5；所述化合物3在乙酸酐中的摩尔浓度为0.56mol/L；所述一次回流加热的温度为60℃，时间为12h；所述乙酸酐和水的体积比为1:1；所述二次回流加热的温度为60℃，时间为30min。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述化合物4和PBT的质量比为4:3；所述化合物4在甲苯中的摩尔浓度为0.048mol/L；所述哌啶和乙腈的体积比为1:1；所述化合物4和哌啶的质量体积比为0.2g：0.5mL；所述回流加热的温度为60℃，时间为16h。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，所述DCM-OH在干式二氯甲烷中的0.022g/mL；所述DCM-OH和二甲基硫代氨基甲酰基氯的摩尔比为1:10；所述干式二氯甲烷和N-二异丙基乙胺的体积比为30:1。

10.一种如权利要求1所述的近红外荧光探针在细胞染色中的应用。