CN112778288A - 一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DDA0002911922540000011
本发明式Ⅰ结构所示荧光探针具有固态近红外发光性质，能够有效降低背景荧光信号，减少生物体自体荧光干扰，提高探针的灵敏度；其对谷氨酰转肽酶的响应快速，30min内能够响应饱和。本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对谷氨酰转肽酶的选择性好；本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对活细胞染色效果很好，染色时间较短，染色效率高，能够实现细胞膜表面谷氨酰转肽酶的原位检测；本发明式Ⅰ结构所示荧光探针光稳定性好，在活细胞成像中荧光信号稳定，不扩散。

Description

一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
细胞膜表面的蛋白酶活性对细胞的生长、分化以及细胞间的交流都有着极其重要的作用，然而目前能用于细胞膜表面蛋白酶的原位成像手段依然有很大的局限性。过去的几十年中，小分子荧光探针已经广泛应用于生物目标物的检测和成像。然而，已有的荧光探针大多是基于脂溶性染料设计的，由于细胞膜具有两亲性的特点，探针在细胞膜经过酶水解后释放的染料很容易进入细胞内，从而呈现假信号，失去酶活性的原位成像信息。
固态荧光团因其极差的水溶性，目前已经实现了一部分生物标记物的原位成像。然而其本身激发和发射波长较短，在进行生物成像的时候存在背景荧光的干扰，另一方面其本身具有一定的脂溶性，不适合用于细胞膜表面相关酶的原位成像。因此，开发一种具有强疏水性，弱脂溶性和近红外荧光的固态荧光团用于细胞膜表面相关酶的原位成像具有极其重要的意义。
谷氨酰转肽酶(GGT)是一种细胞膜锚定的胞外酶，主要负责将细胞外的谷胱甘肽转化为半胱氨酸用来维持细胞正常的氧化还原平衡。在肿瘤，炎症等多种疾病中，GGT活性均有明显提高。因此，在细胞膜表面长时原位的成像膜表面相关蛋白酶对于研究疾病的发生，发展和治疗都有着非常重要的意义，然而，目前并没有一个有效的检测成像手段可以实现细胞膜表面GGT的原位成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种弱脂溶性，强疏水性近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用；可以解决传统荧光探针在细胞成像过程中容易扩散造成假阳性信号的问题，提高荧光成像对比度的技术问题。
本发明这种近红外固态发光的荧光探针，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002911922520000021
本发明这种近红外固态发光的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物1和乌洛托品溶于三氟乙酸中，加热条件下进行回流反应，反应结束后，加入盐酸进行水解反应，反应结束后，过柱分离后，得到黄色中间体化合物2；
(2)将步骤(1)中的化合物2与2-氨基-5-氯苯甲酰胺及对甲苯磺酸在无水乙醇溶剂中进行回流反应，反应结束并冷却后，向其中加入二氯二氰基苯醌，然后抽滤，得到红色的固体，用乙醇洗涤固体，烘干即得固态荧光染料HYPQ；
(3)将化合物3溶于二氯甲烷中，在冰浴条件下加入DCC，进行初级反应，反应结束后，接着加入2-甲氨基哌啶，并渐渐升温至室温，进行反应，反应完毕后，抽滤掉生成的固体，滤液旋干，饱和碳酸氢钠水溶液洗，二氯甲烷萃取，再调节pH到2～4，产物在水中，再将pH调到11～13，二氯甲烷萃取，旋干，泵0.5～2h，得到化合物4；
(4)在氮气保护下，将步骤(2)中HYPQ溶于无水二氯甲烷和二甲亚砜中，在冰浴条件下中，加入DIPEA，并搅拌混匀，接着加入三光气，常温下搅拌反应，反应完毕后，真空泵抽出未反应的光气；化合物4溶于无水二氯甲烷后加入反应体系，接着加入DIPEA继续反应，反应完毕后，将反应液进行萃取收集有机相，有机相干燥后减压旋蒸去掉萃取溶剂，得到粗产物化合物5，用二氯甲烷重新溶解化合物5，接着向其中加入三氟乙酸脱保护基，刮板提纯产物，得到式Ⅰ所示的近红外固态发光的荧光探针；
合成路线如下：
Figure BDA0002911922520000031
所述步骤(1)中，化合物1、乌洛托的物质的量之比为1:(1～1.5)，化合物1 与三氟乙酸的质量体积比为15～16mg/mL；加热温度为85～95℃，回流反应时间为2～4h；盐酸的浓度为11～13mol/L，相对化合物1的加入量为：150～160mg化合物1加入3～4mL盐酸，水解反应时间为0.5～1.5h；过柱分离采用体积比为5:(3～1) 二氯甲烷和石油醚。
所述步骤(2)中，化合物2、2-氨基-5-氯苯甲酰胺、对甲苯磺酸和二氯二氰基苯醌的物质的量之比为1:(1～1.5):(0.01～0.02):(1.5～3)；化合物2与无水乙醇的质量体积比为1～2mg/mL；回流反应时间为2～4h，回流反应温度为80～85℃。
所述步骤(3)中，化合物3，DCC和2-甲氨基哌啶的物质的量之比为1:(1～ 1.2):(1～1.1)；化合物3与二氯甲烷的质量体积比为3～6mg/mL；初级反应时间为 10～20min；反应时间为15～17h。
所述步骤(4)中，HYPQ，三光气和化合物4的物质的量之比为1:4:(1～1.1)；二氯甲烷和二甲亚砜体积比为9～11:1，HYPQ与二氯甲烷和二甲亚砜混合溶剂的质量体积比为0.5～2mg/mL；HYPQ与第一次加入DIPEA的质量体积比为 48～50mg/mL，HYPQ与第二次加入DIPEA的质量体积比48～50mg/mL；搅拌混匀时间为9～12min，常温下搅拌反应时间为10～14h；化合物4溶于二氯甲烷后的浓度为8～10mg/mL；继续反应时间为10～14h。
所述的近红外固态发光的荧光探针在检测体外缓冲液中酶活性中的应用。
所述的近红外固态发光的荧光探针作为检测活细胞中成像细胞膜表面谷氨酰转肽酶活性中检测试剂中的应用。
本发明的原理：本发明首先合成了一种新型强疏水性弱脂溶性近红外固态荧光染料HYPQ是一个基于分子内质子转移机理的固态荧光染料，其荧光性质可以通过对其羟基保护与去保护来调控；然后利用HYPQ合成了GTT成像荧光探针 HYPQG(式Ⅰ结构所示)，所述荧光探针HYPQG具有较好的水溶性，荧光探针与谷氨酰转肽酶反应后，释放出荧光团HYPQ，由于强疏水和弱脂溶性的特点使其很容易沉淀在细胞膜表面，产生很强的固态荧光信号。该荧光探针与谷氨酰转肽酶反应后能够在原位生成沉淀，荧光信号很难扩散，实现对细胞膜相关蛋白酶的原位检测和高对比度、高分辨的荧光成像。
本发明的有益效果：
1)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针具有固态近红外发光性质，能够有效降低背景荧光信号，减少生物体自体荧光干扰，提高探针的灵敏度；
2)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对谷氨酰转肽酶的响应快速，30min内能够响应饱和；
3)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对谷氨酰转肽酶的选择性好；
4)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对活细胞染色效果很好，染色时间较短，染色效率高；
5)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针能够实现细胞膜表面谷氨酰转肽酶的原位检测；
6)本发明式Ⅰ结构所示荧光探针光稳定性好，在活细胞成像中荧光信号稳定，不扩散。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针的荧光发射光谱随着谷氨酰转肽酶活性增加的变化曲线，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
图2为实施例1制备的荧光探针与谷氨酰转肽酶反应后生成沉淀的DLS和 SEM表征图。
图3为实施例1制备的荧光探针相对于之前文献报道的荧光探针用于细胞膜表面谷氨酰转肽酶成像的共聚焦成像的对比图。
图4为实施例1制备的荧光探针对活细胞染色后的实时共聚焦成像图。
图5为实施例1制备的荧光探针对不同肿瘤细胞的内源性谷氨酰转肽酶的共聚焦成像图。
图6为实施例1制备的荧光探针对于同一细胞在不同的刺激条件下的细胞膜表面谷氨酰转肽酶的共聚焦成像图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无说明均能从公开商业途径获得。
实施例1近红外抗扩散细胞膜成像探针HYPQG的合成
本实施例的合成路线如下，具体包括以下步骤：
Figure BDA0002911922520000061
(1)将化合物1(156mg)和乌洛托品(84mg)溶于三氟乙酸(10mL)中，加热(90℃)回流下3h，反应结束后，加入4mL浓度为12mol/L的盐酸进行水解反应1h，然后以二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，将反应液进行过柱分离，得到黄色中间体(34mg,20％)化合物2；
(2)将化合物2(34mg)、2-氨基-5-氯苯甲酰胺(25mg)及对甲苯磺酸(0.1 mg)在60mL无水乙醇中82℃回流搅拌3h，冷却后加入二氯二氰基苯醌(35mg)，抽滤得到红色的固体，用乙醇洗涤固体，烘干即得到纯净的红色化合物(14.2mg, 29％)，即弱脂溶性近红外固态荧光染料即(E)-2-(2-(3-(6-氯-4-氧代-3,4- 二氢喹唑啉)-4-羟基苯乙烯基)-4H)丙二腈，命名为HYPQ；
HYPQ的质谱及核磁表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.7–8.7(m,1H),8.6(s,1H),8.1(s,1H),7.9 (s,2H),7.9–7.8(m,4H),7.8–7.7(m,2H),7.6(d,J＝7.9Hz,1H),7.4(s,1H),7.1 (d,J＝8.8Hz,1H),6.9(s,1H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6 and pyridine-d5)δ 189.9,182.4,172.8,161.2,155.6,147.6,136.5,135.4,134.6,134.2,132.8,130.0, 128.9,125.4,124.7,124.2,123.2,122.7,121.8,115.4,44.2.
ESI/MS,m/z:calc.490.9,found 489.3.[M-]
核磁和质谱与合成路线的结构式是完全对应的。
(3)将化合物3(303mg)溶于60mL二氯甲烷中，在冰浴条件下加入DCC(227 mg)，反应15min，加入2-甲氨基哌啶(114mg)渐渐升至室温反应16h，抽滤掉生成的固体，滤液旋干，饱和碳酸氢钠水溶液洗，二氯甲烷萃取，再调节pH到3，产物在水中，再将pH调到12，二氯甲烷萃取，旋干，泵1h，得到化合物4(164mg, 41％)。
(4)在氮气保护下，将HYPQ(49mg)溶于50mL无水二氯甲烷和5mL二甲亚砜中，在冰浴中加入1mL DIPEA搅拌10min，然后缓慢加入三光气(124mg)，常温下搅拌反应12h。真空泵抽调未反应的光气，化合物4(80mg)溶于8mL无水二氯甲烷加入反应体系，接着加入1mLDIPEA继续反应12h；将反应液进行萃取收集有机相，有机相干燥后减压旋蒸去掉萃取溶剂，得到粗产物化合物5，用二氯甲烷重新溶解化合物5，加入十倍当量三氟乙酸脱保护基，刮板提纯产物，得到GGT固态荧光探针，命名为HYPQG。
质谱及核磁表征：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.73(d,J＝8.3Hz,1H),8.55(s,1H),8.16(s, 1H),8.11(s,1H),7.94(t,J＝8.1Hz,3H),7.91–7.85(m,1H),7.83–7.78(m,1H), 7.72(d,J＝8.7Hz,1H),7.68–7.53(m,2H),7.40(s,1H),7.06(s,1H),4.12–3.96 (m,1H),3.79(s,1H),3.72(s,1H),3.65(s,1H),3.51(s,1H),2.94(s,3H),2.25(s, 2H),1.98(s,2H),1.51(s,4H),1.45(s,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ158.24,153.40,152.49,150.60,137.39, 136.03,135.13,132.53,131.74,130.30,128.20,126.72,125.37,125.14,124.36, 122.73,120.93,119.53,117.55,116.17,107.53,83.44,70.24,61.20,49.28,29.48, 27.95,20.58,19.07,15.48,11.60.
HRMS,m/z:calc[M+H]+760.2286,found 760.2287.
核磁和质谱与合成路线的结构式是完全对应的。
实施例2 HYPQG探针在试管里对谷氨酰转肽酶的检测
将HYPQG探针配成1mM的DMSO储备溶液，于-20℃下保存。检测体系为 TBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4，含5％的DMSO)。将HYPQG与谷氨酰转肽酶的反应体系在37℃下摇荡30分钟，然后测量其荧光发射光谱。设置荧光仪的激发波长为450nm，发射波长接收范围为580-800nm。其结果如图1所示，从图1可以看出，所述HYPQG探针对谷氨酰转肽酶有很好的响应。
实施例3 HYPQG探针与谷氨酰转肽酶反应产物的形态表征。
反应体系为TBS缓冲溶液(10mM，pH7.4，含5％的DMSO)。将HYPQG探针与谷氨酰转肽酶在37℃下孵育30min后，用DLS测量仪测量生成沉淀的粒径，用扫描电镜拍摄固体颗粒的表面形态，其结果如图2所示。
实施例4 HYPQG探针对活细胞染色成像实验
a)提前将A2780细胞接种在光学培养皿中，每个皿中接种4万个细胞，孵育 24h，然后吸去原有的培养基(1640，含5％FBS和10％双抗)，加入DPBS。将所述HYPQG探针与细胞孵育40分钟后，吸去原有的培养基，并用DPBS清洗1次，用激光共聚焦显微镜检测其荧光信号。其结果如图3所示，从图3可以看出，传统的GGT荧光探针在细胞膜上反应后释放的染料很容易扩散进入细胞中，因此不能实现细胞膜上GGT的原位成像，而本专利所述HYPQG探针在细胞膜上反应后形成不溶性沉淀并，因此抑制染料扩散进入细胞，从而能够原位检测细胞膜上的谷氨酰转肽酶。
b)提前将A2780细胞接种在光学培养皿中，每个皿中接种4万个细胞，孵育 24h，然后吸去原有的培养基(1640，含5％FBS和10％双抗)，加入DPBS。将所述探针加入细胞中，用激光共聚焦显微镜检测其荧光信号。其结果如图4所示，从图4可以看出，所述HYPQG探针的荧光信号稳定不扩散。
c)提前将A2780,OVCAR3和NIH3T3细胞接种在光学培养皿中，每个皿中接种4万个细胞，孵育24h，然后吸去原有的培养基(1640，含5％FBS和10％双抗)，加入DPBS。将所述HYPQG探针与细胞孵育40分钟后，用激光共聚焦显微镜检测其荧光信号。其结果如图5所示，从图5可以看出，相对于传统的荧光探针， HYPQG可以实现对细胞膜表面GGT的原位成像。
d)提前将HepG2细胞接种在光学培养皿中，每个皿中接种4万个细胞，孵育 24h，加入不同浓度的丁酸钠分别培养24h和48h，然后吸去原有的培养基(1640，含5％FBS和10％双抗)，加入DPBS。将所述探针加入细胞中，用激光共聚焦显微镜检测其荧光信号。其结果如图6所示，从图6可以看出，HYPQG可以实现对同一种细胞不同状态下细胞膜表面GGT的原位成像。

Claims (8)

1.一种近红外固态发光的荧光探针，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002911922510000011
2.一种根据权利要求1所述的近红外固态发光的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物1和乌洛托品溶于三氟乙酸中，加热条件下进行回流反应，反应结束后，加入盐酸进行水解反应，反应结束后，过柱分离后，得到黄色中间体化合物2；
(2)将步骤(1)中的化合物2与2-氨基-5-氯苯甲酰胺及对甲苯磺酸在无水乙醇溶剂中进行回流反应，反应结束并冷却后，向其中加入二氯二氰基苯醌，然后抽滤，得到红色的固体，用乙醇洗涤固体，烘干即得固态荧光染料HYPQ；
(3)将化合物3溶于二氯甲烷中，在冰浴条件下加入DCC，进行初级反应，反应结束后，接着加入2-甲氨基哌啶，并渐渐升温至室温，进行反应，反应完毕后，抽滤掉生成的固体，滤液旋干，饱和碳酸氢钠水溶液洗，二氯甲烷萃取，再调节pH到2～4，产物在水中，再将pH调到11～13，二氯甲烷萃取，旋干，泵0.5～2h，得到化合物4；
(4)在氮气保护下，将步骤(2)中HYPQ溶于无水二氯甲烷和二甲亚砜中，在冰浴条件下中，加入DIPEA，并搅拌混匀，接着加入三光气，常温下搅拌反应，反应完毕后，真空泵抽出未反应的光气；化合物4溶于无水二氯甲烷后加入反应体系，接着加入DIPEA继续反应，反应完毕后，将反应液进行萃取收集有机相，有机相干燥后减压旋蒸去掉萃取溶剂，得到粗产物化合物5，用二氯甲烷重新溶解化合物5，接着向其中加入三氟乙酸脱保护基，刮板提纯产物，得到式Ⅰ所示的近红外固态发光的荧光探针；
合成路线如下：
Figure FDA0002911922510000021
3.根据权利要求2所述的近红外固态发光的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，化合物1、乌洛托的物质的量之比为1:(1～1.5)，化合物1与三氟乙酸的质量体积比为15～16mg/mL；加热温度为85～95℃，回流反应时间为2～4h；盐酸的浓度为11～13mol/L，相对化合物1的加入量为：150～160mg化合物1加入3～4mL盐酸，水解反应时间为0.5～1.5h；过柱分离采用体积比为5:(3～1)二氯甲烷和石油醚。
4.根据权利要求2所述的近红外固态发光的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，化合物2、2-氨基-5-氯苯甲酰胺、对甲苯磺酸和二氯二氰基苯醌的物质的量之比为1:(1～1.5):(0.01～0.02):(1.5～3)；化合物2与无水乙醇的质量体积比为1～2mg/mL；回流反应时间为2～4h，回流反应温度为80～85℃。
5.根据权利要求2所述的近红外固态发光的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，化合物3，DCC和2-甲氨基哌啶的物质的量之比为1:(1～1.2):(1～1.1)；化合物3与二氯甲烷的质量体积比为3～6mg/mL；初级反应时间为10～20min；反应时间为15～17h。
6.根据权利要求2所述的近红外固态发光的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，HYPQ，三光气和化合物4的物质的量之比为1:4:(1～1.1)；二氯甲烷和二甲亚砜体积比为9～11:1，HYPQ与二氯甲烷和二甲亚砜混合溶剂的质量体积比为0.5～2mg/mL；HYPQ与第一次加入DIPEA的质量体积比为48～50mg/mL，HYPQ与第二次加入DIPEA的质量体积比48～50mg/mL；搅拌混匀时间为9～12min，常温下搅拌反应时间为10～14h；化合物4溶于二氯甲烷后的浓度为8～10mg/mL；继续反应时间为10～14h。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的近红外固态发光的荧光探针在检测体外缓冲液中酶活性中的应用。
8.根据权利要求1～6中任意一项所述近红外固态发光的荧光探针作为检测活细胞中成像细胞膜表面谷氨酰转肽酶活性中检测试剂中的应用。
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