CN117736135B - 一种蛋白质位点特异性修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质位点特异性修饰的方法，所述化合物具有式(I)所示的结构。本发明的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2‑氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质的位点特异性修饰。该化合物参与的缩合反应（简称TAMM缩合反应）本身可以重复使用来标记非天然氨基酸上的1,2‑氨基硫醇或透过序列特异性蛋白酶产生的1,2‑氨基硫醇，实现多色标记。另外本发明中TAMM缩合反应与常见的生物正交反应（如CuAAC和IEDDA等）不互相干扰，可以联用来实现多色标记。因此，本发明的方法可用于活细胞膜蛋白多重标记。(I)。
Description
技术领域
本发明涉及属于生物化学技术领域，特别涉及一种蛋白质位点特异性修饰的方法，特别涉及一种蛋白质位点特异性修饰的化合物及其用途和对多肽或蛋白进行修饰的方法。
背景技术
蛋白质是由20种天然氨基酸所组成的多样化生物分子，负责维持细胞的各种功能和生命体的正常运作。一个细胞可以产生上万种不同的蛋白质，而这些蛋白质的功能，也与它们在细胞中的丰度、结构、位置、转运、相互作用等息息相关。荧光成像可以用于揭示蛋白质的这些性质，是现代细胞和分子生物学研究的重要手段。然而多数蛋白质不会产生特定颜色的荧光，无法直接观察，因此需要先进行荧光标记。
通过遗传学手段将目标蛋白与荧光蛋白融合，是目前生物学家最广泛使用的荧光标记手段，将不同颜色的荧光蛋白与不同的目标蛋白融合，可以很容易的实现活细胞多色荧光成像。然而，相较于有机小分子荧光染料，荧光蛋白的光物理和化学性质较差，不如许多小分子荧光染料亮度高或稳定；另外，荧光蛋白的尺寸巨大（约27 kDa），在接上目标蛋白之后，有可能会影响目标蛋白的功能以及与其它分子的相互作用，同时巨大的尺寸也不利于精准定位和超分辨成像。
特异性地将染料接到目标蛋白上，是使用小分子染料进行荧光成像的先决条件。生物学家也会利用带有小分子荧光染料的抗体（约150 kDa）来标记目标蛋白，进行免疫荧光成像。但是免疫荧光的实验操作需要比较剧烈的条件来洗脱非特异性结合的抗体，因此一般会先固定细胞，较少用于活细胞成像；另外，目标蛋白与其它分子的相互作用，可能会影响抗原被抗体识别，导致在特定的生物微环境下，无法进行免疫荧光成像。
基因密码子拓展技术（genetic code expansion）是蛋白质的定点修饰技术之一，能够实现在生物体内任意目标蛋白的特定位点引入非天然氨基酸。其可以通过生物正交反应，将带有特定化学官能团的非天然氨基酸导入目标蛋白中的自定义位点，对目标蛋白结构或功能上影响的可能性最小，同时目标蛋白与荧光染料的距离最短，有利于超分辨成像。
目前已经有很多结合生物正交反应和基因密码子扩展技术实现活细胞蛋白荧光标记的例子，例如铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）和四嗪介导的反电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应所需要的生物正交官能团都可以透过基因密码子拓展技术引入目标蛋白质中，但是在哺乳动物细胞的应用仍局限于单色或双色荧光标记，如果可以在活细胞同时做多色标记成像，就能使用多通道方法可以同步观察多个蛋白质结构，从而为测量数据增加相关信息，通过这种方法可以研究蛋白质相互作用、动态变化等。
因此，本领域亟需开发一种蛋白质多色荧光标记方法，实现对蛋白质的多色荧光标记成像，进而为蛋白如何在细胞内的转运、定位和相互作用奠定基础。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种乙烯基硫醚化合物，该乙烯基硫醚化合物能与1,2-氨基硫醇发生生物正交反应，用于标记蛋白，实现蛋白质的多色荧光成像。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
1,2-氨基巯基是一种独特的双亲核试剂，可以很容易地以化学或生物手段导入蛋白质中的特定位点，1,2-氨基硫醇的小尺寸确保了对目标蛋白质干扰最小化，同时反应兼备高原子利用率。因此，1,2-氨基硫醇作为生物正交官能团，以N端半胱氨酸或是非天然氨基酸的形式导入目标蛋白，都可以由乙烯基硫醚化合物（TAMM）缩合反应实现蛋白质位点特异性修饰。
基于此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物具有式(I)所示的结构：
(I)，
其中，R1为被卤素取代的C1~6烷基、被R1a取代的6~10元芳香基、或被R1a取代的5~10元杂芳香基；
R2为被R2a取代的6~10元亚芳香基、或被R2a取代的5~10元亚杂芳香基；
R3为空或可检测基团；
L1为空、或连接子；
每个R1a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基；
每个R2a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基。
根据本发明实施例的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。
根据本发明的实施例，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被R1a取代的6~8元芳香基、或被R1a取代的5~8元杂芳香基。
根据本发明的实施例，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被R1a取代的6~7元芳香基、或被R1a取代的5~7元杂芳香基。
根据本发明的实施例，每个R1a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C1~3烷基。
根据本发明的实施例，R1选自-CF3、-CCl3、-CBr3、-CH2CF3、-CH2CCl3、-CH2CBr3、-CF2CF3、-CCl2CCl3、-CBr2CBr3、-CF2CCl3、-CF2CBr3、-CCl2CF3、-CCl2CBr3、-CBr2CF3、-CBr2CCl3、、/>、/>、/>、/>、/>、/>、/>、/>。
根据本发明的实施例，R2为被R2a取代的6~10元芳香基。
根据本发明的实施例，R2为被R2a取代的6~8元芳香基。
根据本发明的实施例，R2为、/>、/>。
根据本发明的实施例，所述可检测基团选自荧光染料。
根据本发明的实施例，所述可检测基团选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、花菁染料、IR染料、吖啶、香豆素、或BODIPY。
根据本发明的实施例，每个R2a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C1~3烷基。
根据本发明的实施例，L1为，n为0~20之间的任意整数。
根据本发明的实施例，n为5~15之间的任意整数。
根据本发明的实施例，所述化合物具有如下结构：
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根据本发明的实施例，所述化合物具有如下结构：
、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、。
在本发明的第二方面，本发明提出了第一方面所述的化合物在对多肽修饰或蛋白修饰中的用途，所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。由前可知，第一方面的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰。因此，当多肽或蛋白中含有半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸，上述化合物可与半胱氨酸或非天然氨基酸进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端。
根据本发明的实施例，所述含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸位于所述多肽或蛋白的任意位点。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种对多肽或蛋白进行修饰的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一方面所述的化合物和所述多肽或蛋白进行缩合反应；所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。由前可知，第一方面的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。根据本发明的实施例，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端。根据本发明的实施例，所述含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸位于所述多肽或蛋白的任意位点。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种细胞膜蛋白多重标记的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1）采用第三方面所述的方法对所述细胞的多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；或者2）采用第三方面所述的方法对所述细胞的一个或多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；以及采用CuAAC法和/或IEDDA法对所述细胞的第二膜蛋白进行标记，所述第二膜蛋白中标记的可检测基团和所述第一膜蛋白中标记的可检测基团不同。根据本发明实施例的方法，本发明中第一方面所述的化合物参与的缩合反应（简称TAMM缩合反应）本身可以重复使用来标记非天然氨基酸上的1,2-氨基硫醇和透过序列特异性蛋白酶产生的1,2-氨基硫醇，实现多色标记。另外，本发明中TAMM缩合反应与常见的生物正交反应（如CuAAC和IEDDA等）不互相干扰，还可以联用来实现多色标记，其可结合另外不同的生物正交反应。因此，本发明的方法可用于活细胞膜蛋白多重标记。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中化合物9（Cy5-TAMM-SCH2CF3）的LC-MS图谱，上图为色谱（Angilent 770450-902色谱柱；梯度条件为0-6分钟10-70%甲醇，6-9分钟70-90%甲醇，9-12分钟90%甲醇，12-14分钟90-10%甲醇；流速每分钟1毫升；检测波长650 nm）下图为9.53分钟出峰的质谱（ESI-MS）显示[M+H]+和[2M+H]+的离子。
图2为本发明实施例1中Cy5-TAMM-SCH2CH3的LC-MS图谱，条件同图1，除了质谱所示为10.07分钟的出峰。
图3为本发明实施例1中Cy5-TAMM-SPhF的LC-MS图谱，条件同图1，除了质谱所示为10.10分钟的出峰。
图4为本发明实施例1中Cy3-TAMM-SCH2CF3的LC-MS图谱，条件同图1，除了检测波长550 nm，质谱所示为12.73分钟的出峰。
图5为本发明实施例3中比较Cy5-TAMM-SCH2CF3和Cy5-TAMM-SPhF用于蛋白标记的效果。
图6为本发明实施例4中比较Cy5-TAMM-SCH2CF3和Cy5-TAMM-SEt用于蛋白标记的效果。
图7为本发明实施例5中联用TAMM缩合和另一种生物正交反应（如CuAAC和IEDDA）来实际多色荧光标记的结果。
图8为本发明实施例6中采用非天然氨基酸和序列特异性蛋白酶，以及两种不同TAMM染料，来实现双色荧光标记的案例。
图9为本发明一个可选实施例中利用TAMM缩合和其它生物正交反应实现四色荧光标记。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明详细说明
定义及一般术语
需要说明的是，针对本发明的实施例或实施方案中的结构式和化学式说明，本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案。本领域技术人员应认识到，许多与本发明所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本发明所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下（包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等），以本发明为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见的，在多个独立的实施例或实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例或实施方案中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施例或实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外指出，本发明所使用的技术和科学术语与本发明所属技术领域技术人员的常规理解具有相同的含义，除非另外指出，在本发明公开全部内容所引用的所有专利公开出版物通过引用方式将其整体并入本发明。
除非另外指出，本发明将应用以下定义。根据本发明的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本和化学药品手册, 75, thEd, 1994来定义。另外，有机化学一般原理见“Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito:1999, and “March's Advanced Organic Chemistry”, by Michael B. Smith and JerryMarch, John Wiley&Sons, New York: 2007，因此本发明所有的内容都融合了参考文献。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，本发明的化合物还包括同位素标记的本发明化合物，其除以下事实外与本发明所述的那些化合物相同：一个或多个原子被原子质量或质量数不同于天然常见原子质量或质量数的原子代替。还可引入本发明化合物中的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如2H、3H、13C、14C、15N、16O、17O、31P、32P、36S、18F和37Cl。
包含前述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明化合物以及所述化合物的药学上可接受的盐都包括在本发明范围内。同位素标记的本发明化合物，例如放射性同位素，如3H和14C掺入到本发明化合物中可用于药物和/或底物组织分布分析。由于易于制备以及检测，氚代的（即3H），以及碳-14（即14C），同位素特别优选。此外，用重的同位素，如氘（即2H取代），可提供一些源自更大的代谢稳定性的治疗上的优势，例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求。因此，在一些情形下可能是优选的。
除非另外指出，本发明描述的结构还表示包括此结构的所有异构体(如，对映体、非对映体阻转异构体（atropisomer）和几何（或构象）形式；例如，各不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体，以及(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映体混合物、非对映体混合物和几何异构体(或构象异构体)混合物均在本发明的范围之内。
本发明化合物的任何不对称原子（例如碳等）都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(R)-或(S)-构型方面具有至少50%对映体过量，至少60%对映体过量，至少70%对映体过量，至少80%对映体过量，至少90%对映体过量，至少95%对映体过量，或至少99%对映体过量。如果可能的话，具有不饱和双键的原子上的取代基可以以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。
因此，如本发明所描述的那样，本发明的化合物可以以可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体中的一种形式或其混合物的形式存在，例如为基本纯的几何（顺式或反式）异构体、非对映异构体、光学异构体（对映体）、外消旋体或其混合物形式。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“任选取代的”、“任选被……取代的”与“取代或非取代的”可以交换使用。一般而言，术语“任选地”不论是否位于术语“取代的”之前，都表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，F、Cl、Br、CN、OH、NH2、NO2等。
在本文中，术语“被……取代的” 表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基（包含H）所取代。除非其他方面表明，一个取代基团可以在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。当被H取代，即该基团本身。
在本文中，术语“一个或多个”（例如，在本发明的通式的化合物的取代基的定义中）是指“一个、两个、三个、四个或五个，尤其是一个、两个、三个或四个，更尤其是一个、两个或三个，更加尤其是一或两个”。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本文中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘原子。
在本文中，碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca~b是指含“a”至“b”个碳原子。示例性地，“C1~n”是指包含1、2、3、4、5、……或n个碳原子的直链或支链的饱和/不饱和的碳链；进一步理解， “C1~n”应解释为其中包括的任何子范围，例如C1~6中，包含C1~5、C1~4、C1~3、C1~2、C2~5、C2~4、C2~3、C3~5、C3~4、C4~5。
需要说明的是，在本文中使用的术语“C1~6”，例如，在“C1~6烷基”或“C1~6烷氧基”的定义的背景下，是指具有1至6个有限数量的碳原子的烷基，即1、2、3、4、5或6个碳原子。进一步理解，所述术语“C1~6”应解释为其中包括的任何子范围，例如C1~6、C2~5、C3~4、C1~2、C1~3、C1~4、C1~5；尤其是C1~2、C1~3、C1~4、C1~5、C1~6；更尤其是C1~4。
在本文中，术语“C1~6烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链的饱和单价烃基团，例如C1~5烷基、C1~4烷基、C1~3烷基、C2~5烷基、C2~4烷基、C2~3烷基。其中，包括但并不限于甲基、乙基、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)，其中所述烷基基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
在本文中，术语“C1~6烷氧基”和“C1~6氧烷基”均是指含有式“-O-烷基”的C1~6烷基，其中，术语“烷基”如上文所定义。例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、异戊氧基和正己氧基，或上述基团的异构体。尤其是，所述“C1-C6烷氧基”可以含有1、2、3、4或5个碳原子(“C1~5烷氧基”)，优选地，可含有1、2、3或4个碳原子(“C1~4烷氧基”)。
在本文中，术语“芳香基”或“芳基”表示含有6-10个环原子，或6-9个环原子，或6-8个环原子的单环、双环和三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7个原子组成的环。芳基基团通常，但不必须地通过芳基基团的芳香性环与母体分子连接。术语“芳香基”或“芳基”可以和术语“芳香环”或“芳环”交换使用。芳基基团的实例可以包括但不限于苯基。
在本文中，术语“杂芳香基”或“杂芳基”表示含有5-10个环原子，或5-9个环原子，或5-8个环原子的单环、双环和三环体系，其中至少一个环体系是芳香族的，且至少一个环体系包含一个或多个杂原子，其中每一个环体系包含5-7个原子组成的环。杂芳基基团通常，但不必须地通过杂芳基基团的芳香性环与母体分子连接。术语“杂芳香基”或“杂芳基”可以与术语“杂芳环”，“芳杂环”或“杂芳族化合物”交换使用。在本发明的一个实施方案中，5-10个原子组成的杂芳基包含1，2，3或4个独立选自O，S和N的杂原子。
杂芳基基团的实例包括，但并不限于，2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、N-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、哒嗪基（如3-哒嗪基）、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、四唑基（如5-四唑基）、三唑基（如2-三唑基和5-三唑基）、2-噻吩基、3-噻吩基、吡唑基（如2-吡唑基）、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,3-硫代二唑基、1,3,4-硫代二唑基、1,2,5-硫代二唑基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基。
在本文中，术语“亚芳香基”是指“芳香基”再脱掉一个氢原子所形成的基团。
在本文中，术语“亚杂芳香基”是指“杂芳香基”再脱掉一个氢原子所形成的基团。
除非另有说明，用楔形实线键（）和楔形虚线键（/>）表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键（/>）和直形虚线键（/>）表示立体中心的相对构型。
本公开所述配体或化合物的化学结构中，键“”表示未指定构型。如果化学结构中存在手性异构，键“/>”可以为“/>”、“/>”、或者同时包含“/>”和“/>”两种构型。虽然为简便起见将全部上述结构式画成某些异构体形式，但是本公开可以包括所有的异构体，例如：互变异构体、旋转异构体、几何异构体、非对映异构体、外消旋体和对映异构体。
本发明基团描述中的“”是用来描述基团取代的位置。
本发明蛋白质位点特异性修饰的化合物及其用途和对多肽或蛋白进行修饰的方法的详细说明
本发明提出了一种化合物及其用途、对多肽或蛋白进行修饰的方法和细胞膜蛋白多重标记的方法，下面将分别对其进行详细描述。
化合物
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。
根据本发明的实施例，所述化合物具有式(I)所示的结构：
(I)，
其中，R1为被卤素取代的C1~6烷基、被R1a取代的6~10元芳香基、或被R1a取代的5~10元杂芳香基；
R2为被R2a取代的6~10元亚芳香基、或被R2a取代的5~10元亚杂芳香基；
R3为空或可检测基团；
L1为空、或连接子；
每个R1a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基；
每个R2a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基。
根据本发明的实施例，所述化合物具有式(I)所示的结构：
(I)，
其中，R1为被卤素取代的C1~6烷基、任选被R1a取代的6~10元芳香基、或任选被R1a取代的5~10元杂芳香基；
R2为任选被R2a取代的6~10元亚芳香基、或任选被R2a取代的5~10元亚杂芳香基；
R3为空或可检测基团；
L1为空、或连接子；
每个R1a各自独立地选自卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基；
每个R2a各自独立地选自卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基。
根据本发明实施例的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。
进一步地，发明人经过实验发现，与R1为未取代的烷基或其它基团取代的烷基相比， R1为被卤素取代的C1~6烷基、任选被R1a取代的6~10元芳香基、或任选被R1a取代的5~10元杂芳香基时，本发明的TAMM可更好的标记到蛋白上，其在低曝光条件下即可实现对蛋白质的荧光标记成像。
在本文中，术语“可检测基团”是指能特异性释放信号或特异性识别的基团或分子（如荧光染料，可检测染料）。例如，可为发色基团或称发色分子（例如荧光基团），例如可为通过检测仪器或设备获得可检测基团相应的定量光信号、电信号或放射信号的化学基团。
在本文中，发色基团包括但不限于：非蛋白质有机荧光团，例如氧杂蒽衍生物（荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，伊红和德克萨斯红）；花青衍生物（或称花菁染料，包括但不限于花青、吲哚羰花青、氧杂花青、硫代花青和部花青）；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta，SeTau和Square染料；萘衍生物（丹酰和氟硅酸钠衍生物）；香豆素衍生物（或称香豆素染料）；恶二唑衍生物（吡啶基恶唑，硝基苯并恶唑和苯并恶二唑）；蒽衍生物（蒽醌类，包括DRAQ5，DRAQ7和CyTRAK橙）；芘衍生物（级联蓝等）；恶嗪衍生物（尼罗红，尼罗蓝，甲酚紫，恶嗪170等）；吖啶衍生物（或称吖啶染料，包括但不限于视黄醇、黄素、吖啶橙、吖啶黄等）；芳基甲胺衍生物（金胺，结晶紫，孔雀石绿）和四吡咯衍生物（卟吩，酞菁，胆红素）。
根据本发明的实施例，所述可检测基团选自荧光染料。
根据本发明的实施例，所述可检测基团选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、花菁染料、IR染料、吖啶染料、香豆素染料、或BODIPY 。
在本发明的一些可选实施例中，可检测基团包括但不限于Cy2基团、Cy3基团、Cy3.5基团、Cy3B基团、Cy5基团、Cy5.5基团、Cy7基团、FITC、Rhodamine700 perchlorate基团、Rhodamine基团、Rhodamine6G基团、Rhodamine101基团、Rhodamine123基团、RhodamineB基团、RhodamineGreen基团、Rhodamine pH-Probe585-7.0基团、Rhodamine pH-Probe585-7.5基团、Rhodamine phalloidin基团、Rhodamine Red-X基团、Rhodamine Tag pH-Probe585-7.0基团、IR 783基团、IR 775基团。
在本发明的一个可选实施例中，-S-R1为离去基团，该离去基团的pKa小于8。
在本发明的一个可选实施例中，该化合物与1,2-氨基硫醇在室温和pH 7.4下的反应速率大于104M-1·s-1。
根据本发明的实施例，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被R1a取代的6~8元芳香基、或被R1a取代的5~8元杂芳香基；或者R1为被卤素取代的C1~3烷基、任选被R1a取代的6~8元芳香基、或任选被R1a取代的5~8元杂芳香基。
根据本发明的实施例，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被R1a取代的6~7元芳香基、或被R1a取代的5~7元杂芳香基；或者R1为被卤素取代的C1~3烷基、任选被R1a取代的6~7元芳香基、或任选被R1a取代的5~7元杂芳香基。
根据本发明的实施例，每个R1a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C1~3烷基；或者每个R1a各自独立地选自卤素、-OH、-C1~3烷基。
在本发明的一个优选实施例中，所述卤素为F。在本发明的一个优选实施例中，所述卤素为Cl。
根据本发明的实施例，R1选自-CF3、-CCl3、-CBr3、-CH2CF3、-CH2CCl3、-CH2CBr3、-CF2CF3、-CCl2CCl3、-CBr2CBr3、-CF2CCl3、-CF2CBr3、-CCl2CF3、-CCl2CBr3、-CBr2CF3、-CBr2CCl3、、/>、/>、/>、/>、/>、/>、/>、/>。
根据本发明的实施例，R2为被R2a取代的6~10元芳香基；或者R2为任选被R2a取代的6~10元芳香基。
根据本发明的实施例，R2为被R2a取代的6~8元芳香基；或者R2为任选被R2a取代的6~8元芳香基。
根据本发明的实施例，每个R2a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C1~3烷基；或者每个R2a各自独立地选自卤素、-OH、-C1~3烷基。
根据本发明的实施例，R2为、/>、/>。
根据本发明的实施例，L1为，n为0~20之间的任意整数。由此，可增加化合物的亲水性，避免化合物进到细胞内形成背景荧光信号。
根据本发明的实施例，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或它们中的任意两个值作为端点值之间的范围值，如1~20、5~15、5~10等。
根据本发明的实施例，n为5~15之间的任意整数。
根据本发明的实施例，所述化合物具有如下结构：
、/>、、/>、/>、/>、、/>、/>。
在本发明的一些可选实施例中，所述化合物具有如下结构：
、/>、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、。
在本发明的第二方面，本发明提出了第一方面所述的化合物在对多肽修饰或蛋白修饰中的用途，所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。由前可知，第一方面的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰。因此，当多肽或蛋白中含有半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸，上述化合物可与半胱氨酸或非天然氨基酸进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端。
需要说明的是，在本发明中，只要使多肽或蛋白的N端携带半胱氨酸即可，具体方法不受限制，均在本发明的保护范围内。
在本发明的一个可选示例中，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端是通过在所述多肽或蛋白的信号肽的C端加上一个半胱氨酸实现的。在本发明的另一个可选示例中，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端是通过蛋白酶特异性识别序列实现的，例如烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus, TEV）的蛋白酶能识别氨基酸序列ENLYFQC生成带N端半胱氨酸蛋白，通过将ENLYFQC导入至多肽或蛋白的序列中，该序列经过TEV识别后，该多肽或蛋白的N端为半胱氨酸。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸可作为赖氨酸的侧链，例如为N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸。在本发明的一个可选示例中，所述多肽或蛋白的半胱氨酸是通过将N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸导入所述多肽或蛋白上实现的。在本发明的一个可选实施例中，所述导入的位点可根据多肽或蛋白的序列进行调整，具体位置不受限制，均在本发明的保护范围内。在本发明的一个可选实施例中，所述导入的位点基本上不影响所述多肽或蛋白的活性。
根据本发明的实施例，所述含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸位于所述多肽或蛋白的任意位点。由此，使用非天然氨基酸能够被导入蛋白质中的各个位置，使标记的位点不受限制。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种对多肽或蛋白进行修饰的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一方面所述的化合物、所述多肽或蛋白、以及还原剂进行缩合反应；所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。由前可知，第一方面的化合物可作为蛋白修饰物标记蛋白，其与1,2-氨基硫醇进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰。因此，当多肽或蛋白中含有N端半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸，上述化合物可与N端半胱氨酸或非天然氨基酸进行缩合反应，实现对蛋白质位点的特异性修饰，尤其是可进行多色标记，实现细胞膜蛋白多重标记，为蛋白质的研究提供基础。
根据本发明的实施例，所述多肽或蛋白包括N端半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。
根据本发明的实施例，所述缩合反应是在溶液中进行的。
根据本发明的实施例，所述溶液包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和HEPES。
根据本发明的实施例，所述NaCl在所述溶液中的浓度为130~150 mM。
根据本发明的实施例，所述KCl在所述溶液中的浓度为2~3 mM。
根据本发明的实施例，所述CaCl2在所述溶液中的浓度为1.5~2 mM。
根据本发明的实施例，所述MgCl2在所述溶液中的浓度为0.5~2 mM。
根据本发明的实施例，所述HEPES在所述溶液中的浓度为10~30 mM。根据本发明的实施例，所述溶液的pH值为7.3~7.5。
根据本发明的实施例，所述还原剂选自能还原二硫键的化合物，包括但不限于TCEP、DTT、GSH等。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端。在本发明的一个可选示例中，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端是通过在所述多肽或蛋白的信号肽的C端加上一个半胱氨酸实现的。在本发明的另一个可选示例中，所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端是通过蛋白酶特异性识别序列实现的，例如烟草蚀纹病毒（tobacco etchvirus, TEV）的蛋白酶能识别氨基酸序列ENLYFQC生成带N端半胱氨酸蛋白，通过将ENLYFQC导入至多肽或蛋白的序列中，该序列经过TEV识别后，该多肽或蛋白的N端为半胱氨酸。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸可作为赖氨酸的侧链，例如为N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸。在本发明的一个可选示例中，所述多肽或蛋白的半胱氨酸是通过将N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸导入所述多肽或蛋白上实现的。在本发明的一个可选实施例中，所述导入的位点可根据多肽或蛋白的序列进行调整，具体位置不受限制，均在本发明的保护范围内。在本发明的一个可选实施例中，所述导入的位点基本上不影响所述多肽或蛋白的活性。
根据本发明的实施例，所述含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸位于所述多肽或蛋白的任意位点。由此，使用非天然氨基酸能够被导入蛋白质中的各个位置，使标记的位点不受限制。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种细胞膜蛋白多重标记的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1）采用第三方面所述的方法对所述细胞的多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；或者2）采用第三方面所述的方法对所述细胞的一个或多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；以及采用CuAAC法和/或IEDDA法对所述细胞的第二膜蛋白进行标记，所述第二膜蛋白中标记的可检测基团和所述第一膜蛋白中标记的可检测基团不同。
在本发明的一个可选实施例中，如图9所示，所述方法可对细胞膜蛋白进行四重标记，其中包含采用第三方面所述的方法对细胞的两个第一膜蛋白进行两重标记、以及采用TAMM+CuAAC和TAMM+ tetrazine ligation对细胞的另外两个第一膜蛋白进行两重标记，具体实施方法可参考实施例2~6。
根据本发明实施例的方法，发明中第一方面所述的化合物参与的缩合反应（简称TAMM缩合反应）本身可以重复使用来标记非天然氨基酸上的1,2-氨基硫醇和透过序列特异性蛋白酶产生的1,2-氨基硫醇，实现多色标记。另外，本发明中TAMM缩合反应与常见的生物正交反应（如CuAAC和IEDDA等）不互相干扰，还可以联用来实现多色标记，其可结合另外不同的生物正交反应。因此，本发明的方法可用于活细胞膜蛋白多重标记。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：TAMM染料偶联物的制备
1、Cy5-TAMM-SCH2CF3的制备
（1）将4-(2,2-二氰基-1-羟基乙烯基)苯甲酸甲酯（571 mg，2.50 mmol）溶于四氢呋喃（10 mL）中并置于圆底烧瓶，随后加入氢氧化钠水溶液（1 N，10 mL），于室温下搅拌12小时，接着以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃。加入浓盐酸，调节pH至1~2，随后加入乙酸乙酯（3 × 100 mL）进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水（3×50 mL）进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到化合物2（312 mg，1.46 mmol，58%）。
（2）将化合物2（536 mg，2.50 mmol）和五氯化磷（2606 mg，12.5 mmol）至100 mL反应瓶中，在氮气氛围中加入乙腈（40 mL），在油浴加热下于60 °C反应6小时。冷却至室温，减压蒸馏浓缩除去溶剂。残余物溶于二氯甲烷（60 mL），先后以水（3 × 20 mL）及饱和食盐水（20 mL）进行洗涤，收集有机相，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，减压除去溶剂得化合物3。（3）将化合物3粗品溶于50%的乙腈水溶液中（10 mL），于室温搅拌30分钟后，依次加入碳酸氢钠（1.05 g，12.5 mmol）和三氟乙硫醇（447 μL，3.00 mmol）或对应的硫醇。室温搅拌反应4小时后，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，用浓盐酸调pH至3-4，加入乙酸乙酯（3×20 mL）进行萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化得化合物4（359 mg，1.15 mmol，46%）。
1H NMR (300 MHz, CH3OD) δ 8.14 (d,J= 7.9 Hz, 2H), 7.57 (d,J= 8.1 Hz,2H), 3.42 (q,J= 9.5 Hz, 2H).
13C NMR (101 MHz, CH3OD) δ176.2, 166.9, 135.3, 134.7, 130.4, 129.1,124.3 (q,J= 272.6 Hz), 111.6, 111.1, 83.7, 34.6 (q,J= 34.3 Hz).
此外，采用步骤（3）类似的方法制备如下化合物：
（4）将化合物4（156 mg，0.50 mmol）溶于乙腈中（5 mL），依次加入N-羟基丁二酰亚胺（115.1 mg，1.0 mmol）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（288 mg，1.5mmol）、4-二甲氨基吡啶（12 mg，0.1 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（1.74 mL，1.0 mmol），室温搅拌4小时后，减压蒸馏浓缩除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化得化合物5（66 mg，0.16mmol，32%）。
（5）取化合物5（30 mg，0.07 mmol）溶于乙腈中（2 mL），依次加入碳酸氢钠（11.8mg，0.14 mmol）和化合物6（45 mg，0.08 mmol），室温下反应4小时后，减压蒸馏除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化得化合物7（18 mg，0.02 mmol，29%）。
（6）取化合物7（18 mg，0.02 mmol）溶解在氯化氢的二氧六环溶液中（4 N，1 mL），室温反应2小时后减压蒸馏浓缩除去溶剂，再溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液（1 mL）、N,N-二异丙基乙胺（6.5 μL，72 μmol）和染料溶液。染料溶液为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（12 mg，36 μmol）或其它带有羧酸的染料、N,N-二甲基甲酰胺（2 mL）和N,N-二异丙基乙胺（13 μL，72 μmol）在室温反应2小时的混合物。室温反应12小时后，减压除去溶剂，残余物溶于甲醇，反相高效液相色谱纯化得化合物9（10 mg，7 μmol，35%），进一步采用LC-MS（液相色谱-质谱）与NMR（核磁共振谱）两种常规的方法对化合物进行检测，结果显示化合物9合成正确，其中LC-MS图谱参见图1。
2、其它化合物（或称TAMM染料偶联物）的制备，具体制备方法参见本发明的步骤1，区别仅在于R1基团（即步骤（3）中三氟乙硫醇）和可检测基团（即步骤（6）中染料溶液）不同，并采用LC-MS与NMR两种常规的方法对各化合物进行检测，结果显示各化合物均合成正确。其中，制备的TAMM染料偶联物及其结构表征如下表所示：
实施例2：引入半胱氨酸或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸到目标蛋白的方法
1、通过改变信号肽序列于目标蛋白上引入1,2-氨基硫醇
膜蛋白前面的信号肽序列，在通过膜时会被膜上的肽酶切除，因此在该序列之后加上一个半胱氨酸，此半胱氨酸将成为该膜蛋白的第一个氨基酸，具有1,2-氨基硫醇结构，能被TAMM染料偶联物标记。
以Nlgn3膜蛋白为例（UniProt: Q8BYM5），其共有825个氨基酸，1-34个氨基酸为信号肽，在第34和35个氨基酸之间插入半胱氨酸则可产生带有N端半胱氨酸的Nlgn3蛋白，同时为方便使用免疫印迹法检测目标蛋白的表达，在半胱氨酸之后加上了HA标签的序列，得到的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
MWLQPSLSLSPTPTVGRSLCLTLGFLSLVLRASTCQYPYDVPDYAAPAPTVNTHFGKLRGARVPLPSEILGPVDQYLGVPYAAPPIGEKRFLPPEPPPSWSGIRNATHFPPVCPQNIHTAVPEVMLPVWFTANLDIVATYIQEPNEDCLYLNVYVPTEDGSGAKKQGEDLADNDGDEDEDIRDSGAKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSVLASYGNVIVITLNYRVGVLGFLSTGDQAAKGNYGLLDQIQALRWVSENIAFFGGDPRRITVFGSGIGASCVSLLTLSHHSEGLFQRAIIQSGSALSSWAVNYQPVKYTSLLADKVGCNVLDTVDMVDCLRQKSAKELVEQDIQPARYHVAFGPVIDGDVIPDDPEILMEQGEFLNYDIMLGVNQGEGLKFVEGVVDPEDGVSGTDFDYSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTDWADRDNPETRRKTLVALFTDHQWVEPSVVTADLHARYGSPTYFYAFYHHCQSLMKPAWSDAAHGDEVPYVFGVPMVGPTDLFPCNFSKNDVMLSAVVMTYWTNFAKTGDPNKPVPQDTKFIHTKANRFEEVAWSKYNPRDQLYLHIGLKPRVRDHYRATKVAFWKHLVPHLYNLHDMFHYTSTTTKVPPPDTTHSSHITRRPNGKTWSTKRPAISPAYSNENAPGSWNGDQDAGPLLVENPRDYSTELSVTIAVGASLLFLNVLAFAALYYRKDKRRQEPLRQPSPQRGTGAPELGTAPEEELAALQLGPTHHECEAGPPHDTLRLTALPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTITMIPNSLVGLQTLHPYNTFAAGFNSTGLPHSHSTTRV（SEQ ID NO: 1）。
2、通过非天然氨基酸于目标蛋白上引入1,2-氨基硫醇
基因密码子拓展技术通过在细胞内表达正交的氨酰-tRNA合成酶和解码UAG密码子的正交tRNA，可以实现位点特异性地将非天然氨基酸插入目标蛋白质中，其中N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸具有1,2-氨基硫醇官能团，可以用于TAMM缩合反应，该非天然氨基酸可被吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/吡咯赖氨酸tRNA（PylRS/tRNA）或其序列的突变体识别。
其中，插入N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的正交氨酰-tRNA合成酶具有如SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列。插入N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的正交tRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。采用如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列表达带有N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的Nlgn3膜蛋白。
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL（SEQ ID NO: 2）。
GGAAACCTGATCATGTAGATCGAACGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCG（SEQ ID NO: 3）。
ATGTGGCTGCAGCCCTCGCTGTCCCTGAGCCCCACGCCCACAGTTGGCCGGAGCCTGTGCCTCACCCTGGGCTTCCTCAGTTTGGTGCTGAGGGCCAGTACCTAGCAGTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTGCCCCGGCACCCACAGTCAATACTCACTTTGGGAAGCTAAGGGGTGCCAGAGTACCATTGCCCAGTGAAATCCTGGGTCCTGTGGACCAATACCTGGGGGTACCCTACGCAGCTCCCCCGATCGGCGAGAAACGTTTCCTGCCCCCTGAACCACCCCCATCCTGGTCGGGCATCCGGAACGCCACACACTTTCCCCCAGTGTGCCCCCAGAACATCCACACAGCTGTGCCCGAAGTCATGCTGCCAGTCTGGTTCACTGCCAACTTGGATATCGTCGCCACTTATATCCAGGAGCCCAACGAAGATTGCCTCTATCTGAATGTGTATGTGCCCACGGAAGATGGATCCGGCGCTAAGAAACAGGGCGAGGACTTAGCGGATAATGACGGGGATGAAGATGAAGACATCCGAGACAGTGGTGCTAAACCTGTCATGGTCTACATCCACGGAGGCTCTTACATGGAAGGAACAGGCAACATGATTGATGGCAGTGTTCTTGCAAGTTACGGCAACGTCATCGTCATCACCCTCAACTATCGGGTCGGGGTGCTAGGTTTCCTGAGCACTGGAGATCAGGCTGCCAAGGGCAACTATGGGCTCCTTGATCAAATCCAGGCCCTTCGCTGGGTGAGTGAGAATATTGCCTTCTTTGGAGGAGATCCCCGTAGAATTACTGTCTTTGGCTCTGGCATCGGTGCATCCTGTGTCAGTCTCCTTACACTGTCTCATCATTCTGAGGGGCTTTTCCAGAGGGCCATCATCCAAAGTGGCTCTGCTCTATCTAGCTGGGCTGTGAACTACCAACCAGTGAAGTATACCAGCTTGCTGGCAGACAAAGTGGGCTGTAACGTCCTGGACACTGTGGATATGGTGGATTGTCTTCGACAAAAGAGTGCCAAGGAGCTGGTAGAACAGGACATTCAGCCAGCCCGCTACCATGTGGCTTTTGGCCCTGTGATTGATGGTGATGTCATTCCTGATGACCCTGAGATCCTTATGGAGCAGGGAGAGTTCCTCAACTATGATATCATGCTAGGCGTCAACCAGGGTGAGGGTCTCAAGTTTGTGGAAGGGGTGGTGGACCCCGAGGATGGTGTCTCGGGCACTGACTTTGACTACTCTGTCTCCAATTTTGTGGACAATCTGTATGGCTATCCTGAGGGTAAGGACACCCTGCGGGAGACTATCAAGTTCATGTATACGGACTGGGCAGACCGAGACAACCCTGAGACCCGCCGTAAAACACTGGTGGCACTCTTCACTGACCACCAGTGGGTGGAGCCTTCAGTGGTGACAGCCGATCTGCACGCCCGCTATGGCTCACCTACCTACTTCTACGCCTTCTACCATCACTGCCAGAGCCTCATGAAGCCCGCATGGTCAGATGCAGCACACGGGGATGAAGTGCCCTATGTTTTTGGTGTCCCTATGGTAGGTCCCACTGACCTTTTCCCCTGCAACTTCTCCAAGAATGATGTTATGCTCAGTGCTGTCGTCATGACCTATTGGACCAACTTTGCCAAGACCGGGGATCCCAACAAGCCGGTACCCCAGGATACCAAGTTCATTCACACCAAGGCCAACCGCTTTGAGGAAGTGGCCTGGTCCAAATACAATCCCCGAGACCAGCTCTACCTTCACATCGGGCTGAAACCAAGGGTTCGTGATCATTACCGGGCCACAAAGGTAGCCTTTTGGAAACACCTGGTGCCCCACCTGTACAACCTGCATGACATGTTCCACTATACATCCACGACCACCAAAGTGCCGCCCCCGGACACCACCCACAGCTCCCACATCACCCGTAGGCCCAACGGCAAGACCTGGAGCACCAAGCGGCCGGCGATTTCACCTGCCTACAGCAATGAGAATGCCCCTGGGTCCTGGAATGGGGACCAGGATGCGGGGCCACTCCTGGTTGAGAACCCTCGAGACTACTCCACTGAATTAAGTGTCACTATCGCTGTGGGGGCCTCCCTCCTGTTTCTCAATGTGTTGGCCTTTGCTGCCCTCTATTACCGTAAGGACAAACGGCGCCAGGAGCCCCTGAGGCAGCCTAGCCCCCAAAGGGGAACTGGTGCCCCTGAATTGGGAACTGCTCCGGAGGAGGAGCTGGCAGCATTACAGTTGGGTCCCACTCACCATGAATGTGAGGCCGGTCCCCCACATGACACACTTCGCCTCACAGCACTGCCCGACTATACCCTGACCCTGCGGCGCTCCCCTGATGACATCCCACTCATGACTCCCAACACCATCACTATGATTCCTAATTCCCTGGTTGGGTTGCAGACCTTGCACCCCTATAACACCTTTGCCGCAGGGTTCAACAGTACTGGGCTGCCCCACTCACACTCCACTACCCGTGTA（SEQ ID NO:4）。
3、通过蛋白酶的特异性识别序列于目标蛋白上引入1,2-氨基硫醇
序列特异性蛋白酶可以识别一段特定的氨基酸序列，在切割之后产生带有N端半胱氨酸的蛋白质，例如TEV蛋白酶能识别氨基酸序列ENLYFQ↑C，其中箭头代表切割位点。其中，带有TEV蛋白酶识别序列的Nlgn3膜蛋白具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
MWLQPSLSLSPTPTVGRSLCLTLGFLSLVLRASTQENLYFQCYPYDVPDYAAPAPTVNTHFGKLRGARVPLPSEILGPVDQYLGVPYAAPPIGEKRFLPPEPPPSWSGIRNATHFPPVCPQNIHTAVPEVMLPVWFTANLDIVATYIQEPNEDCLYLNVYVPTEDGSGAKKQGEDLADNDGDEDEDIRDSGAKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSVLASYGNVIVITLNYRVGVLGFLSTGDQAAKGNYGLLDQIQALRWVSENIAFFGGDPRRITVFGSGIGASCVSLLTLSHHSEGLFQRAIIQSGSALSSWAVNYQPVKYTSLLADKVGCNVLDTVDMVDCLRQKSAKELVEQDIQPARYHVAFGPVIDGDVIPDDPEILMEQGEFLNYDIMLGVNQGEGLKFVEGVVDPEDGVSGTDFDYSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTDWADRDNPETRRKTLVALFTDHQWVEPSVVTADLHARYGSPTYFYAFYHHCQSLMKPAWSDAAHGDEVPYVFGVPMVGPTDLFPCNFSKNDVMLSAVVMTYWTNFAKTGDPNKPVPQDTKFIHTKANRFEEVAWSKYNPRDQLYLHIGLKPRVRDHYRATKVAFWKHLVPHLYNLHDMFHYTSTTTKVPPPDTTHSSHITRRPNGKTWSTKRPAISPAYSNENAPGSWNGDQDAGPLLVENPRDYSTELSVTIAVGASLLFLNVLAFAALYYRKDKRRQEPLRQPSPQRGTGAPELGTAPEEELAALQLGPTHHECEAGPPHDTLRLTALPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTITMIPNSLVGLQTLHPYNTFAAGFNSTGLPHSHSTTRV（SEQ ID NO:5）。
4、TAMM缩合可以和其它生物正交反应联用（如CuAAC和IEDDA），来实现多色荧光标记；也可以通过分别将N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸和TEV蛋白酶识别序列导入两个目标蛋白，接着进行第一次TAMM缩合反应标记带有N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的目标蛋白，然后进行TEV蛋白酶处理和第二次TAMM缩合反应，实现多色荧光标记。
其中，基因密码子拓展技术可以将带有生物正交官能团的非天然氨基酸插入哺乳动物细胞所表达的目标蛋白质中，例如P-炔丙基-L-苯丙氨酸带有末端炔官能团，可以进行CuAAC反应；双环[6.1.0]壬炔-L-赖氨酸带有环辛炔官能团，可以进行IEDDA反应。
CuAAC反应中，插入P-炔丙基-L-苯丙氨酸的正交氨酰-tRNA合成酶具有如SEQ IDNO: 6所示的氨基酸序列。插入P-炔丙基-L-苯丙氨酸的正交tRNA具有如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列。采用如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列表达带有N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的Nlgn3膜蛋白。
MASSNLIKQLQERGLVAQVTDEEALAERLAQGPIALSCGFDPTADSLHLGHLVPLLCLKRFQQAGHKPVALVGGATGLIGDPSFKAAERKLNTEETVQEWVDKIRKQVAPFLDFDCGENSAIAANNYDWFGNMNVLTFLRDIGKHFSVNQMINKEAVKQRLNREDQGISFTEFSYNLLQGYTMACVNKQYGVVLQIGGSDQWGNITSGIDLTRRLHQNQVFGLTVPLITKADGTKFGKTEGGAVWLDPKKTSPYKFYQFWINTARADVYRFLKFFTFMSIEEINALEEEDKNSGKAPRAQYVLAEQVTRLVHGEEGLQAAKRITECLFSGSLSALSEADFEQLAQDGVPMVEMEKGADLMQALVDSELQPSRGQARKTIASNAITINGEKQSDPEYFFKEEDRLFGRFTLLRRGKKNYCLICWKGPV（SEQ ID NO:6）。
GGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCTTTGGGTTCGGCGGTTCGAATCCGTCCCCCTCCA（SEQ ID NO:7）。
IEDDA反应中，插入双环[6.1.0]壬炔-L-赖氨酸的正交氨酰-tRNA合成酶具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。插入双环[6.1.0]壬炔-L-赖氨酸的正交tRNA具有如SEQID NO: 3所示的核苷酸序列。采用如SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列表达带有N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的Nlgn3膜蛋白。
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLANYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVFGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL（SEQ ID NO:8）。
实施例3：利用蛋白胶的荧光成像验证TAMM染料偶联物和带有N端半胱氨酸目标蛋白质的特异性标记
（1）构建表达带有N端半胱氨酸目标蛋白的载体：本发明示例性地展示一种带有N端半胱氨酸的Nlgn3蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示），将对应的核苷酸序列进行人工合成，然后克隆至载体质粒pCMV上Bsp120I和NotI酶切位点之间，得到表达N端半胱氨酸Nlgn3的质粒。
（2）细胞转染：取24孔板，用0.01%聚赖氨酸润洗，弃去液体，晾干孔板，随后加入0.5 mL细胞液（约17万细胞）至孔板中，轻轻拍打孔板两侧和对角，使细胞分布均匀，放置培养箱中37 °C培养。第二天当细胞密度达70-80%时转染，用DMEM（50 μL/孔）稀释对应的转染体系（取25 μL DMEM，加入500 ng本实施例步骤（1）中的质粒），再用DMEM（25 μL/孔）稀释DNA 转染试剂PolyJet（1.5 μL/孔），将稀释的PolyJet加入到质粒稀释液中，室温孵育15分钟后加入24孔板中，8小时后换液。
（3）染色：本发明示例性地展示使用实施例1制备得到的TAMM染料偶联物（本实施例中示例性展示Cy5-TAMM-SCH2CF3和Cy5-TAMM-SPhF）来标记目标蛋白，首先准备母液100mM TCEP和不同浓度的Cy5-TAMM-SCH2CF3或Cy5-TAMM-SPhF，分别取4 μL TCEP和0.4 μLTAMM染料偶联物加入至195.6 μL LICS（140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, 20 mM HEPES, pH=7.4）溶液中混匀，加至步骤（2）中含有细胞的孔中孵育10min，其中TAMM染料偶联物的终浓度参见图5。孵育完成后，弃去染色液，用LCIS洗细胞两次（每次10分钟）。
（4）蛋白胶的荧光成像：每孔加入50 μL RIPA裂解液（Sigma, R0278）和0.5 μL蛋白酶抑制剂（雅酶GRF101），冰上孵育10分钟，然后用移液枪头把细胞从孔板中刮下，收集至1.5 mL离心管中，4 °C离心10分钟（13000 rcf），取40 μL上清液，加入15 μL上样缓冲液（Invitrogen, B0007），95 °C孵育5分钟。取10 μL样品加到4-20% TriGlycine SDS-PAGE，电泳90 V下80分钟，接着使用凝胶成像仪检测荧光信号。
（5）蛋白免疫印记：将胶上的蛋白转到膜上，膜在5% PBST脱脂牛奶溶液中孵育1小时，加入识别HA标签的抗体（ABclonal, AE008）的脱脂牛奶溶液（1:1000）在4 ℃孵育过夜。用PBST洗膜三次（每次5分钟），加入HRP的二抗（ABclonal, AS003）的脱脂牛奶溶液（1:20000）室温孵育1小时。PBST洗膜三次（每次5分钟），加显色液成像。
检测结果参见图5，结果显示，Cy5-TAMM-SCH2CF3和Cy5-TAMM-SPhF均可标记Nlgn3蛋白。
实施例4：共聚焦显微镜验证TAMM染料偶联物和带有N端半胱氨酸目标蛋白质的特异性标记
参照实施例3中（1）和（2），将表达N端半胱氨酸Nlgn3（氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示）的质粒（即C-HA-Nlgn3-mCherry质粒）转染到HEK293T细胞中，24小时后转移到共聚焦成像板，具体步骤为：首先取24孔玻底共聚焦培养板，用0.01%聚赖氨酸润洗，弃去液体，晾干孔板，将转染细胞的旧培养液吸除，PBS润洗后消化细胞转移于1.5 ml EP管内，400 rcf离心5分钟，弃掉上清液，加入500 μL培养液重悬，随后将共聚焦板加入0.5 mL细胞液（约17万细胞）至孔板中，轻轻拍打孔板两侧和对角，使细胞分布均匀，放置培养箱中37 °C培养。
培养的第二天当细胞密度达70-80%时，参照实施例2中步骤（3）进行染色，即，分别采用实施例1制备得到的Cy5-TAMM-SEt和Cy5-TAMM-SCH2CF3标记上述得到的带有N端半胱氨酸的Nlgn3蛋白，接着进行蛋白胶的荧光成像、蛋白免疫印记和共聚焦成像检测。其中，TAMM染料偶联物的终浓度和孵育时间，参见图6。
将染过色的细胞用4%的多聚甲醛进行固定，每孔加入200 μL固定液固定15分钟，固定结束后吸除固定液，用PBS洗去残留固定液（洗三次，每次5分钟），洗涤结束后用激光共聚焦显微镜进行成像。
检测结果参见图6，结果显示，2μM Cy5-TAMM-SEt标记的Nlgn3蛋白几乎检测不到荧光标记；而0.2 μM和2 μM的Cy5-TAMM-SCH2CF3标记的Nlgn3蛋白均可检测到荧光标记。因此，可进一步说明，相较于TAMM染料偶联物中的R1为烷基，TAMM染料偶联物中的R1为被卤素取代的C1~6烷基、任选被R1a取代的6~10元芳香基、或任选被R1a取代的5~10元杂芳香基，该TAMM染料偶联物具有更优的蛋白标记能力。
实施例5：联用TAMM缩合和另一种生物正交反应来进行双色荧光标记
1、TAMM+CuAAC
（1）构建表达正交氨酰-tRNA合成酶/正交tRNA的载体，用于位点特异性插入非天然氨基酸：P-炔丙基-L-苯丙氨酸可用于CuAAC生物正交反应，插入此氨基酸需要于细胞中表达如SEQ ID NO: 6所示的正交合成酶和如SEQ ID NO: 7所示的正交tRNA。
（2）构建表达带有非天然氨基酸的目标蛋白的载体：本发明示例性地展示一种带有非天然氨基酸的Nlgn3蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示），将表达该Nlgn3蛋白的核苷酸序列（核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示）进行人工合成，然后克隆至载体质粒pCMV上Bsp120I和NotI酶切位点之间。
MWLQPSLSLSPTPTVGRSLCLTLGFLSLVLRASTXQYPYDVPDYAAPAPTVNTHFGKLRGARVPLPSEILGPVDQYLGVPYAAPPIGEKRFLPPEPPPSWSGIRNATHFPPVCPQNIHTAVPEVMLPVWFTANLDIVATYIQEPNEDCLYLNVYVPTEDGSGAKKQGEDLADNDGDEDEDIRDSGAKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSVLASYGNVIVITLNYRVGVLGFLSTGDQAAKGNYGLLDQIQALRWVSENIAFFGGDPRRITVFGSGIGASCVSLLTLSHHSEGLFQRAIIQSGSALSSWAVNYQPVKYTSLLADKVGCNVLDTVDMVDCLRQKSAKELVEQDIQPARYHVAFGPVIDGDVIPDDPEILMEQGEFLNYDIMLGVNQGEGLKFVEGVVDPEDGVSGTDFDYSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTDWADRDNPETRRKTLVALFTDHQWVEPSVVTADLHARYGSPTYFYAFYHHCQSLMKPAWSDAAHGDEVPYVFGVPMVGPTDLFPCNFSKNDVMLSAVVMTYWTNFAKTGDPNKPVPQDTKFIHTKANRFEEVAWSKYNPRDQLYLHIGLKPRVRDHYRATKVAFWKHLVPHLYNLHDMFHYTSTTTKVPPPDTTHSSHITRRPNGKTWSTKRPAISPAYSNENAPGSWNGDQDAGPLLVENPRDYSTELSVTIAVGASLLFLNVLAFAALYYRKDKRRQEPLRQPSPQRGTGAPELGTAPEEELAALQLGPTHHECEAGPPHDTLRLTALPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTITMIPNSLVGLQTLHPYNTFAAGFNSTGLPHSHSTTRV（SEQ ID NO:9）。其中，X为P-炔丙基-L-苯丙氨酸。
参照实施例3步骤（1）的方法构建表达带有N端半胱氨酸目标蛋白的载体。
（3）参照实施例3中步骤（2）的方法，将表达正交氨酰-tRNA合成酶/正交tRNA的载体、表达带有非天然氨基酸的目标蛋白的载体和表达带有N端半胱氨酸目标蛋白的载体转染HEK293T细胞。
（4）参照实施例3中步骤（3）的方法，先对HEK293T细胞进行染色，10min后，进行CuAAC染色。CuAAC染色时使用CuSO4(1 mM, 20 μL)、无酶水（61 μL）、BTTAA（500 μM, 100 μL）、PBS (20x, 10 μL)、FITC-N3(100 μM, 4 μL)和抗坏血酸钠溶液（100 mM, 5 μL）的混合溶液，孵育时间为10分钟。参照实施例4进行细胞成像。
2、TAMM+ tetrazine ligation（即四嗪连接反应）
（1）构建表达正交氨酰-tRNA合成酶/正交tRNA的载体，用于位点特异性插入非天然氨基酸：双环[6.1.0]壬炔-L-赖氨酸可用于IEDDA生物正交反应，插入此氨基酸需要于细胞中表达如SEQ ID NO: 8所示的正交合成酶和如SEQ ID NO: 3所示的正交tRNA。
（2）参见本实施例步骤1中的第（2）步。
（3）参见本实施例步骤1中的第（3）步。
（4）参照实施例3中步骤（3）的方法，先对HEK293T细胞进行染色，10min后，进行IEDDA染色。IEDDA染色时使用Cy3-tetrazine (简称Cy3-四嗪，100 μM, 4 μL)和LICS (196μL)的混合溶液，孵育时间为10min。参照实施例4进行细胞成像。
TAMM+CuAAC和TAMM+ tetrazine ligation的检测结果参见图7。结果表明，本实施例中的两种方式均可对膜蛋白进行双色荧光标记。
实施例6：重复TAMM缩合反应来实现双色荧光标记的案例
（1）构建位点特异性插入N6-(D-半胱氨酰)-L-赖氨酸的载体：插入此氨基酸需要于细胞中表达如SEQ ID NO: 2所示的正交合成酶和如SEQ ID NO: 3所示的正交tRNA。
（2）构建表达带有TEV蛋白酶识别序列目标蛋白的载体：本发明示例性地展示一种带有TEV蛋白酶识别序列的Nlgn3膜蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示），将对应的核苷酸序列进行人工合成，然后克隆至载体质粒pCMV上Bsp120I和NotI酶切位点之间。
参照实施例3步骤（1）的方法构建表达带有N端半胱氨酸目标蛋白的载体。
（3）参照实施例3中（2）的方法，将表达正交氨酰-tRNA合成酶/正交tRNA的载体、表达带有TEV蛋白酶识别序列目标蛋白的载体和表达带有N端半胱氨酸目标蛋白的载体转染HEK293T细胞。
（4）参照实施例3中步骤（3）的方法，先对HEK293T细胞进行染色；30分钟后，同时进行TEV酶切和染色，采用20 μL TEV酶（Beyotime, P2308）和Cy3-TAMM-SCH2CF3染色液孵育，孵育时间为60分钟。参照实施例4进行细胞成像。
检测结果参见图8。结果表明，本实施例中重复TAMM缩合反应可对膜蛋白进行双色荧光标记。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种化合物，其特征在于，具有式(I)所示的结构：
(I)，
其中，R1为被卤素取代的C1~6烷基、被卤素取代的6~10元芳香基；
R2为被R2a取代的6~10元亚芳香基、或被R2a取代的5~10元亚杂芳香基；
R3为空或可检测基团；
所述可检测基团选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、花菁染料、IR染料、吖啶染料、香豆素染料、或BODIPY；
L1为空、或，n为0~20之间的任意整数；
每个R2a各自独立地选自H、卤素、-OH、-C(O)OH、-NO2、-CN、-C1~6烷基、或-C1~6氧烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被卤素取代的6~8元芳香基；
R2为被R2a取代的6~10元芳香基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为被卤素取代的C1~3烷基、被卤素取代的6~7元芳香基；
R2为被R2a取代的6~8元芳香基；
n为5~15之间的任意整数。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为被F取代的C1~3烷基、被F取代的6~8元芳香基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1选自-CF3、-CCl3、-CBr3、-CH2CF3、-CH2CCl3、-CH2CBr3、-CF2CF3、-CCl2CCl3、-CBr2CBr3、-CF2CCl3、-CF2CBr3、-CCl2CF3、-CCl2CBr3、-CBr2CF3、-CBr2CCl3、、/>、/>、/>；
R2为、/>、/>。
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构：
、/>。
7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构：
、、/>、。
8.权利要求1~7任一项所述的化合物在对多肽修饰或蛋白修饰中的用途，其特征在于，所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。
9.一种对多肽或蛋白进行修饰的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1~7任一项所述的化合物和所述多肽或蛋白进行缩合反应；
所述多肽或蛋白包括半胱氨酸、或含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述半胱氨酸位于所述多肽或蛋白的N端；
所述含有1,2-氨基硫醇的非天然氨基酸位于所述多肽或蛋白的任意位点。
11.一种细胞膜蛋白多重标记的方法，其特征在于，包括：
1）采用权利要求9~10任一项所述的方法对所述细胞的多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；或者
2）采用权利要求9~10任一项所述的方法对所述细胞的一个或多个第一膜蛋白进行标记，多个所述第一膜蛋白中标记的蛋白位点和可检测基团均不同；以及
采用CuAAC法和/或IEDDA法对所述细胞的第二膜蛋白进行标记，所述第二膜蛋白中标记的可检测基团和所述第一膜蛋白中标记的可检测基团不同。
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