CN111253464A - 一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学医药领域，具体涉及一种γ‑谷氨酰转肽酶靶向的分子探针及其制备方法和用途，提供的一种γ‑谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，具有式(1)所示结构，特异靶向γ‑谷氨酰转肽酶，在体外细胞摄取和体内动物成像研究中均证明了该分子探针特异靶向肿瘤细胞或肿瘤组织中的高表达的γ‑谷氨酰转肽酶，可以用于细胞或荷瘤小鼠的GGT酶水平的检测，可用于制备γ‑谷氨酰转肽酶靶向的药物、药物载体或显像产品。

Description

一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及化学医药领域，具体涉及一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类生命健康，快速准确定位恶性肿瘤的研究促进了与肿瘤相关的生物标志物的发展。肿瘤特征酶作为最重要的肿瘤标志物之一，参与了多种生物代谢过程，因此，研究肿瘤特征酶具有重要临床价值。

γ-谷氨酰转肽酶(GGT)又称γ-谷氨酰转移酶，是一种在细胞膜表面表达的N端亲核水解酶，广泛存在于动物，植物及微生物体中。在真核生物中,它主要是以结合酶的形态存在。在一些高等哺乳动物体内，例如人体，它主要是结合在肾、胰、肝、脾和小肠等组织的微绒毛膜上，其含量分布大致为：w(肾)>w(胰)>w(肝)>w(脾)，尤其是肾中含量最多。正常人血液中的GGT主要来源于肝脏，少量由肾脏、胰腺与小肠产生，浓度约在3-50U/L之间。饮酒、疲劳、熬夜以及服用药物均会造成血液GGT水平轻度升高。GGT的表达在许多疾病中被诱导和错误定位，导致氧化还原稳态紊乱，最终导致疾病的病理改变，如当血液GGT水平大幅升高时，一般表现为肝脏的病变。因此，GGT的异常水平可以被认为是肝毒性、哮喘、糖尿病和细菌感染等多种疾病的一个有用的生物标志物。

GGT酶表达水平的异常升高在肿瘤学上也具有重要的意义。GGT的催化机制显示，GGT在生理条件下，可特异性催化降解来自于GSH或其他γ-谷氨酰化合物中的γ-谷氨酰基团，从而参与内源性谷胱甘肽的代谢和胞内半胱氨酸水平的变化，在维持细胞氧化还原平衡方面起着重要作用。目前，大量研究表明，GGT在许多恶性肿瘤，如肝，宫颈，结肠，肺，卵巢癌中高表达，GGT的异常产生与肿瘤的进展、侵袭和化疗耐药有关，已成为一个非常重要的肿瘤生物标志物。因此，活体内GGT酶活性的检测对相关疾病及早期肿瘤的诊断具有重要的意义。因此，开发一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，将有助于GGT酶活性的检测对相关疾病及早期肿瘤的诊断，具有重要的科研及临床价值。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针及其制备方法和用途。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，具有式(1)所示结构：

其中，R1为示踪基团，包括PET显像示踪基团或CT示踪基团中的一种；R2为-H、C1-C6的烷烃、或

进一步的，所述PET显像示踪基团包括：

-¹⁸F，

中的一种；

所述CT显像示踪基团包括：

中的一种。

进一步的，所述分子探针具有如下所示结构：

本发明提供了一种制备所述的分子探针¹⁸F-1-P的方法，包括：

化合物a1与化合物S经缩合反应，得到化合物a2；

化合物a2经过脱保护反应，得到化合物a3；

将化合物a3、2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和四(乙腈)铜(Ⅰ)六氟磷酸铜，经click点击缩合反应，得式1-P；

将式1-P进行¹⁸F标记，即得；

本发明提供了一种制备所述的分子探针¹⁸F-2-P的方法，包括：

化合物b1和化合物b2经缩合反应，得化合物b3；

化合物b3经脱保护反应，得化合物b4；

化合物b4和化合物S经缩合反应，得化合物b5；

化合物b5经脱保护反应，得化合物b6；

将化合物b6、2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和四(乙腈)铜(Ⅰ)六氟磷酸铜，经click点击缩合反应，得式2-P；

将式2-P进行¹⁸F标记，即得；

本发明提供了一种制备所述的分子探针3-P的方法，包括：

化合物c1和化合物c2经缩合反应，得到化合物c3；

化合物c3经脱保护反应，得到化合物c4；

化合物c4和化合物c5经缩合反应，得到化合物c6；

化合物c6经脱保护反应，得到化合物c7；

化合物c7和叔丁氧羰基-L-谷氨酸1叔丁脂经缩合反应，得到化合物c8；

化合物c8经脱保护反应，得到化合物c9；

化合物c9和三碘苯甲酸经缩合反应，得到化合物c10；

化合物c10经脱保护反应，得到3-P；

本发明提供了所述的γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针在制备γ-谷氨酰转肽酶靶向的药物、药物载体或显像产品中的用途

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，具有式(1)所示结构，特异靶向γ-谷氨酰转肽酶，在体外细胞摄取和体内动物成像研究中均证明了该分子探针特异靶向肿瘤细胞或肿瘤组织中的高表达的γ-谷氨酰转肽酶，可以用于细胞或动物体内的GGT酶水平的检测。

2.本发明提供的一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针在制备γ-谷氨酰转肽酶靶向的药物、药物载体或显像产品中的用途，由于所述分子探针特异靶向γ-谷氨酰转肽酶，可以将其用于制备治疗在病灶处异常表达γ-谷氨酰转肽酶的相关疾病的药物，也可以用于制备靶向在病灶处异常表达γ-谷氨酰转肽酶的相关疾病的药物载体，同时还可以用制备γ-谷氨酰转肽酶靶向的显像产品。

3.本发明提供的一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的PET显像剂，特异靶向γ-谷氨酰转肽酶高表达的肿瘤细胞和组织中，在GGT/GSH介导下，可产生分子间的环化和原位自组装，形成纳米结构，从而增加在肿瘤细胞中的积累和延长其滞留保留，增加肿瘤显像效果，从而能够实现高灵敏度，无创成像；探针¹⁸F-2-P为双靶向γ-谷氨酰转肽酶，且连接有两个放射性标记基团，肿瘤显像信号增强，灵敏度更高，显像效果更强。

4.本发明提供的一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的CT显像剂，特异靶向γ-谷氨酰转肽酶高表达的肿瘤细胞和组织中，在GGT/GSH介导下，可产生分子间的环化和原位自组装，形成纳米结构，从而增加在肿瘤细胞中的积累和延长其滞留保留，增加肿瘤显像效果，从而能够实现高灵敏度，无创成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中探针前体1-P的质谱分析图；

图2是本发明实施例1中探针前体1-P的高效液相色谱图；

图3是本发明实施例1中探针前体1-P的核磁共振氢谱图；

图4是本发明实施例1中探针前体1-P的核磁共振碳谱图；

图5是本发明实施例2中探针前体2-P的质谱分析图；

图6是本发明实施例2中探针前体2-P的高效液相色谱图；

图7是本发明实施例2中探针前体2-P的核磁共振氢谱图；

图8是本发明实施例2中探针前体2-P的核磁共振碳谱图；

图9是本发明实施例3中探针3-P的质谱分析图；

图10是本发明实施例3中探针3-P的高效液相色谱图；

图11是本发明实施例3中探针3-P的核磁共振氢谱图；

图12是本发明实施例3中探针3-P的核磁共振碳谱图；

图13是本发明实施例4中探针¹⁸F-1-P的放射性化学产率和纯度结果图；

图14是本发明实施例5中探针¹⁸F-2-P的放射性化学产率和纯度结果图；

图15是本发明实验例1中探针¹⁸F-1-P的体外稳定性检测结果图；

图16是本发明实验例1中探针¹⁸F-2-P的体外稳定性检测结果图；

图17是本发明实验例2中探针¹⁸F-1-P的细胞毒性检测结果图；图中(a)是在细胞HCT 116中孵育的检测结果；图中(b)是在细胞L929中孵育的检测结果；

图18是本发明实验例3中探针¹⁸F-1-P在细胞HCT 116或细胞L929中的细胞摄取结果图；

图19是本发明实验例3中探针¹⁸F-1-P和探针前体1-P混合物、探针¹⁸F-1-P、探针¹⁸F-1在细胞HCT 116中的细胞摄取结果图；

图20是本发明实验例3中探针¹⁸F-2-P和探针前体2-P混合物、探针¹⁸F-2-P在细胞HCT 116或细胞L929中的细胞摄取结果图；

图21是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型尾静脉注射¹⁸F-1、¹⁸F-1-P或¹⁸F-1-P与1-P共注射在不同时间点(10、30、45、60分钟)的PET成像；

图22是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型尾静脉注射¹⁸F-1后肿瘤摄取的时间依赖性曲线；

图23是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型尾静脉注射¹⁸F-1-P后肿瘤摄取的时间依赖性曲线；

图24是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型尾静脉共注射¹⁸F-1-P与1-P后肿瘤摄取的时间依赖性曲线；

图25是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型尾静脉注射¹⁸F-1或共注射¹⁸F-1-P与1-P后的肿瘤-肌肉比(T/M)定量分析；

图26是本发明实验例4中HCT 116肿瘤裸鼠模型中尾静脉注射¹⁸F-2-P或¹⁸F-2-P与2-P的PET成像；图中(a)为注射¹⁸F-2-P或¹⁸F-2-P与2-P共注射在不同时间点(10、25、45、60分钟)的PET成像；(b)分别注射¹⁸F-2-P或¹⁸F-2-P与2-P后肿瘤摄取的时间依赖性曲线；(c)注射¹⁸F-2-P或¹⁸F-2-P与2-P后的肿瘤-肌肉比(T/M)定量分析；

图27是本发明实验例5中探针3-P体外CT信号检测结果；

图28是本发明实验例6中探针3-P体内CT成像实验结果；图中(a)为CT成像图，(b)为CT图像定量分析。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂、细胞或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，如正己烷，乙酸乙酯，乙醚，三氟乙酸(TFA)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，N-甲基吗啉(NMM)，氯甲酸异丁酯(IBCF)，四氢呋喃(THF)，2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CBT)，正辛醇，三(2-苯并咪唑基甲基)胺(ligand)，六氟磷酸四(乙酸)铜(I)Cu(I)，哒嗪，2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐(AMBF3)，1-叔丁基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸(γ-Glu)，三碘苯甲酸(47mg)，1-羟基苯并三唑(HOBT)，N,N’-双(叔丁氧羰基)-L-胱氨酸。

下述实施例中使用的二氯甲烷、TFA、正己烷、乙酸乙酯、二甲亚砜均为分析纯。涉及的室温和常温的温度范围为20-25℃。

下述实施例中的化合物a1、b1按照文献报道[Lin,J.；Wang,W.；Li,K.；Huang,H.；Lv,G.；Peng,Y.；Luo,S.；Qiu,L.Development of a kit-like radiofluorinatedbiomolecule leading to a controlled self-assembly of(18)F nanoparticles for asmart PET imaging application.Chem Commun(Camb)2017,53,(48),6476-6479.]的方法制备。

下述实施例中涉及的细胞的培养：人结肠癌细胞株HCT 116，小鼠成纤维细胞株L929在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)，1％(v/v)青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM培养基中培养，培养皿保持在37℃含有5％CO₂的湿润环境中。培养基每隔一天更换一次，以维持细胞处于对数生长阶段。

实施例1探针前体1-P的合成

探针前体1-P如下式1-P所示结构：

探针前体1-P的合成路线如下所示：

具体制备方法，包括如下步骤：

(1)化合物a2的合成

将化合物a1(30mg,0.065mmol)和化合物s即1-叔丁基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸(γ-Glu,39.4mg,0.13mmol)置于5mL无水DMF中，超声使其完全溶解；然后依次加入缩合剂O-苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基尿嘧啶六氟磷酸盐(HBTU,49.3mg,0.13mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA,53μL,0.325mmol)来调节pH至8～9。将上述所得混合物在氮气保护下于室温中搅拌2小时。反应结束后，用旋转蒸发仪去除溶剂，粗产品通过硅胶吸附柱色谱法(柱子规格500ML/21*400M)(正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v:v))进行提纯后，得到化合物a2为白色固体(49mg，产率95.0％)。

(2)化合物a3的合成

将化合物a2溶于2mL的二氯甲烷中，然后加入等体积的TFA，室温搅拌0.5h以去除Boc和OtBu保护基团。反应完成后，旋干溶剂，产物经冰无水乙醚沉淀，真空干燥后得化合物a3为白色固体(28mg，产率为75.4％)。

(3)探针前体1-P的合成

将上述化合物a3溶于DMF:H₂O＝3mL:1mL的混合溶液中，然后向该体系中依次加入2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐(AMBF3,660μL,0.34mmol)，三(2-苯并咪唑甲基)胺(ligand,690μL,0.0068mmol)和四(乙腈)铜(Ⅰ)六氟磷酸铜(Cu(I),25mg,0.068mmol)，氮气保护下于45℃油浴1小时。旋干溶剂后，粗产品经制备型HPLC(t_R＝18min；柱子规格：Chrom-matrix C18柱5μm,10mm×250mm)纯化，分离条件见下表1，收集出峰流出液并干燥，得干燥的纯产品探针前体1-P(8mg，产率为15.1％)。探针前体1-P的质谱分析图、高效液相色谱图、核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图1-4所示.

表1 式1-P所示化合物的半制备型高效液相色谱分离条件

氢谱解析：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.64(s,1H),8.82(m,2H),8.44(d,J＝7.6Hz,1H),8.16(dd,J＝33.3,8.2Hz,3H),7.95(s,1H),7.86(d,J＝9.4Hz,1H),4.83(t,J＝6.7Hz,2H),4.72(q,J＝8.1Hz,1H),4.54(m,1H),3.82(m,1H),3.73(t,J＝6.7Hz,2H),3.20(d,J＝5.7Hz,2H),3.06(ddd,J＝18.9,13.8,7.0Hz,4H),2.96(d,J＝5.1Hz,6H),2.40(m,2H),2.03(s,2H),1.29(s,9H).

碳谱解析：¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.02,170.45,170.35,148.25,143.44,139.73,137.07,125.22,124.22,121.52,114.02,112.04,63.93,54.44,53.57,53.50,52.96,44.06,42.45,31.19,30.02,28.39,26.42.

实施例2探针前体2-P的合成

探针前体2-P如下式2-P所示的结构：

探针前体2-P的合成路线如下所示；

制备方法如下：

(1)化合物b3的合成

分别称取化合物b1(65mg,0.24mmol)，化合物b2即N,N’-双(叔丁氧羰基)-L-胱氨酸(43mg,0.098mmol)，HBTU(110mg,0.29mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBT,39mg,0.29mmol)于25mL的反应瓶中，加5mL干燥DMF溶液超声溶解，随后加入DIPEA(96μL,0.58mmol)调节pH至8-9，插入氮气球，氮气保护下于25℃反应4h。反应结束后，旋干溶剂，粗产品经柱层析法(柱子规格：500ML/21*400M)进行纯化，以正己烷/乙酸乙酯＝2：1(v:v)作为洗脱剂。真空干燥后得化合物b3为白色固体(90mg，产率97.4％)。

(2)化合物b4的合成

用DCM：TFA＝1：1(2mL:2mL)溶解化合物b3，常温反应1h以去除Boc保护基。反应结束后，旋干溶剂，加入适量的冰乙醚使产物沉淀，离心，弃去上清液，真空干燥1h后得化合物b4为白色粉末(60mg，产率84.7％)。

(3)化合物b5的合成

在25mL的反应瓶中，依次将化合物b4(60mg,0.081mmol)，化合物S即Boc-Glu-OtBu(73mg,0.24mmol)，HBTU(91mg,0.24mmol)，HOBT(32mg,0.24mmol)加入到5mL干燥DMF溶液中溶解，然后加入DIPEA(79μL,0.48mmol)调节pH至8-9，氮气保护下25℃搅拌4h。反应完成后旋干溶剂，粗产品经硅胶柱(柱子规格：500ML/21*400M)纯化，以正己烷/乙酸乙酯＝1：2(v:v)作为洗脱剂。浓缩旋干，真空干燥后得化合物b5为白色固体(75mg，产率71.4％)。

(4)化合物b6的合成

将化合物b5用DCM:TFA＝1：1(2mL:2mL)溶解，室温下反应1h以脱去Boc,tBu保护基团，反应完成后，将溶剂旋干，产物经半制备型HPLC分离纯化(t_R＝21.5min；柱子规格：Chrom-matrix C18柱5μm,10mm×250mm)，分离条件见下表2，收集出峰流出液并干燥，得化合物b6为白色粉末(26mg，产率45.6％)。

表2 化合物b6的半制备型高效液相色谱分离条件

(5)探针前体2-P的合成

将化合物b6(26mg,0.026mmol)溶于4mL DMF:H₂O＝(2:1)的混合溶液中，然后依次加入烷基氨甲基三氟化硼(AmBF3，46mg，0.23mmol)和三(2-苯并咪唑基甲基)胺(ligand，2.1mg，0.0052mmol)，随后将六氟磷酸四(乙酸)铜(I)(Cu(I)，12mg，0.031mmol)迅速加入到该体系中，超声使其混合均匀，氮气保护下于45℃油浴锅中搅拌2h。反应完成后，粗产品经制备型HPLC(t_R＝23min；Chrom-matrix C18柱5μm,10mm×250mm)进行分离，分离条件见下表3，收集出峰流出液并冻干，冻干后得产物探针前体2-P为白色固体，即得产物探针前体2-P(30mg，产率83.3％)。探针前体2-P的质谱分析图、高效液相色谱图、核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图5-8所示。

表3 式2-P所示化合物的半制备型高效液相色谱分离条件

氢谱解析：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.49(s,1H),8.72(s,1H),8.58(d,J＝7.7Hz,1H),8.45(d,J＝7.6Hz,1H),8.31(s,1H),8.19(d,J＝8.9Hz,2H),7.94(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),4.83(t,J＝6.6Hz,3H),4.75(d,J＝7.1Hz,1H),4.57–4.51(m,1H),3.71(t,J＝6.7Hz,2H),3.25–3.18(m,1H),3.08(d,J＝12.7Hz,2H),2.95(d,J＝3.4Hz,8H),2.85(d,J＝13.1Hz,2H),2.40–2.36(m,3H),2.07–1.97(m,2H).

碳谱解析：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.99,171.25,170.47,170.35,148.28,143.36,139.50,137.08,135.69,125.27,124.26,121.41,114.01,112.06,63.85,54.15,53.54,52.62,52.09,44.04,31.08,28.36,26.37.

实施例3探针3-P的合成

探针3-P如下述式3-P所示的结构：

探针3-P的合成路线如下所示：

制备方法如下：

(1)化合物c3的合成

称取化合物c1即Boc-Lys(Fmoc)-OH(405mg，0.87mmol)于50mL的圆底烧瓶中，加入6mL的无水THF超声溶解，然后依次加入N-甲基吗啉(331μL，1.74mmol)和氯甲酸异丁酯(189μL，0.87mmol)，氮气保护下于0℃冰浴反应2h；称取化合物c2即CBT(101mg，0.58mmol)用5mL的无水THF溶解后缓慢注入到上述体系中，锡箔纸包住避光保护，继续冰浴半小时；然后撤去冰浴装置，于室温下反应过夜。反应结束后，用2mL的盐酸(1mol/L)淬灭反应，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯和水进行萃取分离，收集有机相，用饱和碳酸氢钠反复洗涤3次后，经无水硫酸钠干燥，然后旋干有机相，粗产品最终经柱(500ML/21*400M)层析法分离提纯(正己烷/乙酸乙酯＝1:1(v:v)得到淡黄色油状物即为化合物c3(242mg，产率67.2％)。

(2)化合物c4的合成

将化合物c3溶于2mL的二氯甲烷溶剂中，然后加入等体积的TFA，混合均匀后，于室温下反应30min以脱去Boc保护基团。反应结束后，减压旋干溶剂，粗产品经15mL冰无水乙醚沉淀，离心后，真空干燥，得到化合物c4为淡黄色固体(172mg，产率84.7％)。

(3)化合物c6的合成

分别称取化合物c4(270mg，0.51mmol)，化合物c5(317mg,1.02mmol)，HBTU(389mg,1.02mmol)于50mL的圆底烧瓶中，加入5mL的无水DMF溶液溶解，然后向体系中加入DIPEA(424μL,2.55mmol)调节pH至碱性，反应瓶口用橡皮塞封紧，氮气保护下室温反应2h。反应结束后，旋干溶剂，粗产品经层析柱(500ML/21*400M)分离纯化，以正己烷：乙酸乙酯＝1：2(v:v)作为洗脱剂，最终得到化合物c6为淡黄色油状物(370mg，产率88.3％)。

(4)化合物c7的合成

将化合物c6用DCM:TFA＝1：1(2mL:2mL)溶解，室温下反应1h以脱去Boc保护基团，反应完成后，将溶剂旋干，粗产品经冰无水乙醚沉淀，离心，真空干燥后，得到化合物c7为白色固体(310mg，产率95.7％)。

(5)化合物c8的合成

分别称取化合物c7(366mg,0.51mmol)，Boc-Glu-OtBu(310mg,1.02mmol)，HBTU(387mg,1.02mmol)，HOBT(138mg,1.02mmol)于50mL的圆底烧瓶中，加入5mL干燥DMF超声溶解，然后加入DIPEA(422μL,2.55mmol)调节pH至8-9，氮气保护下25℃搅拌4h。反应结束后，旋干溶剂，粗产品经层析柱(500ML/21*400M)分离提纯，以正己烷：乙酸乙酯＝1：2(v:v)作为洗脱剂，真空干燥后，得化合物c8为白色固体(359mg，产率82.8％)。

(6)化合物c9的合成

将化合物c8置于50mL的圆底烧瓶中，氮气保护后，放置在冰浴装置中，然后用注射器缓慢向烧瓶中注入6mL含体积百分比5％哌啶的DMF混合溶液，0℃搅拌15min以脱去Fmoc保护基团。反应完成后，用注射器向上述体系中缓慢滴加1mol/L的盐酸，反应会出现一个由浑浊到澄清的过程，当溶液变得完全澄清透明时，取出反应瓶，减压旋干溶剂，粗产品经半制备柱分离(t_R＝21.3min；Chrom-matrix C18柱5μm,10mm×250mm)纯化，分离条件见下表4，收集出峰流出液冷冻干燥后，得到化合物c9为白色粉末(114mg，产率40.9％)。

表4 化合物c9的半制备型高效液相色谱分离条件

(7)化合物c10的合成

分别称取化合物c9(50mg,0.064mmol)，三碘苯甲酸(47mg,0.096mmol)，HBTU(41mg,0.13mmol)，HOBT(17mg,0.13mmol)于5mL的无水DMF溶液中超声溶解，然后加入DIPEA(53μL,0.32mmol)调节pH至碱性，氮气保护后于室温下搅拌4h。反应结束后，减压旋干溶剂，粗产品经无水乙醚多次沉淀洗涤，离心，倾去上清液，沉淀物经真空干燥后，得到化合物c10为淡紫色固体(60mg，产率74.1％)。

(8)探针3-P的合成

将化合物c10置于TFA:DCM＝1:1(体积比)的混合溶液中，于室温下搅拌1h以去除Boc和tBu保护基。反应结束后，多余溶剂经减压旋干，然后加入15mL冰无水乙醚沉淀，离心，去除上清液，沉淀经真空干燥后，粗产品经制备型HPLC(t_R＝23min；Chrom-matrix C18柱5μm,10mm×250mm,)进行分离，分离条件见下表5，收集出峰流出液并干燥，得到探针3-P为淡紫色粉末(34mg，产率64.8％)。探针3-P的质谱分析图、高效液相色谱图、核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图9-12所示。

表5式3-P所示化合物的半制备型高效液相色谱分离条件

氢谱解析：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.77(s,2H),8.49(s,1H),8.33(d,J＝7.6Hz,2H),8.24(s,1H),8.18(d,J＝9.0Hz,1H),7.84(d,J＝9.0Hz,1H),7.49(s,1H),4.51(s,1H),4.41–4.35(m,1H),3.39(d,J＝7.0Hz,2H),3.03–2.96(m,1H),2.37(s,2H),2.07–

1.94(m,2H),1.82(d,J＝5.2Hz,2H),1.56–1.49(m,2H),1.28(s,9H),1.14–1.03(m,2H).

碳谱分析：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.37,171.79,171.21,170.66,168.27,148.09,148.05,146.36,140.04,137.07,135.33,134.88,125.19,121.47,113.81,111.85,108.05,95.73,65.38,48.19,42.83,40.60,39.34,31.66,31.53,30.04,28.78.

实施例4探针¹⁸F-1-P的放射性化学合成

放射性合成：

所述探针¹⁸F-1-P的放射性化学合成路线如下所示：

利用[¹⁸F]离子交换法完成探针¹⁸F-1-P的放射性化学合成。首先，由回旋加速器产生具有放射活性的[¹⁸F]核素，然后将一个先后经0.5mol/L NaHCO₃(10mL)与纯水(10mL)活化后的QMA柱挂至加速器上，使产生的[¹⁸F]核素吸附于QMA柱上，随后用1mL的注射器吸取200μL左右的哒嗪盐酸(pH＝2.5)将QMA柱上的[¹⁸F]核素洗脱至反应管中。取约30μL实施例1制备的探针前体1-P(25mM)一并加入到反应管中，震荡使其混匀，80℃油浴30分钟，取少量反应液用通过放射性HPLC监测放射化学产率(RCY)(放射剂量<5μCi)(HPLC规格：Waters1525)。

放射性纯化：

放射性合成后，取C18柱预先由10mL的乙醇和纯水进行活化，然后将放射性合成所得的反应液用20mL的纯水稀释后挂至C18柱(WAT 054955Sep-Pak 1cc 50mg100pk)上进行纯化以去除混合液中残余的[¹⁸F]离子，C18柱分别经过10mL纯水洗涤三次后，标记产物¹⁸F-1-P由约500μL的乙醇洗脱至西林瓶中，取少量液体的放射化学纯度(RCP)由放射性HPLC评估(注射剂量<5μCi)(HPLC规格：Waters 1525)，剩余放射性标记产物用于后续实验研究。

检测结果如图13所示，放射化学产率(RCY)为88％以上，放射性化学纯度(RCP)达到99％以上。

实施例5探针¹⁸F-2-P的放射性化学合成

放射性合成：

所述探针¹⁸F-2-P的放射性化学合成路线如下所示：

利用[¹⁸F]离子交换法完成探针¹⁸F-2-P的放射性化学合成。首先，由回旋加速器产生具有放射活性的[¹⁸F]核素，然后将一个先后经0.5mol/L NaHCO₃(10mL)与纯水(10mL)活化后的QMA柱挂至加速器上，使产生的[¹⁸F]核素吸附于QMA柱上，随后用1mL的注射器吸取200μL左右的哒嗪盐酸(pH＝2.5)将QMA柱上的[¹⁸F]核素洗脱至反应管中。取约30μL实施例2制备的探针前体2-P(25mM)一并加入到反应管中，震荡使其混匀，80℃油浴30分钟。取少量反应液用通过放射性HPLC监测放射化学产率(RCY)(放射剂量<5μCi)(HPLC规格：Waters1525)

放射性纯化：

放射性合成后，取C18柱预先由10mL的乙醇和纯水进行活化，然后将放射性合成所得的反应液用20mL的纯水稀释后挂至C18柱(WAT 054955Sep-Pak 1cc 50mg100pk)上进行纯化以去除混合液中残余的[¹⁸F]离子，C18柱分别经过10mL纯水洗涤三次后，标记产物¹⁸F-1-P由约500μL的乙醇洗脱至西林瓶中，取少量液体的放射化学纯度(RCP)由放射性HPLC评估(注射剂量<5μCi)(HPLC：Waters 1525)，剩余放射性标记产物用于后续实验研究。

检测结果如图14所示，放射化学产率(RCY)为88％以上，放射性化学纯度(RCP)达到99％以上。

对比例1探针前体1

探针前体1如下述所示，按照文献报道[Lin,J.；Wang,W.；Li,K.；Huang,H.；Lv,G.；Peng,Y.；Luo,S.；Qiu,L.Development of a kit-like radiofluorinated biomoleculeleading to a controlled self-assembly of(18)F nanoparticles for a smart PETimaging application.Chem Commun(Camb)2017,53,(48),6476-6479.]的方法制备得到。

对比例2探针¹⁸F-1的放射性合成

探针¹⁸F-1按照文献报道[Lin,J.；Wang,W.；Li,K.；Huang,H.；Lv,G.；Peng,Y.；Luo,S.；Qiu,L.Development of a kit-like radiofluorinated biomolecule leading to acontrolled self-assembly of(18)F nanoparticles for a smart PET imagingapplication.Chem Commun(Camb)2017,53,(48),6476-6479.]的方法制备得到。

实验例1体外稳定性检测

将实施例4、5制备的探针¹⁸F-1-P、¹⁸F-2-P分别溶于200μL的PBS缓冲液(pH＝7.4)或胎牛血清(FBS)中，然后放置在37℃下分别孵育不同时间(0.5,1,2,4h)。在每个检测时间点，取约20μL的溶液进行放射性HPLC分析。注意，为稳定性评估前，FBS溶液需要先加入等体积的乙腈，12000g离心5min后，取上清液进行放射性HPLC分析。

探针¹⁸F-1-P的检测结果如图15所示，由图中可知，无论在PBS溶液还是血清中，探针连续孵育长达4h，并未出现其他的杂质峰，表明探针¹⁸F-1-P在正常生理条件下可以保持良好的稳定性，可用于进一步的体内生物学性质研究。

探针¹⁸F-2-P的检测结果如图16所示，由图中可知，无论在PBS还是血清中，仅存在探针¹⁸F-2-P的峰而无其他杂质峰的出现，说明合成的探针在生理条件下，4h内能够保持良好的稳定性，为接下来的体内生物学研究提供了重要的参考价值。

实验例2细胞毒性研究

将实施例1制备的探针前体1-P进行细胞毒性实验，探针前体1-P对HCT 116和L929的细胞毒性细胞通过3-(4，5--二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定：

首先将培养的对数生长期的HCT 116和L929细胞分别以8×10³个/100μL的浓度接种于96孔板中(每组设三个平行对照)，并在37℃和含5％CO₂的培养条件下孵育24h使细胞完全贴壁，吸去培养基，然后将含浓度分别为12.5μM，25μM，50μM和100μM探针前体1-P的200μL新鲜培养基添加到孔中，并继续培养6h，12h或24h。随后，将每个孔用MTT(5.00mg/mL,20μL)预处理，孵育4小时后加入150μL二甲亚砜(DMSO)，振摇10分钟以溶解紫色晶体，最后用ELISA酶标仪记录在490nm波长处每个孔的吸光度值，根据下述公式计算细胞存活率％：

细胞存活率％＝加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)对细胞毒性进行评估。

检测结果如图17中的(a)和(b)所示，在与探针前体1-P孵育6h、12h、24h后，HCT116和L929细胞均保持相当高的细胞活性(＞80％)。例如，用浓度高达100μM的探针前体1-P处理24小时后，HCT 116和L929的细胞活力分别为89.50±3.40％，91.50±4.30％，表明这探针前体1-P即使在较高的浓度范围内也没有表现出明显的细胞毒性。

实验例3细胞摄取实验

基于探针在活细胞内具有良好的安全性，对实施例4、5、对比例2制备的探针¹⁸F-1-P、¹⁸F-2-P、¹⁸F-1的细胞摄取行为进行了研究，并通过γ计数仪对结果进行定量分析。

将GGT酶高表达的阳性肿瘤细胞HCT 116或GGT酶低表达的阴性正常细胞L929在含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基中于37℃，5％CO₂的环境中培养24h，然后细胞经消化，离心，重悬计数后，以1×10⁶/200μL(不含FBS的DMEM培养基)的浓度加入到放免管中，同时分别加入100μL探针¹⁸F-1-P(1mCi/mL)，¹⁸F-1(1mCi/mL)，¹⁸F-1-P(1mCi/mL)与探针前体1-P(50μM)的混合物，¹⁸F-2-P(1mCi/mL)，¹⁸F-2-P(1mCi/mL)与探针前体2-P(50μM)的混合物，混合均匀后，放置在37℃的水浴锅中孵育0.25h，0.5h，1h，2h或4h。在每个检测时间点，加入冷PBS缓冲液洗涤细胞2次以去除细胞表面残余的放射性剂量，离心，吸去上清液，用γ计数仪评估进入到细胞内的探针的浓度，结果以AD％值来表示(细胞内含有的剂量占总放射性剂量的百分比，每组实验至少重复三次，结果以平均值来表示)。

检测结果如图18-20中所示，具体如下：

在图18中，¹⁸F-1-P在L929细胞中显示出较低的细胞摄取，并且在4h内摄取率没有明显的变化趋势。而在HCT 116细胞中，探针¹⁸F-1-P的摄取随时间显著增加，并在2h达到最大值，AD％值从0.9±0.1％(15分钟)增加到2.70±0.10％，比在L929细胞(0.70±0.010％)中大约增加了4倍，原因主要是在于HCT116细胞中GGT的表达水平明显高于正常细胞(L929)。

在图19中，当将探针前体1-P(50μM)与¹⁸F-1-P加入到HCT 116细胞中进行共孵育时，细胞摄取进一步提高，并在2h时达到最高摄取(3.0±0.40％AD)，比单独加入¹⁸F-1-P组增加11.1％，原因可能是探针前体1-P的加入，能够促进分子间的环化和原位自组装，形成纳米结构，从而增加在肿瘤细胞中的积累和延长其滞留保留。

在图20中，作用0.5、1、2和4h后，经目标探针¹⁸F-2-P处理的HCT 116细胞摄取值(AD％)明显高于在L929细胞中，而加入冷化合物探针前体2-P(50μM)进行共处理后，竞争性地抑制了细胞膜表面GGT酶对探针¹⁸F-2-P的特异性识别，从而使其靶向摄取降低。

实验例4裸鼠体内PET成像

将实施例4、5、对比例2制备的探针¹⁸F-1-P、¹⁸F-2-P、¹⁸F-1进行下述实验

实验动物：裸鼠均是5周龄左右BALB/c裸鼠(上海斯莱克实验动物公司)，实验方案已由江苏省原子医学研究所动物管理与伦理委员会批准。

HCT 116肿瘤鼠模型建立：将约5×10⁶个HCT 116皮下接种到裸鼠的右前肢，饲养于SPF级无菌室中，勤换垫料，给予充足的水和食物，使处于健康的生长环境中。当肿瘤长至8-10mm时，将所得的肿瘤鼠分为3组进行实验。

PET成像：先将上述肿瘤鼠用异氟烷(氧气中含2％异氟烷，流速为2L/min)麻醉后固定于床上，然后分别通过尾静脉注射以下五组药物：(1)探针¹⁸F-1-P(约150μCi)；(2)对照探针¹⁸F-1(约150μCi)；(3)¹⁸F-1-P(约150μCi)与冷化合物探针前体1-P(25μmol/kg)共同注射；(4)探针¹⁸F-2-P(约150μCi)；(4)¹⁸F-2-P(约150μCi)与冷化合物探针前体2-P(25μmol/kg)共同注射；实验时间设置为动态扫描60分钟，静态扫描10分钟，实验仪器为micro-PET扫描仪。实验结果通过用ASIProVM软件勾画感兴趣区域(ROI)进行半定量分解，结果用每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)值表示(每组数据至少选取三个区域)。

检测结果如下：

在注射¹⁸F-1组中，由于非靶向摄取，60分钟内，在PET显像中只检测到较低的信号，并且在10分钟时达到的最大摄取值仅为2.12±0.12％ID/g，如图21-22所示；

在注射¹⁸F-1-P组中，10分钟内肿瘤区出现明显增强的PET信号，并且在10分钟时达到最大摄取(3.20±0.29％ID/g)，如图21和图23所示，但在此之后，肿瘤部位PET信号迅速下降，60分钟时衰减为0.92±0.16％ID/g。原因主要在于进入到肿瘤细胞内¹⁸F-1-P未达到其聚集浓度，几乎以小分子的形式排出细胞，导致在肿瘤内的滞留时间短。尽管如此，探针¹⁸F-1-P通过修饰γ-Glu提供靶向肿瘤细胞的能力，能够在特定时间内增强肿瘤的摄取；

在共注射¹⁸F-1-P与1-P组中，1h内，在肿瘤区域中能够检测到明显的PET信号。定量分析结果显示，与单独注射¹⁸F-1-P相比，共注射组在各时间点均具有更高肿瘤摄取，并且60分钟时肿瘤区域的摄取率仍保持2.98±0.50％ID/g，如图21和图24所示，上述结果表明，额外加入的1-P可促进探针¹⁸F-1-P还原诱导的分子间环化和自组装形成纳米粒子(¹⁸F-1-NPS)，从而增强肿瘤周围的聚集和滞留。此外，值得注意的是，肾脏和膀胱部位在60分钟内存在高放射性摄取，这可能与探针的代谢途径有关。¹⁸F-1-P与1-P共注射组的肿瘤与肌肉的比值(T/M)随着时间的延长逐渐增大，分别为3.01(10分钟)、3.57(30分钟)、4.12(45分钟)、5.08(60分钟)，明显高于注射对照探针¹⁸F-1组，如图25所示，以上结果表明，探针¹⁸F-1-P具有的GGT/GSH介导还原缩合和自组装的作用机制能够显著提高其在肿瘤区域的摄取和保留时间。

在注射¹⁸F-2-P组中，由于双GGT靶向结构，导致其在初期(5-20分钟)内呈现高靶向摄取，但在20分钟后，由于小分子快速代谢能力使其在1h内快速地从肿瘤内排出，摄取值逐渐降低，如图26(a)-(b)所示，但从T/M定量分析结果看，探针从肿瘤内排泄的速率要明显低于从肌肉内排泄速率，如图26(c)所示；

在共注射¹⁸F-2-P与2-P组中，由于加入冷化合物探针前体2-P后，竞争性抑制了肿瘤内GGT酶对探针¹⁸F-2-P的靶向切割，从而使其细胞摄取降低。

实验例5体外CT信号检测

将不同浓度(0mgI/ml，0.25mgI/ml，0.5mgI/ml，1mgI/ml，5mgI/ml，10mgI/ml，20mgI/ml，40mgI/ml)的实施例3制备的探针3-P溶解在DMF溶剂中，通过CT扫描仪测定其Hounsfield(HU)值，绘制线性曲线，评价探针体外CT成像效果。

检测结果如图27所示，显示探针3-P的CT值随溶液浓度的增加呈线性加，且CT图像显示出明显的浓度依赖性明亮化效应。

实验例6体内CT成像

取实施例3制备的探针3-P进行体内CT成像实验

将实验例4中建立的HCT 116肿瘤裸鼠模型用4％水合氯醛麻醉后固定在CT成像的动物床上。每个小鼠体内注射探针3-P的体积为200μL，剂量为23.62mgI/kg。在注射后在5、30、60、120、240分钟采集CT图像并进行定量分析。

检测结果：如图28(a)-(b)所示，从图中可以看出，在通过尾静脉注射探针3-P进行4h显像，其CT信号逐渐增强，表明探针3-P在CBT缩合之后在肿瘤部位表现出延长的保留时间。总之，所有这些结果表明，该探针3-P在GGT/GSH-介导的缩合和自组装下能够显著提高CT造影剂在肿瘤中的摄取和保留时间。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，其特征在于，具有式(1)所示结构：

其中，R1为示踪基团，包括PET显像示踪基团或CT示踪基团中的一种；R2为-H、C1-C6的烷烃、或

2.根据权利要求1所述的一种γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，其特征在于，所述PET显像示踪基团包括：

-¹⁸F，

中的一种；

所述CT显像示踪基团包括：

中的一种。

3.根据权利要求2所述的γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针，其特征在于，所述分子探针具有如下所示结构：

4.一种制备权利要求3中所述的分子探针¹⁸F-1-P的方法，其特征在于，包括：

化合物a1与化合物S经缩合反应，得到化合物a2；

化合物a2经过脱保护反应，得到化合物a3；

将化合物a3、2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和四(乙腈)铜(Ⅰ)六氟磷酸铜，经click点击缩合反应，得式1-P；

将式1-P进行¹⁸F标记，即得；

5.一种制备权利要求3中所述的分子探针¹⁸F-2-P的方法，其特征在于，包括：

化合物b1和化合物b2经缩合反应，得化合物b3；

化合物b3经脱保护反应，得化合物b4；

化合物b4和化合物S经缩合反应，得化合物b5；

化合物b5经脱保护反应，得化合物b6；

将化合物b6、2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和四(乙腈)铜(Ⅰ)六氟磷酸铜，经click点击缩合反应，得式2-P；

将式2-P进行¹⁸F标记，即得；

6.一种制备权利要求3中所述的分子探针3-P的方法，其特征在于，包括：

化合物c1和化合物c2经缩合反应，得到化合物c3；

化合物c3经脱保护反应，得到化合物c4；

化合物c4和化合物c5经缩合反应，得到化合物c6；

化合物c6经脱保护反应，得到化合物c7；

化合物c7和叔丁氧羰基-L-谷氨酸1叔丁脂经缩合反应，得到化合物c8；

化合物c8经脱保护反应，得到化合物c9；

化合物c9和三碘苯甲酸经缩合反应，得到化合物c10；

化合物c10经脱保护反应，得到3-P；

7.权利要求1-3任一项所述的γ-谷氨酰转肽酶靶向的分子探针在制备γ-谷氨酰转肽酶靶向的药物、药物载体或显像产品中的用途。

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