CN112961173B - 一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针和制备方法及其用途 - Google Patents
一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针和制备方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体涉及一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针和制备方法及其用途。本发明提供的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针[18F]GLNTGT在体外具有良好的稳定性，在具有不同PSMA表达的前列腺癌细胞中表现出良好的生物相容性，对PSMA的特异性靶向确定了示踪剂[18F]GLNTGT具有较高的肿瘤细胞摄取率，对PSMA具有高结合亲和力。[18F]GLNTGT组的小鼠对比对照示踪剂[18F]AlF‑NOTA‑RGD2具有更高靶本比。尽管示踪剂[18F]GLNTGT在细胞和体内CT信号检测实验中有一些局限性，但仍为PET/CT示踪剂的开发提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针和制备方法及其用途。
背景技术
前列腺癌是全世界成年男性中常见的恶性肿瘤，并且是全球成年男性中癌症死亡的第五大主要原因。由于前列腺癌的治疗在很大程度上取决于疾病的阶段，因此前列腺癌的早期诊断至关重要。当前，有许多诊断前列腺癌的临床方法，包括穿刺活检，磁共振成像(MRI)，计算机断层扫描(CT)，单光子和正电子计算机断层扫描(SPECT/PET)等。在所有恶性肿瘤的临床诊断中，CT成像由于具有较高的空间分辨率和解剖学成像能力而被广泛应用。然而，它具有有限的软组织分辨率。PET示踪剂用于多种肿瘤生物标记物的成像，这将进一步提高肿瘤诊断效率。同时，利用体内无创PET成像来确定肿瘤的位置。目前，分子成像技术在前列腺癌中的应用通常是结合PET和CT成像技术来实现对肿瘤的早期诊断和治疗。例如，[11C]和[18F]胆碱示踪剂和[11C]乙酸示踪剂实现了前列腺癌细胞膜和脂肪酸代谢的精确PET/CT成像。然而，上述两种示踪剂在不同阶段诊断前列腺癌中的诊断功效仍然很低。许多研究人员正在探索更具体的前列腺癌生物标记物。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种表面膜蛋白，在前列腺癌细胞中高度表达。它在低分化，转移性和雄激素非依赖性前列腺癌中强烈表达。因此，PSMA是有前途的前列腺癌生物标志物。
目前，许多针对PSMA的示踪剂一直在探索中。由于第一代PSMA靶向示踪剂的血液清除率低且背景值高，因此开发了第二代和第三代([18F]DCFPyL和[18F]PSMA-617/1007)。研究人员对靶向PSMA示踪剂的PET成像感兴趣，因为前列腺癌的检测效果更高。在这些PSMAPET示踪剂中，以68Ga标记的PSMA成像示踪剂为靶标已用于前列腺癌的诊断。尽管以68Ga标记的靶向PSMA示踪剂显示出对前列腺癌的良好临床成像特性，但它的半衰期更短，并且68Ga发生器冲洗液的同位素很少。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针和制备方法及其用途。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针，具有如下式所示的结构：
一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体，具有如下式所示的结构：
一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，包括如下步骤：
将Fmoc-3-(2-萘基)-L-丙氨酸进行缩合反应得到化合物1；
将化合物1和N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸进行缩合反应得到化合物2；
将化合物2和Fmoc-L-炔丙基甘氨酸进行缩合反应得到化合物3；
将化合物3和2,3,5-三碘苯甲酸进行缩合反应得到中间体化合物B；
将中间体化合物B和化合物4进行缩合反应得到化合物5；
将化合物5进行脱保护反应得到化合物6；
将化合物6和三氟硼酸氨甲基酯进行点击化学反应得到化合物GLNTGT；合成路线如下：
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，
在制备化合物2的步骤中，向化合物1中加入N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应；
可选的，振摇反应3小时；
可选的，所述的N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL；
可选的，用N，N-二异丙基乙胺调节pH 8-9。
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，
在制备化合物3的步骤中，向化合物2中加入Fmoc-L-炔丙基甘氨酸，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应；
可选的，振摇反应3小时；
可选的，所述的Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL；
可选的，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，
在制备中间体化合物B的步骤中，向化合物3中加入2,3,5-三碘苯甲酸，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应；
可选的，振摇反应3小时；
可选的，所述的2,3,5-三碘苯甲酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL；
可选的，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，
在制备化合物5的步骤中，将中间体化合物B、化合物4、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N，N-二甲基甲酰胺混合，调节所得混合物的pH至8-9，在氮气条件下室温搅拌反应；
可选的，搅拌反应3小时；
可选的，中间体化合物B、化合物4、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N，N-二甲基甲酰胺的用量比例为：1:1.3:1.2:5，eqv:eqv:eqv：mL；
可选的，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，
在制备化合物GLNTGT步骤中，向化合物6中加入三氟硼酸氨甲基酯、五水硫酸铜、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、L-抗坏血酸钠和N’N-二甲基甲酰胺水溶液，在氮气条件下室温搅拌反应；
可选的，搅拌反应30分钟；
可选的，所述化合物7、三氟硼酸氨甲基酯、五水硫酸铜、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、L-抗坏血酸钠的用量比例：1:4:0.5:0.5:1，eqv:eqv：eqv：eqv：eqv；
可选的，所述N’N-二甲基甲酰胺水溶液为N’N-二甲基甲酰胺和水的体积比4：1的混合溶液。
本发明提供了一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针的制备方法，将所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体或所述的制备方法制备得到的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体进行放射性核素18F标记。
所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针、所述的制备方法制备得到的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针具有如下的用途：
(1)制备前列腺癌靶向的PET、CT或PET/CT示踪剂中的用途；
(2)制备前列腺特异性膜抗原靶向的PET、CT或PET/CT示踪剂中的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针[18F]GLNTGT在体外具有良好的稳定性，因此适用于随后的体内和体外实验。非放射性化合物GLNTGT在具有不同PSMA表达的前列腺癌细胞中表现出良好的生物相容性。对PSMA的特异性靶向确定了示踪剂[18F]GLNTGT具有较高的肿瘤细胞摄取率。示踪剂[18F]GLNTGT由于其特定的疏水作用而对PSMA具有高结合亲和力。PET成像的结果表明，[18F]GLNTGT组的小鼠对比对照示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2具有更高靶本比。尽管示踪剂[18F]GLNTGT在细胞和体内CT信号检测实验中有一些局限性，但仍为PET/CT示踪剂的开发提供了参考。
2.本发明提供的一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针制备方法，步骤简单，容易合成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中的化合物4的ESI-MS图谱；
图2是本发明实施例1中的中间体化合物B的ESI-MS图谱；
图3是本发明实施例1中的化合物5的ESI-MS图谱；
图4是本发明实施例1中的化合物6的核磁共振氢谱；
图5是本发明实施例1中的化合物6的ESI-MS图谱；
图6是本发明实施例1中的非放射性化合物GLNTGT的核磁共振氢谱；
图7是本发明实施例1中的非放射性化合物GLNTGT的ESI-MS图谱；
图8是本发明[18F]GLNTGT的放射性高效液相色谱曲线；图中z轴部分含义:线B为示踪剂[18F]GLNTGT经放射性标记后的放射性高效液相色谱曲线；线C为示踪剂[18F]GLNTGT纯化后的放射性高效液相色谱曲线；D、E、F线分别为示踪剂[18F]GLNTGT在胎牛血清中孵育1h、2h、4h后的放射性高效液相色谱曲线；G线表示示踪剂[18F]GLNTGT在PBS中孵育4h后所示物质的放射性高效液相色谱曲线；
图9是本发明实验例3中体外摄取研究和细胞毒性测定结果；图中(a)示踪剂[18F]GLNTGT在LNCaP和PC-3细胞中分别15min、30min、60min和120min(*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001)的摄取；图中(b)非放射性化合物GLNTGT在LNCaP和PC-3细胞中分别为6.25、12.5、25、50和100μM时的细胞毒性评估；
图10是本发明实验例3中示踪剂[18F]GLNTGT的PSMA竞争抑制曲线；
图11是本发明实验例3中示踪剂非放射性化合物GLNTGT溶液的CT图像；
图12是本发明实验例3中注射[18F]GLNTGT后60min小鼠体内PET成像结果；图中(a)注射[18F]GLNTGT后60min小鼠PET动态成像；图中(b)示踪剂[18F]GLNTGT在PSMA(+)LNCaP肿瘤和PSMA(-)PC-3肿瘤感兴趣的整个肿瘤区域的平均肿瘤摄取情况；图中(c)[18F]GLNTGT在PSMA(+)LNCaP肿瘤和PSMA(-)PC-3肿瘤中的肿瘤-肌肉摄取比值；
图13是本发明实验例3中注射[18F]AlF-NOTA-RGD2后60min小鼠体内PET成像结果；(a)注射[18F]AlF-NOTA-RGD2后小鼠60分钟PET动态成像；(b)示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2在PSMA(+)LNCaP肿瘤和PSMA(-)PC-3肿瘤感兴趣的整个肿瘤区域的平均肿瘤摄取情况；(c)PSMA(+)LNCaP肿瘤和PSMA(-)PC-3肿瘤中[18F]AlF-NOTA-RGD2的肿瘤-肌肉摄取比值；
图14是本发明实施例1中非放射性化合物GLNTGT的HPLC分析色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
所有合成试剂和溶剂均为分析纯。本研究中使用的试剂分别购自毕得医药公司，萨恩化学科技公司，上海生工生物科技有限公司和西格玛公司。本研究中的溶剂购自国药集团化学试剂有限公司。1H NMR光谱在Bruker Ultrashield 400MHz光谱仪上记录。非放射性化合物GLNTGT的合成中间体的质谱信息是通过电喷雾电离质谱系统(ESI-MS，沃特世，美国)获得的。通过Breeze2系统检测了非放射性化合物GLNTGT的分析型高效液相色谱(HPLC)(沃特世,美国)和半制备型HPLC(沃特世,美国)。流速为1mL/min(分析型HPLC)和3mL/min(半制备型HPLC)，流动相为等度洗脱液，其中60％A(0.1％TFA水溶液)和40％B(0.1％TFA溶液)乙腈)从0到40分钟(波长254nm)。其HPLC纯化和分析条件已列在表1和2中。在CRC-15R剂量校准器(Capintec，美国)中测量放射性。非放射性化合物GLNTGT的CT成像使用Micro-CT(MCT-1113，苏州和君科技发展有限公司，中国)。
下述实施例中的室温是指25-37℃。
实施例1前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备
本实施例提供了一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体，具有如下式所示的结构：
制备方法如下：
(1)化合物4的合成路线如下所示：
在圆底烧瓶(100mL)中，将化合物1-4(L-谷氨酸二叔丁基酯盐酸盐)(500mg，1.7mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)，三乙胺(0.6mL)和-二甲氨基吡啶(8mg)的悬浮液中。将N’N-羰基二咪唑(300mg，1.86mmol)加入到反应混合物中，并在室温下搅拌过夜。用二氯甲烷(20mL)稀释反应完成的混合物，并从饱和氯化钠溶液中萃取。萃取完成后，有机相用无水硫酸钠干燥并浓缩。然后使用旋转蒸发仪干燥以获得所需的化合物2-4。ESI-MS(m/z)：C17H27N3O5的计算值([M+Na]+)＝376.20；实测观察为376.21。
将化合物2-4(700mg，1.97mmol)，三乙胺(0.5mL)和N'-苄氧基羰基-L-赖氨酸叔丁基盐酸盐(720mg，1.92mmol)的混合物新加入二氯甲烷(20mL)溶液中圆底烧瓶(50mL)。然后安装直式冷凝器，在氮气保护条件下40℃下搅拌过夜。通过色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，v/v)和薄层色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1,v/v，Rf＝0.4)纯化由反应得到的反应混合物。纯化后，将混合物真空干燥以获得化合物3-4。ESI-MS(m/z)：C32H51N3O9的计算值([M+Na]+)＝644.36；实测观察为644.56。
将化合物3-4(620mg，1.0mmol)和10％钯/碳(160mg)添加到圆底烧瓶(50mL)中的甲醇(25mL)溶液中。将氢通入反应烧瓶中，并在25℃下均匀搅拌24-48小时。反应完成后，将其通过硅藻土过滤，得到化合物4(460mg，产率：95％)。ESI-MS(m/z)：对于C24H45N3O7([M+H]+)的计算值＝488.33；实测观察为488.41。ESI-MS图谱如图1所示。
(2)中间体化合物B的合成路线如下所示：
将树脂添加到多肽合成管中(负载：1.106mmol/g，1eqv，0.5mmol)，并用二氯甲烷溶液(10mL)溶胀30分钟。将Fmoc-3-(2-萘基)-L-丙氨酸(1.25eqv，0.625mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(8mL)加入到多肽合成管中。通过N，N-二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节至8-9。摇动反应3小时后，用N’N-二甲基甲酰胺反应混合物(N’N-二甲基甲酰胺：甲醇：N，N-二异丙基乙胺＝17：2：1，v/v/v)(10mL)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)洗涤合成管中的反应混合物，并振摇两次(10min/次)。Kaiser测试的颜色是浅黄色。Kaiser试验完成后，将反应混合物用20％哌啶(7mL)洗脱3次(10mL/次)。然后将其用DMF洗涤五次。Kaiser测试是深紫色的，得到含有化合物1的多肽合成管，可以进行下一步。在第二步骤中，将N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸(1.25eqv，0.625mmol)和氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐(2eqv，1mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)加入到肽合成管中。通过N，N-二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节至8-9。然后根据第一步的反应物处理方法(即摇动反应3小时后，用N’N-二甲基甲酰胺反应混合物(N’N-二甲基甲酰胺：甲醇：N，N-二异丙基乙胺＝17：2：1)(10mL)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)洗涤合成管中的反应混合物，并振摇两次(10min/次)。Kaiser测试的颜色是浅黄色。Kaiser试验完成后，将反应混合物用20％哌啶(7mL)洗脱3次(10mL/次)。然后将其用DMF洗涤五次。Kaiser测试是深紫色的，然后进行下一步)处理第二步的反应物。反应的第二步完成后，向含有化合物2的肽合成管中添加第三步的内容物Fmoc-L-炔丙基甘氨酸(1.25eqv，0.625mmol)，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐(2eqv，1mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)。用N，N-二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节至8-9。然后根据所述第一步的反应处理方法处理第三步的反应物。在第四步中向含有化合物3肽合成管中添加2,3,5-三碘苯甲酸(1当量，0.625mmol)，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐(2当量，1mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)。用N，N-二异丙基乙胺将pH调节至8-9，振荡反应3小时。第四步后，用N’N-二甲基甲酰胺反应混合液(N’N-二甲基甲酰胺：甲醇：N，N-二异丙基乙胺＝17：2：1)(10mL)和N’N-二甲基甲酰胺(10mL)洗涤合成管中的反应混合物，并振摇两次。Kaiser测试的颜色是浅黄色。Kaiser测试完成后，将肽合成管中的反应物用二氯甲烷(10mL)洗涤两次。除去树脂中的1％三氟乙酸，将反应混合物取出并干燥，得到中间体化合物B(410mg，88.2％)。ESI-MS(m/z)：对于C33H32I3N3O5([M+H]+)的计算值＝931.95；实测观察为932.01。ESI-MS图谱如图2所示。
(3)前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体化合物GLNTGT的合成路线如下：
将氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐(1.2eqv，72mg，0.19mmol)，N，N-二甲基甲酰胺(5mL)，化合物4(1.3eqv，100mg，0.20mmol)和中间体化合物B(1eqv，150mg，0.16mmol)添加到新的圆底烧瓶(50mL)中。用N，N-二异丙基乙胺(3eqv，80μL，0.47mmol)将反应混合物的pH调节至8-9。将反应在氮气条件下在25℃搅拌3h，并将反应混合物在真空下蒸发。通过柱色谱法(三氯甲烷∶甲醇＝100∶3，v/v)和薄层分析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，v/v，Rf＝0.5)纯化粗产物。获得化合物5(140mg，49％)，用于下一步。ESI-MS(m/z)：对C58H76I3N5O11([M+H]+)的计算值＝1400.27；实测观察为1400.93。ESI-MS图谱如图3所示。
在圆底烧瓶(25mL)中，将化合物5与三氟乙酸(3mL)，二氯甲烷(3mL)和三异丙基硅烷(0.3mL)混合。将反应在室温搅拌1h，并将反应混合物在真空下蒸发。获得化合物6(115mg，产率：82.1％)，用于下一步。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.34(s，1H)，8.79(s，1H)，8.28(s，1H)，7.95(s，2H)，7.68(s，2H)，7.45(s，2H)，6.30(s，1H)，4.51(s，1H)，4.01(s，1H)，3.62(s，1H)，2.51(s，8H)，1.63(s，3H)，1.27(s，7H)。其核磁共振氢谱如图4所示。
ESI-MS(m/z)：对于C46H52I3N5O11([M+H]+)的计算值为1232.08；实测观察到1232.95。ESI-MS图谱如图5所示。
反应圆底烧瓶(50mL)中加入化合物6(1eqv，50mg，0.04mmol)，三氟硼酸氨甲基酯(4eqv，31mg，0.16mmol)，五水硫酸铜(0.5eqv，5mg，0.02mmol)，三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(0.5eqv，9mg，0.02mmol)，L-抗坏血酸钠(1eqv，8mg，0.04mmol)和反应混合液(N’N-二甲基甲酰胺：水＝4：1，v/v)。将反应混合物在室温下、氮气条件下搅拌30分钟。反应完成后，在半制备型HPLC纯化后(条件见下表1)，使用水(含0.1％三氟乙酸)、乙腈(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，进行HPLC分析，(色谱柱为伊利特，4.6×250mm，E3017437)，洗脱条件见下表2，高效液相图如图14所示，获得非放射性化合物GLNTGT(20mg，产率：40％)。
表1非放射性化合物GLNTGT的半制备高效液相色谱
表2非放射性化合物GLNTGT各步骤的HPLC分析方法
化合物GLNTGT的解析：
1H NMR(400MHz，DMSO)：1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.80(dd，J＝23.4，8.1Hz，1H)，8.24(dd，J＝21.6，16.4Hz，1H)，8.10–7.85(m，2H)，7.92–7.64(m，3H)，7.75–7.64(m，1H)，7.55–7.27(m，2H)，6.33(t，J＝8.7Hz，1H)，4.84(dd，J＝14.8，7.6Hz，1H)，4.73–4.42(m，1H)，13.61–-2.42(m，81H)，16.09–-1.35(m，80H)，4.16–3.94(m，1H)，3.73(dt，J＝13.5，6.8Hz，1H)，3.59(ddd，J＝35.0，20.7，14.2Hz，3H)，3.21-3.04(m，5H)，2.95(dd，J＝22.9，16.6Hz，6H)，2.71(d，J＝16.8Hz，1H)，2.53(d，J＝18.9Hz，6H)，2.46–2.19(m，2H)，2.07(s，1H)，1.69–1.54(m，2H)，1.49(d，J＝6.2Hz，1H)，1.26(d，J＝6.6Hz，13H)，1.18(t，J＝7.3Hz，3H)，0.90-0.72(m，1H)。其核磁共振氢谱如图6所示。
ESI-MS(m/z)：对于C51H64BF3I3N9O11([M-H]+)的计算为1426.19；实测观察到1426.96。ESI-MS图谱如图7所示。
实施例2前列腺特异性膜抗原靶向分子探针
本实施例提供了前列腺特异性膜抗原靶向分子探针[18F]GLNTGT，具有如下式所示的结构：
合成路线如下：
通过医用回旋加速器(住友HM-7型，日本住友重工业株式会社)获得7.4GBq的未添加载体的[18F]氟化物，用18MeV质子轰击高压[18O]水靶，并用哒嗪-HCl冲洗将缓冲液(pH＝2.5，1M，300μL)直接放入装有非放射性化合物GLNTGT(25mM，30μL)的离心管中。将反应混合物在80℃下孵育35分钟。放射性HPLC检测了[18F]GLNTGT的成功标记(结果如图8中B线)。将标记的[18F]GLNTGT反应混合物转移至带有20mL去离子水的40mL离心管中。RP-C18色谱柱在离心管中用混合物冲洗两次(10mL/次)。每次洗涤后测量RP-C18色谱柱的残留放射性剂量。RP-C18色谱柱在10mL小瓶中用500μL乙醇洗涤。如表3所示，使用分析HPLC法，通过放射性HPLC测定纯化产物的放射化学纯度(结果如图8中C线)。纯化后的[18F]GLNTGT的放射化学产率，比活度和放射化学纯度分别为9.15±5％，31.71±7.4GBq/μmol和大于96％。
表3[18F]GLNTGT的HPLC分析方法
实验例1血清稳定性
将实施例2中制备的示踪剂[18F]GLNTGT(20μL，0.074MBq)添加到分别装有胎牛血清(90μL)和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)(90μL)的不同离心管中。然后将离心管在37℃下孵育1小时，2小时和4小时。在每个时间点收集10μL的孵育样品，然后向其中各加入10μL乙腈以沉淀血清蛋白。通过将孵育样品离心(12000rpm，1分钟)，以获得用于放射-HPLC分析的上清液。上清液的放射-HPLC分析方法示于实施例2中表3。
结果如图8所示(图中的线D、E、F和G线)，在4小时的孵育过程中，[18F]GLNTGT在PBS和胎牛血清中始终稳定。
实验例2亲脂性
通过摇瓶法测定示踪剂[18F]GLNTGT在饱和正辛醇/去离子水(pH 7.4)中的亲脂性。简而言之，将[18F]GLNTGT加入到15mL离心管中的正辛醇(5mL)与去离子水(5mL)混合的预饱和溶液中。摇动混合物后，将其离心(3000rpm，5分钟)。从两相中取出等分的混合溶液，并在γ-计数器(2480，Perkin Elmer，USA)中测量放射性。通过以下等式计算Log D7.4：LogD7.4＝Log(正辛醇相中放射性计数的平均值±SD/水相中放射性计数的平均值±SD)。计算结果为示踪剂[18F]GLNTGT的Log D7.4值为0.39±0.25(n＝3)，表明示踪剂是疏水的。
实验例3
细胞培养和动物模型
人前列腺癌LNCaP细胞系和PC-3细胞系购自中国科学院细胞系(上海，中国)。将细胞在添加有FBS，青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2培养箱(3111，Thermo Scientific，美国)中培养。用PBS洗涤生长至80-90％汇合的细胞，并用胰蛋白酶消化传代。用细胞计数板对收集的细胞数进行计数。
雄性SCID小鼠(4-5周龄，15-20g)购自Cavens实验动物有限公司(常州中国)进行动物实验。将SCID雄性小鼠分为两组(每组三只小鼠)，并在SPF环境条件下维持一周。将PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3细胞悬液(200μl中含5×106个细胞)分别注入不同组小鼠的右腋下。注射后每两天测量一次肿瘤体积，直到观察到肿瘤外观轮廓为止。动物实验方案经江苏省核医学研究所动物护理与民族委员会批准。
细胞摄取研究
在PSMA(+)LNCaP细胞和PSMA(-)PC-3细胞上进行了细胞摄取实验。用0.25％胰蛋白酶溶液消化LNCaP细胞和PC-3细胞。根据实验方案，将PSMA(+)LNCaP细胞(1×106/管)和PSMA(-)PC-3细胞分成离心管以容纳(1×106/管)。然后将[18F]GLNTGT(100μL，0.037MBq)添加到装有新鲜培养基的离心管中。将所有样品分别在37℃、5％CO2下孵育15分钟，30分钟，60分钟和120分钟。在每个时间点，将冷PBS(预冷4℃)添加至500μL停止摄入。将离心管离心(12000rpm，3分钟)并丢弃上清液。通过γ计数器对收获的细胞的活性进行计数。
细胞毒性测定
用0.25％的胰蛋白酶溶液(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)和含有10％胎牛血清的1640培养基(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)消化具有不同PSMA表达的前列腺癌细胞。将消化细胞接种在96孔板中。每个孔中在前列腺癌细胞中添加100μL具有不同PSMA表达的培养基(8×103个/孔)。将96孔板在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。根据实验方案，非放射性化合物GLNTGT设置为5个浓度梯度(6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM)。每个浓度梯度设置6个平行组。将不同浓度的非放射性化合物GLNTGT的96孔板在5％CO2、37℃培养箱中放置24小时。温育后，将MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)20μL(5mg/mL)溶液添加到每个孔中。然后在37℃、5％CO2培养箱中孵育96孔板4h，弃去上清液。向每个孔中添加150μL DMSO，并振摇15分钟。使用酶标仪(BioTekInstruments，Inc.Vermont，USA)在490nm的波长下测量每个孔。通过细胞活力评估示踪剂的细胞毒性。
体外竞争结合试验
将LNCaP细胞接种在6孔聚-D-赖氨酸包被的平板上48小时(4×105个/孔)。当除去培养基并用HEPES缓冲盐水(50mM，pH 7.4，质量百分比0.9％NaCl)代替时。1小时后，将[18F]GLNTGT(0.1nM)添加到每个孔中(一式三份)，每个孔中包含不同浓度(0.01nM-100μM)的非放射性化合物GLNTGT溶液。将测定混合物在37℃、5％CO2温育箱中温育60分钟，并缓慢搅拌，然后用冷HEPES缓冲盐水(4℃)洗涤3次。将胰蛋白酶溶液(0.25％，400μL，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)添加到每个孔中以收获细胞。通过γ计数介质计数测量放射性，并使用Graphpad Prime 8.0软件计算Ki值。
体外CT成像
非放射性化合物GLNTGT被DMF稀释成不同的浓度梯度(0-350mM)。Micro-CT扫描不同浓度的非放射性化合物GLNTGT的CT对比效果。设置成像参数：厚度，80nm；电压40kV；电流为200μA[14]。霍恩斯菲尔德单位(Hu)值由Hiscan Viewer软件确定。
PET成像研究
将移植瘤小鼠固定并麻醉(2％异氟醚氧)，经尾静脉静脉注射[[18F]GLNTGT(5.4-5.7MBq)或[18F]AlF-NOTA-RGD2(5.4-5.7MBq)([18F]AlF-NOTA-RGD2根据Liu S,Liu H,JiangH,Xu Y,Zhang H,Cheng Z.One-step radiosynthesis of18F-AlF-NOTA-RGD2 for tumorangiogenesis PET imaging.European journal of nuclear medicine and molecularimaging.2011,38(9):1732-41.)。通过微型PET扫描仪(Inveon，Siemens，德国)进行动态(60min)和静态PET扫描(10min)。扫描完成后，使用2D有序子集期望最大化(2D-OSEM)算法重建PET图像，并使用Siemens IRW软件进行分析。每克肿瘤组织摄取的百分比(％ID/g)，用于对每个目标区域(ROI)的重复剂量进行半定量评估。对照示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2使用与示踪剂[18F]GLNTGT相同的条件进行PET成像。
在这项研究中，细胞和动物实验的放射性数据表示为平均值±标准差。使用Student t检验比较均值；当P<0.05被认为是显着差异时，否则没有显着差异。
结果如下：
体外摄取研究结果
使用LNCaP细胞和PC-3细胞评估了PSMA介导的示踪剂[18F]GLNTGT的摄取。如图9a所示，在PSMA(+)LNCaP(图中LNCaP)细胞中，示踪剂[18F]GLNTGT在15分钟时的细胞摄取迅速增加至15.90±0.43％AD，然后缓慢增加至120分钟时的17.61±1.71％AD。在PSMA(-)PC-3(图中PC-3)细胞中，示踪剂[18F]GLNTGT的细胞摄取也从15分钟时的9.47±1.26％AD逐渐增加到120分钟时的13.02±0.65％AD。
细胞毒性测定
非放射性化合物GLNTGT的细胞毒性决定了具有不同PSMA表达的前列腺癌细胞。如图9b所示，在PSMA(+)LNCaP(图中LNCaP)细胞中，非放射性化合物GLNTGT的细胞活力从6.25μM中的0.98±0.02略微降低到100μM中的0.92±0.01。在PSMA(-)PC-3(图中PC-3)细胞中，非放射性化合物GLNTGT的细胞活力也从6.25μM中的0.99±0.01略微降至100μM中的0.94±0.01。
体外竞争结合试验测定
示踪剂[18F]GLNTGT对PSMA的抑制常数(Ki)使用LNCaP细胞和示踪物[18F]GLNTGT通过体外竞争结合方法确定。示踪剂的PSMA竞争抑制曲线如图10所示。[18F]GLNTGT的Ki值为0.49nM(95％CI：0.35-0.67nM)。
体外CT实验
CT值随溶液浓度线性增加，非放射性化合物GLNTGT溶液的CT图像表现出明显的浓度依赖性作用，结果如图11所示。
体内PET成像
[18F]GLNTGT的高稳定性和特异性表明该示踪剂适用于进一步的生物学研究。如图12a的PET图像所示，注射后15分钟到60分钟，在PSMA(+)LNCaP(图中LNCaP)肿瘤中清楚地观察到了示踪剂[18F]GLNTGT的摄取，但在PSMA(-)PC3(图中PC3)肿瘤中没有摄取。图12b显示了示踪剂[18F]GLNTGT在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中的摄取曲线。示踪剂[18F]GLNTGT在PSMA(+)LNCaP肿瘤中最高摄取(注射后45分钟时为3.51±0.15％ID/g)显示比PSMA(-)PC-3肿瘤(注射后15分钟时为1.19±0.31％ID/g)中最高摄取更高。图12c显示了示踪剂[18F]GLNTGT在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中的T/M比值。在PET动态扫描期间，PSMA(+)LNCaP肿瘤中示踪剂[18F]GLNTGT的T/M比值逐渐增加(注射后60分钟，T/M最大摄取比值为3.68±0.29)。示踪剂[18F]GLNTGT在PSMA(-)PC-3肿瘤中注射后30分钟达到最大T/M摄取比值为1.46±0.39，之后T/M摄取比值逐渐降低。
从图13a的PET图像中可以看出，在示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2注射后从15分钟到30分钟的PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC3肿瘤中均清楚地观察到摄取。图13b显示了示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中的肿瘤吸收曲线。示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2在注射后7.5分钟时，PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中最高摄取量分别为4.20±0.54％和5.70±0.79％ID/g。示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2注射后在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤明显吸收。图13c表明示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中的T/M比值。示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2在PSMA(+)LNCaP和PSMA(-)PC-3肿瘤中最大T/M比值是在注射后45分钟时为2.72±0.63和在注射后15分钟时为2.08±0.79。
结论
本发明的示踪剂[18F]GLNTGT在体外具有良好的稳定性，因此适用于随后的体内和体外实验。非放射性化合物GLNTGT在具有不同PSMA表达的前列腺癌细胞中表现出良好的生物相容性。对PSMA的特异性靶向确定了示踪剂[18F]GLNTGT具有较高的肿瘤细胞摄取率。示踪剂[18F]GLNTGT由于其特定的疏水作用而对PSMA具有高结合亲和力。PET成像的结果表明，[18F]GLNTGT组的小鼠对比对照示踪剂[18F]AlF-NOTA-RGD2具有更高靶本比。尽管示踪剂[18F]GLNTGT在细胞和体内CT信号检测实验中有一些局限性，但仍为PET/CT示踪剂的开发提供了参考。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (25)
1.一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针，其特征在于，具有如下式所示的结构：
2.一种前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体，其特征在于，具有如下式所示的结构：
3.一种如权利要求2所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将Fmoc-3-(2-萘基)-L-丙氨酸进行缩合反应得到化合物1；
将化合物1和N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸进行缩合反应得到化合物2；
将化合物2和Fmoc-L-炔丙基甘氨酸进行缩合反应得到化合物3；
将化合物3和2,3,5-三碘苯甲酸进行缩合反应得到中间体化合物B；
将中间体化合物B和化合物4进行缩合反应得到化合物5；
将化合物5进行脱保护反应得到化合物6；
将化合物6和三氟硼酸氨甲基酯进行点击化学反应得到化合物GLNTGT；合成路线如下：
4.根据权利要求3所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物2的步骤中，向化合物1中加入N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应。
5.根据权利要求4所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物2的步骤中，振摇反应3小时。
6.根据权利要求4所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物2的步骤中，所述的N-Fmoc-4-氨基甲基环己烷羧酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL。
7.根据权利要求4所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物2的步骤中，用N，N-二异丙基乙胺调节pH 8-9。
8.根据权利要求3或4所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物3的步骤中，向化合物2中加入Fmoc-L-炔丙基甘氨酸，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应。
9.根据权利要求8所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物3的步骤中，振摇反应3小时。
10.根据权利要求8所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物3的步骤中，所述的Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL。
11.根据权利要求8所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物3的步骤中，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
12.根据权利要求3-7任一项所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备中间体化合物B的步骤中，向化合物3中加入2,3,5-三碘苯甲酸，氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺，调节pH至8-9，振摇反应。
13.根据权利要求12所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备中间体化合物B的步骤中，振摇反应3小时。
14.根据权利要求12所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备中间体化合物B的步骤中，所述的2,3,5-三碘苯甲酸、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N’N-二甲基甲酰胺的用量比为：1.25:2:10，eqv:eqv：mL。
15.根据权利要求12所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备中间体化合物B的步骤中，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
16.根据权利要求3-7任一项所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物5的步骤中，将中间体化合物B、化合物4、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N，N-二甲基甲酰胺混合，调节所得混合物的pH至8-9，在氮气条件下室温搅拌反应。
17.根据权利要求16所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物5的步骤中，搅拌反应3小时。
18.根据权利要求16所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物5的步骤中，中间体化合物B、化合物4、氧苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸盐和N，N-二甲基甲酰胺的用量比例为：1:1.3:1.2:5，eqv:eqv:eqv：mL。
19.根据权利要求16所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物5的步骤中，用N，N-二异丙基乙胺调节pH。
20.根据权利要求3-7任一项所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物GLNTGT步骤中，向化合物6中加入三氟硼酸氨甲基酯、五水硫酸铜、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、L-抗坏血酸钠和N’N-二甲基甲酰胺水溶液，在氮气条件下室温搅拌反应。
21.根据权利要求20所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物GLNTGT步骤中，搅拌反应30分钟。
22.根据权利要求20所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物GLNTGT步骤中，所述化合物7、三氟硼酸氨甲基酯、五水硫酸铜、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、L-抗坏血酸钠的用量比例：1:4:0.5:0.5:1，eqv:eqv：eqv：eqv：eqv。
23.根据权利要求20所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体的制备方法，其特征在于，
在制备化合物GLNTGT步骤中，所述N’N-二甲基甲酰胺水溶液为N’N-二甲基甲酰胺和水的体积比4：1的混合溶液。
24.一种如权利要求1所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针的制备方法，其特征在于，将权利要求2中所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体或权利要求3-23任一项所述的制备方法制备得到的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针前体进行放射性核素18F标记。
25.权利要求1所述的前列腺特异性膜抗原靶向分子探针的用途：
(1)制备前列腺癌靶向的PET、CT或PET/CT示踪剂中的用途；
(2)制备前列腺特异性膜抗原靶向的PET、CT或PET/CT示踪剂中的用途。
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