CN107056890B - 一种18f标记的多肽类肿瘤凋亡检测试剂及其制备方法及应用 - Google Patents

一种18f标记的多肽类肿瘤凋亡检测试剂及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于放射性药物及核医学技术领域，具体涉及一种18F标记的多肽化合物，并进一步公开其用于制备肿瘤凋亡检测试剂的应用。本发明所述的18F标记的多肽化合物18F‑AmBF3‑GDEVD(探针18F‑1)，采用固相多肽合成的方法，合成了产率高、纯度高的多肽，然后通过“点击化学”引入18F标记基团，得到产率高的标记前体1，再进一步通过一步18F标记法成功制备了高产率、高纯度的PET探针18F‑1，整个反应简化了18F‑标记步骤，避免了标记过程中的半制备HPLC纯化，缩短了标记时间。同时显示探针18F‑1是一种潜在的靶向Caspase‑3的凋亡显像探针，有较好的应用前景。

Description

一种18F标记的多肽类肿瘤凋亡检测试剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明属于放射性药物及核医学技术领域，具体涉及一种18F标记的多肽类肿瘤凋亡检测试剂，并进一步公开其制备方法和应用。
背景技术
诱导肿瘤细胞凋亡是多种肿瘤治疗的主要作用机制之一，因此测定肿瘤细胞是否产生凋亡已成为评价肿瘤治疗疗效的一种重要指标。当前检测肿瘤细胞凋亡的方法主要有体外、体内两大类方法：传统的体外检测方法较为成熟，但只能检测某一时间点的细胞凋亡状态，不能实时、动态地检测肿瘤细胞凋亡的发生和发展过程，因此限制了体外检测方法的临床广泛应用。而体内检测方法则由于可以动态监测细胞的凋亡情况，受到广泛关注。
随着分子影像技术的不断发展，无创的放射性核素显像已成为目前检测肿瘤细胞凋亡的研究热点，其中主要包括单光子发射计算机断层成像(Single Photon EmissionComputed Tomography，SPECT)与正电子发射断层成像(Positron Emission Tomography，PET)。与SPECT显像相比，PET显像具有明显的优势，如灵敏度高、空间分辨率强，并能够进行动态、定量、定位分析等优势，因此，有关于肿瘤凋亡监测的PET显像剂的研究越来越多。
目前，常用于PET显像的凋亡显像剂的主要靶点有磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartatespecific proteinase，简称Caspase)，但靶向PS的显像剂难以区分肿瘤凋亡和坏死，识别靶点仅限于膜表面，因此显像灵敏度相对不高；而Caspase-3由于只存在凋亡细胞中，因此以Caspase-3为靶点的PET显像剂则比以PS为靶点的显像剂的特异性更高。
Caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，参与细胞的生长、分化与凋亡调节，并且与细胞的凋亡密切相关。其中，Caspase-3是起凋亡执行者的作用，在正常细胞中处于非活化的酶原状态，而当细胞发生凋亡作用时则表现为激活状态，而激活的Caspase-3可以特异性地识别氨基酸序列结构Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)。因此，以Caspase-3为靶点，选择可被其特异性识别的多肽序列DEVD为靶向基团制备新型肿瘤凋亡显像探针得到了迅速发展，并且通过荷瘤鼠PET显像也已经证实了它们在检测细胞凋亡方面的优势。
然而，这些标记探针在放射性标记方面则存在一些缺陷，首先在制备方法上，现有标记探针均是通过两步法完成：首先利用亲核取代反应从对甲苯磺酰基(OTs)上将18F离子引入，然后通过“点击化学”反应将标记基团与多肽序列相连，得到目标探针。其中，氟化过程需要在无水条件下进行，并需要半制备HPLC法进行纯化，反应条件较苛刻且步骤较为繁琐，并导致标记时间过长。最近，Zhibo Liu等人成功地将一步18F-19F离子交换法运用到探针的制备中，简化了探针的标记步骤，一定程度上缩短了合成时间，并且避免了半制备HPLC的纯化。同时，该标记方法所需的反应条件温和，具有一定的通用性，已被运用到一系列放射性PET探针的制备中。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种18F标记的多肽化合物，并进一步公开其用于制备肿瘤凋亡检测试剂的应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种18F标记的多肽化合物，所述多肽化合物记为18F-AmBF3-GDEVD，具有如下所示的结构：
Figure BDA0001260241540000031
本发明还公开了所述18F标记的多肽化合物的标记前体，具有如下式(1)所示的结构：
Figure BDA0001260241540000032
本发明还公开了一种制备所述标记前体的方法，包括如下步骤：
(1)接氨基酸：取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯溶解，在DIPEA存在下与树脂进行反应；随后抽干反应溶剂，并加入洗涤试剂进行洗涤，洗涤至无裸露的氨基；
Figure BDA0001260241540000033
(2)脱Fmoc基团：向上述反应物中加入哌啶，抽干溶剂并洗涤至Fmoc保护基脱除；
Figure BDA0001260241540000034
(3)取Fmoc-L-缬氨酸加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure BDA0001260241540000041
(4)取Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure BDA0001260241540000042
(5)取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure BDA0001260241540000043
(6)取N-Boc-D-炔丙基甘氨酸加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)进行氨基酸的连接，并加入含TFA的DCM溶液洗涤脱除树脂；
Figure BDA0001260241540000044
(7)取上述反应物溶于有机溶剂，在TFA和TIPS存在下进行反应，脱除叔丁基；
Figure BDA0001260241540000051
(8)在氮气保护下，向上述反应物中加入AmBF3试剂，溶于DMF-H2O溶剂，在抗坏血酸盐和铜催化剂存在下，于40-50℃下进行反应，并通过半制备型HPLC进行分离纯化，得到黄色固体粉末，即得式(1)所示标记前体；
Figure BDA0001260241540000052
所述AmBF3试剂的结构如反应方程式所示，可以选用现有市售产品，或者可以根据现有文献方法进行合成，产物为黄色油状物，m＝1.12g。
所述步骤(1)中，还包括对所述树脂进行前处理的步骤，具体包括将选定树脂溶于二氯甲烷溶剂的步骤，并抽干溶剂。
所述步骤(1)中，所述洗涤步骤具体包括：以体积比为17：2：1的DMF-CH3OH-DIPEA混合溶剂进行洗涤，抽干试剂后再加入DMF溶剂进行洗涤。
所述步骤(6)中，还包括提纯反应物的步骤，具体包括：将反应物抽滤，取滤液旋干，加入乙醚溶剂洗涤，固液分离后取固体干燥，得到白色固体粉末。
所述步骤(7)中，还包括提纯反应物的步骤，具体包括：取反应物旋蒸得到油状液体，加入乙醚溶剂洗涤，固液分离后取固体干燥，得到灰色固体粉末。
所述步骤(7)中，所述有机溶剂包括DCM、THF或者CH3CN。
所述步骤(8)中，所述铜催化剂为CuSO4·5H2O或六氟磷酸四(乙腈)铜(Ⅰ)。
本发明还公开了一种制备所述18F标记的多肽化合物的方法，取所述标记前体化合物与18F离子，在加热条件下，进行标记反应，制得所述的18F标记的多肽化合物18F-AmBF3-GDEVD。
本发明还公开了所述的18F标记的多肽化合物用于制备肿瘤凋亡检测试剂的用途。
本发明还公开了一种肿瘤凋亡检测试剂，包括所述的18F标记的多肽化合物。
本发明所述的18F标记的多肽化合物18F-AmBF3-GDEVD(探针18F-1)，采用固相多肽合成的方法，以不溶树脂作为固相载体，按顺序连接Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯、Fmoc-L-缬氨酸、Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸、Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯和N-Boc-D-炔丙基甘氨酸，获得Gly-Asp-Glu-Val-Asp(GDEVD)，产物纯度达98％以上；在合成所述标记前体化合物1时，“点击化学”反应具有产率高，反应条件温和，且产物易于分离的优点，故通过“点击化学”反应使多肽2上的炔基与AmBF3试剂上的叠氮在抗坏血酸钠和五水硫酸铜的作用下发生环加成反应，成功引入了用于一步18F标记的基团，整个反应条件温和，且所得产物产率较高、纯度较高。
本文首先通过固相法成功合成了产率高、纯度高的多肽，然后通过“点击化学”引入18F标记基团，得到产率高的标记前体1，再进一步通过一步18F标记法成功制备了高产率、高纯度的PET探针18F-1，整个反应简化了18F-标记步骤，避免了标记过程中的半制备HPLC纯化，缩短了标记时间。
本发明所述的18F标记的探针具有良好的体外稳定性和亲水性，同时含有可被Caspase-3特异性识别的DEVD序列。用阿霉素对肿瘤细胞Hela作用后可以看到明显的凋亡特征，Caspase-3水平随药物浓度增加而升高。所得探针18F-1在肿瘤细胞及肿瘤凋亡细胞中摄取有明显的差异，不同作用时间点下相对摄取值达到凋亡前的2.5-3.0倍，说明探针能被Caspase酶有效识别，且在较短的时间内能够看到显著的差异。这些特点均表明探针18F-1是一种潜在的靶向Caspase-3的凋亡显像探针，有较好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为标记前体化合物1的HPLC分析图；
图2为标记前体化合物1的核磁共振氢谱；
图3为标记前体化合物1的核磁共振碳谱；
图4为标记前体化合物1的核磁共振氟谱；
图5为探针18F-1的放射性HPLC分析图；
图6为标记产物18F-1在PBS与血清中孵育不同时间的放化纯；
图7为Hela细胞在不同药物浓度作用下的Caspase 3水平变化情况；
图8为探针18F-1在肿瘤细胞及肿瘤凋亡细胞中摄取的差异情况。
具体实施方式
实施例1标记前体的合成
本实施例所述标记前体1的合成路线如下：
Figure BDA0001260241540000081
本实施例所述标记前体1的合成包括如下步骤：
(1)接氨基酸：称取2-氯三苯甲基氯树脂(544mg，Loading值：1.106mmol/g)置于三通砂芯漏斗中，再加入10mL二氯甲烷(DCM)溶剂，振荡10min，抽干溶剂；
称取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯(272mg，0.662mmol)溶于3mLDMF溶剂，而后加入DIPEA(200μL，1.212mmol)，超声溶解后加入砂芯漏斗中与树脂进行反应，并于室温下振荡2h；随后抽干溶剂，并加入7mL溶液R(色谱纯DMF：CH3OH：DIPEA＝17：2：1)于三通砂芯漏斗中进行洗涤振荡10min，抽干溶剂后，再用7mL DMF溶剂洗涤，随后抽干溶剂，并再加入上述溶液R进行洗涤，振荡10min后抽干溶剂，并再加入7mLDMF溶剂洗涤两次，抽干溶剂；取一点样品进行Kaiser测试，显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基；
(2)脱Fmoc基团：向上述砂芯漏斗中加入7mL含20％哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽干溶剂，重复2次，再用7mLDMF洗涤5次并抽干；直至进行Kaiser测试，显示为深蓝色，说明有裸露的氨基，Fmoc保护基已经脱除；
(3)称取Fmoc-L-缬氨酸(224mg，0.662mmol)，HBTU(276mg，0.728mmol)，DIPEA(200μL，1.212mmol)，溶于DMF溶剂进行反应，按照上述步骤(1)-(2)中方法进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
(4)称取Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸(281mg，0.662mmol)，HBTU(276mg，0.728mmol)，DIPEA(200μL，1.212mmol)，溶于DMF溶剂进行反应，按照上述步骤(1)-(2)中方法进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
(5)称取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯(272mg，0.662mmol)，HBTU(276mg，0.728mmol)，DIPEA(200μL，1.212mmol)，溶于DMF溶剂进行反应，按照上述步骤(1)-(2)中方法进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
(6)称取N-Boc-D-炔丙基甘氨酸(244mg，0.728mmol)，HBTU(276mg，0.728mmol)，DIPEA(200μL，1.212mmol)，溶于DMF溶剂进行反应，按照上述步骤(1)中方法进行氨基酸的连接，得到淡黄色固体；随后向砂芯漏斗中加入含1wt％TFA的DCM溶液，经洗涤、抽滤，并收集滤液，直至树脂出现深红色且不褪色；随后将滤液旋干，加入20mL乙醚溶液，经离心弃去上清液，收集沉淀，放入真空干燥箱干燥，得到白色固体粉末，检测产物m＝385mg，计算产率为60.5％；
(7)取上述得到的多肽反应物(200mg)于反应瓶中，加入2mL DCM和2mL TFA，进行反应20min后，加入50μL TIPS，并继续反应30min，以薄层色谱(TLC)法进行检测(DCM：CH3OH＝5:1)产物情况，至判定反应结束时停止反应，旋蒸得到油状液体，加入10mL乙醚溶液洗涤，离心并弃去液体，将沉淀放入真空干燥箱干燥，得到灰色固体粉末产物，检测m＝156mg，计算产率为94.5％；
(8)在氮气保护下，将上述所得反应物(116mg，0.146mmol)，和AmBF3试剂化合物4(43mg，0.219mmol)，溶于3mL DMF-H2O(1：1，v/v)溶剂中，将抗坏血酸钠(58mg，0.292mmol)、CuSO4·5H2O(73mg，0.292mmol) 依次加入上述溶液中，于45℃下加热反应30min；以TLC法检测产物情况(DCM：CH3OH＝5:1)，至判定反应结束时停止反应；通过半制备型HPLC(纯化方法如下表1所示)进行分离纯化，得到黄色固体粉末，检测m＝108mg，计算产率为74.6％。通过分析型HPLC(方法如下表2所示)对终产物进行纯度检测，结果如附图1所示，产物纯度大于98％。
表1检测前体1的半制备型HPLC梯度淋洗方法
Figure BDA0001260241540000101
表2分析型HPLC梯度淋洗方法
Figure BDA0001260241540000102
通过核磁、质谱和元素分析对制得的标记前体化合物1进行表征。以d6-DMSO为溶剂，测定标记前体化合物1的核磁共振氢谱1H NMR、核磁共振碳谱13C NMR和核磁共振氟谱19FNMR，谱图分别见图2-4；以甲醇作为溶剂，采用质谱仪测定化合物的电喷雾质谱；用元素分析仪对标记前体化合物1进行元素分析。
以d6-DMSO为溶剂测定标记前体1，核磁结果如下：1H NMR(d6-DMSO,400MHz),δ(ppm):8.46(s,4H),8.29(s,1H),7.92(d,J＝12.00Hz,2H),7.88(d,J＝4.00Hz,2H),7.63(s,1H),7.42(t,J＝6.00Hz,2H),7.33(t,J＝8.00Hz,2H),4.83(m,2H),4.55(m,2H),4.32(m,2H),4.20(m,4H),3.73(t,J＝8.00Hz,2H),3.11(m,2H),2.95(m,8H),2.70(m,2H),2.58(m,2H),2.39(m,1H),2.26(m,2H),1.97(m,2H),0.84(m,J＝4.00Hz,6H)；13C NMR(101MHz,d6-DMSO),δ(ppm):174.56,172.68,172.15,172.03,171.60,171.19,170.97,170.25,156.31,144.26,141.13,128.10,127.57,126.82,125.81,124.19,120.55,66.28,63.91,57.55,54.87,53.98,53.47,52.46,50.20,47.01,46.16,41.79, 36.36,31.32,30.61,28.54,27.73,22.66,19.55；19F NMR(376MHz,d6-DMSO),δ(ppm):-135.8。
在1H NMR(图4)中，δ7.63ppm为三氮唑环上氢的信号峰，这表明“点击化学”反应成功；δ7.92,7.88,7.42,7.33ppm分别对应芴环上氢的信号峰，δ2.95ppm对应与季铵相连的两个甲基上氢的信号峰，δ0.84ppm对应缬氨酸上与叔碳相连的两个甲基上氢的信号峰。
13C NMR(图5)中，δ124.19,128.10ppm对应三氮唑环上碳的信号峰，δ174.56,172.68,172.15,172.03,171.60,171.19,170.97,170.25,156.31ppm对应羰基上碳的信号峰，δ144.26,141.13,127.57,126.82,125.81,124.19ppm对应芴环上6组碳的信号峰。
19F NMR(图6)中，δ-135.8ppm对应三氟硼酸盐上氟的信号峰，δ-73.4ppm对应未除去的三氟乙酸中氟的信号峰。
核磁结果表明前体1的实际结构与预计的理论结构一致。
质谱分析结果ESI-MS：测定值：970.52[M-F]+，1012.59[M+Na]+；计算值：970.39[M-F]+，1012.38[M+Na]+。
元素分析结果为：C43H55BF3N9O14：C 52.74(52.18)，H 5.43(5.60)，N12.33(12.74)，括号中为理论值，分析结果表明实测值和理论值基本吻合。
可见，核磁、质谱和元素分析均表明所得化合物为目标化合物1。
实施例2多肽化合物18F-AmBF3-GDEVD的合成
通过电子轰击富氧水H2 18O，得到18F离子，经阴离子交换柱(QMA)吸附18F离子，用300μL哒嗪(pH＝2.5)的缓冲液将18F离子从QMA柱上洗脱，转移到1mL的标记反应管中，加入10-20μL(25mmol/L，溶于DMF)的实施例1制得的标记前体化合物1，在80℃下，加热30min反应，即得多肽化合物18F-AmBF3-GDEVD，记为探针18F-1。
取微量放射性溶液稀释，通过放射性高效液相检测前体的标记情况。向反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(SepPak plus C-18)纯化，用去离子水(10mL)洗涤三次，最后用0.5mL乙醇将标记产物淋洗到西林瓶中，加入4.5mL去离子水稀释(乙醇含量≤10％)。取少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测纯化情况。
如图5放射性HPLC检测显示，标记产物的保留时间为16.8min，放化纯(RCP)大于98％。标记产物的保留时间与标记前体在紫外吸收下的保留时间(tR＝16.6min)基本一致，表明标记成功。经衰变校正后，标记产物的放射化学产率为40％，比活度为1.5Ci/μmol。
在凋亡探针18F-1的制备过程中，18F标记总时间为40min。与用-OTs制备凋亡探针的方法相比，通过一步18F标记法制备凋亡探针18F-1，简化了标记步骤，标记过程中无需半制备HPLC纯化，大大缩短了标记时间，更适用于适合临床应用。
实验例
1、PBS和血清中稳定性测定
为了模拟体内环境，分别考察了18F-1在PBS(pH＝7.4)与血清中的稳定性。取4份400μL PBS(pH＝7.4)缓冲液与100μL标记产物18F-1溶液分别混合，在37℃下分别加热0.5、1、2、3和4h。取少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测标记产物的稳定性。
取4份400μL胎牛血清与100μL标记产物18F-1溶液分别混合，在37℃下分别孵育0.5、1、2、3和4h。到时间点后再加入500μL乙腈，用高速离心机在12000g/min下离心5min，取上层清液，用放射性高效液相检测标记产物的稳定性。
通过放射性HPLC检测器检测不同孵育时间点18F-1的放射性化学纯度，结果如图6所示，探针18F-1在4h内的放化纯均大于96％。这表明该探针在体外具有良好的稳定性，有利于临床使用，值得进一步的体内实验研究。
2、脂水分配系数测定
脂水分配系数是考察药物水溶性与脂溶性的重要参数。水溶性差的药物在体内软组织摄取较高，容易导致药物显像本底偏高，降低肿瘤显像的效果。
将PBS缓冲液与等体积的正辛醇充分振荡，使两相相互饱和，在室温下静置24h，用分液漏斗将两相分离。取1mL正辛醇、0.95mL PBS缓冲液和0.05mL标记产物18F-1溶液混合，用涡旋混合器振荡5min，充分混匀。离心机4000g/min下离心5min，在有机相和水相中分别平行取3个样品(100μL)于γ计数管中，用γ计数仪测定其放射性活度，每个样品测定3次，计算脂水分配系数(log P值)。
通过放射性方法测定探针18F-1的脂水分配系数为log P＝-0.995±0.103，这说明该探针具有良好的亲水特性，预示着其他软组织的摄取可能较低，组织靶向性可能较好。
3、细胞凋亡确定
试剂：RIPA裂解液及active-caspase3抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；β-actin抗体、HRP标记二抗、Western Blotting Luminol试剂为美国Santa Cruz公司产品；蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自美国Thermo Fisher科技公司。
方法：将Hela细胞以5×105个/孔的浓度铺至6孔板，然后用不同浓度的ADR作用24h，去除培养液，将细胞用冰浴PBS洗一遍，然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液于4℃裂解5分钟。将上述裂解液于4℃条件下12000rpm离心10min，取上清，BCA法测蛋白浓度，上样40μg蛋白至12％SDS-PAGE进行电泳。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜，用TBS洗膜2次，每次10min，然后用TBS+0.1％Tween-20+5％脱脂奶粉室温封闭1h，封闭结束后，TBST洗膜10min，然后加入抗体稀释液：TBST+5％脱脂奶粉+一抗，4℃孵育过夜。然后用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入抗体稀释液：TBST+5％脱脂奶粉+二抗，室温孵育1h。然后用TBST洗膜3次，每次10min，使用Western Blotting Luminol试剂进行曝光，使用ImageJ软件对条带光密度进行分析。
测定Hela细胞在不同药物浓度作用下的Caspase 3水平变化情况，结果见图7所示。可见，随着浓度的增加，活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(active-Caspase 3)表达呈现显著上升趋势，表现出浓度依赖性。当所给药物阿霉素的浓度达到1umol/L以上时，表达更为显著。通过此测定，明确了细胞凋亡的给药浓度应大于1umol/L。
4、细胞摄取实验
取人的宫颈癌(Hela)细胞以4×105/孔的密度接种到6孔板中，放入37℃培养箱中过夜培养。第二天将这些孔分成两组，第一组细胞将原有培养基吸去换为新鲜培养基继续孵育24h。第二组换为含2μM的阿霉素的培养基培养24h。而后将放射性药物W43以1μCi/孔的量加入到6孔板中，分别培养0.5、1、2、4h。在孵育结束后，吸去培养基，将细胞用PBS缓冲液冲洗3次。每孔加入1mL的胰酶消化液，收集细胞裂解液，用γ计数仪测量放射性计数。对每孔中的细胞进行蛋白浓度标准化后，得到正常细胞与凋亡细胞的摄取比例，测定结果见图8所示。
通过细胞摄取实验，对比探针18F-1在凋亡细胞和正常细胞中的摄取差异(如图8)，明显可以看出，探针18F-1在凋亡细胞中的摄取高于其在正常细胞中的摄取，具有统计学意义，为后续的动物PET实验提供了实验依据。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种制备18F标记的多肽化合物的标记前体的方法，其特征在于，18F标记的多肽化合物的标记前体具有如下式(1)所示的结构：
Figure FDA0002708520380000011
制备18F标记的多肽化合物的标记前体的方法包括如下步骤：
(1)接氨基酸：取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯溶解，在DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)存在下与树脂进行反应；随后抽干反应溶剂，并加入洗涤试剂进行洗涤，洗涤至无裸露的氨基；
Figure FDA0002708520380000012
(2)脱Fmoc基团：向上述反应物中加入哌啶，抽干溶剂并洗涤至Fmoc保护基脱除；
Figure FDA0002708520380000013
(3)取Fmoc-L-缬氨酸加入上述反应物中，在HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure FDA0002708520380000014
(4)取Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure FDA0002708520380000021
(5)取Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)-(2)进行氨基酸的连接以及Fmoc基团的脱除；
Figure FDA0002708520380000022
(6)取N-Boc-D-炔丙基甘氨酸加入上述反应物中，在HBTU和DIPEA存在下，重复上述步骤(1)进行氨基酸的连接，并加入含TFA的DCM溶液洗涤脱除树脂；
Figure FDA0002708520380000023
(7)取上述反应物溶于有机溶剂，在TFA和TIPS存在下进行反应，脱除叔丁基；
Figure FDA0002708520380000024
(8)在氮气保护下，向上述反应物中加入AmBF3试剂，溶于DMF-H2O溶剂，在抗坏血酸盐和铜催化剂存在下，于40-50℃下进行反应，并通过半制备型HPLC进行分离纯化，得到黄色固体粉末，即得式(1)所示标记前体；
Figure FDA0002708520380000031
2.根据权利要求1所述的制备标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括对所述树脂进行前处理的步骤，具体包括将选定树脂溶于二氯甲烷溶剂的步骤，并抽干溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的制备标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(1)-(6)的反应是在DMF溶液中进行的。
4.根据权利要求1或2所述的制备标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述洗涤步骤具体包括：以体积比为17：2：1的DMF-CH3OH-DIPEA混合溶剂进行洗涤，抽干试剂后再加入DMF溶剂进行洗涤。
5.根据权利要求1或2所述的制备标记前体的方法，其特征在于：
所述步骤(6)中，还包括提纯反应物的步骤，具体包括：将反应物抽滤，取滤液旋干，加入乙醚溶剂洗涤，固液分离后取固体干燥，得到白色固体粉末；
所述步骤(7)中，还包括提纯反应物的步骤，具体包括：取反应物旋蒸得到油状液体，加入乙醚溶剂洗涤，固液分离后取固体干燥，得到灰色固体粉末。
6.一种制备18F标记的多肽化合物的方法，其特征在于，所述18F标记的多肽化合物的记为18F-AmBF3-GDEVD，具有如下所示的结构：
Figure FDA0002708520380000032
所述制备18F标记的多肽化合物的方法包括如下步骤：
采用权利要求1-5任一项所述的方法制备所述标记前体化合物；
取所述标记前体化合物与18F离子，在加热条件下，进行标记反应，制得所述的18F标记的多肽化合物18F-AmBF3-GDEVD。
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