CN116003378B - 一种pd-l1靶向的分子探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PD‑L1靶向的分子探针及应用，属于化学技术领域。本发明提供了一种分子探针[18F]LP‑F，此分子探针对PD‑L1具有亲和力，在PD‑L1高表达的肿瘤中的摄取要高于PD‑L1低表达的肿瘤，能区分PD‑L1表达差异的肿瘤，并实现对瘤内PD‑L1表达水平的定量分析，同时，此分子探针能够较快到达PD‑L1阳性肿瘤，在30～50min时即可获得较好的显像效果，因此，此分子探针可以通过PET成像从分子水平上实时、动态及全身地监测原发灶及转移病灶中PD‑L1表达水平及变化，进而评估PD‑1/PD‑L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种PD-L1靶向的分子探针及应用，属于化学技术领域。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是一种相对分子质量为50～55kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多数高表达于活化的效应T细胞表面。细胞程序性死亡-配体1(Programmed Death-Ligand 1，PD-L1)是PD-1的主要配体，在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中高表达。PD-1/PD-L1通路信号激活后，不仅会抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖和活性，还会降低肿瘤微环境中T细胞的免疫杀伤作用，导致肿瘤免疫逃逸，使机体不能攻击和杀伤肿瘤细胞。
目前，靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的免疫疗法已广泛应用于癌症的临床治疗中。然而，临床上未经筛选的肿瘤患者使用PD-1/PD-L1阻断治疗后的整体响应率仅为15～40％。有研究表明，PD-L1表达越高的患者，免疫治疗后的客观缓解率越高，中位生存时间也越长，因此，可通过检测患者肿瘤中PD-L1的表达水平预测PD-1/PD-L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效(参见文献：Association ofPD-L1 expression status with the efficacy ofPD-1/PD-L1 inhibitors and overall survival in solid tumours:A systematic reviewand meta-analysis.Int J Cancer.2020；147(1):116-127.)。
现阶段，PD-L1在患者肿瘤中的表达主要是通过免疫组织化学(IHC)来评估的。但是，免疫组织化学仍存在很多缺陷，例如，免疫组织化学需要通过侵入式方法(比如穿刺、手术切除)获取肿瘤组织，而很多患者因为各种原因无法获取肿瘤组织，并且，部分肿瘤(比如白血病等非实体瘤)不适合该检测方法；免疫组织化学中使用的抗体种类不一，染色方法不同，PD-L1阳性判断标准不同，影响了PD-L1免疫组织化学检测的准确性；免疫组织化学只能检测出肿瘤组织样本病理切片中的PD-L1的表达水平，不能反映出患者全身或转移灶的PD-L1的表达水平；患者体内PD-L1的表达水平处于一个动态变化过程，例如肿瘤PD-L1的表达水平会受到患者接受的治疗方式的影响，而免疫组化无法持续跟踪该动态变化。
分子成像技术，尤其是PET成像技术，具有无创、灵敏度高等优点，可以从分子水平我方案号上实时、动态及全身地监测原发灶及转移病灶中PD-L1表达水平及变化。放射性标记的PD-L1抗体可以用于评估肿瘤中PD-L1的表达，并对不同肿瘤模型中PD-L1的表达进行成像。例如，Natarajan等人利用89Zr和64Cu标记Pembrolizumab抗体，得到可以靶向PD-1的抗体类PET显像剂，PET/CT显示其在PD-1高表达的肿瘤部位有较高的放射性摄取；Lesniak等人用64Cu标记抗PD-L1抗体Atezolizunmab，发现该抗体显像剂在PD-L1高表达的肿瘤细胞中的摄取高于PD-L1低表达的肿瘤细胞。然而，基于PD-1/PD-L1抗体设计的探针相对分子质量大，血池循环时间较长，这导致抗体类显像剂需要较长的时间才能获得比较好的显像效果(一般需要24h以上)，并且，需要选择较长半衰期的核素对其进行标记，这增加了患者的辐射风险(参见文献：PD-L1 Detection in Tumors Using[(64)Cu]Atezolizumab withPET.Bioconjug Chem.2016；27(9):2103-2110.)。因此，亟需找到生物半衰期更短的PD-L1靶向免疫PET显像剂来快速、准确地监测PD-L1在肿瘤免疫治疗过程中的动态变化，以评估PD-1/PD-L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种分子探针，所述分子探针具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针靶向细胞程序性死亡-配体1。
本发明还提供了一种制备上述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物LP1和四乙二醇二对甲苯磺酸酯混合后进行烷基化反应，得到分子探针的标记前体LP2；对分子探针的标记前体LP2进行放射性核素标记，得到分子探针；
所述化合物LP1具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将化合物LP1、四乙二醇二对甲苯磺酸酯在溶剂中进行混合溶解，得到混合物；在混合物中加入碳酸钾后，在氮气的保护下进行加热回流反应，得到分子探针的标记前体LP2；对分子探针的标记前体LP2进行放射性核素标记，得到分子探针。
在本发明的一种实施方式中，所述化合物LP1、四乙二醇二对甲苯磺酸酯和碳酸钾的投料摩尔比为0.4～0.5：1～1.5：4～5。
在本发明的一种实施方式中，所述加热回流反应的温度为80～90℃、时间为20～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述化合物LP1的制备方法为：将化合物LP0和派嗪混合后进行还原胺化反应，得到化合物LP1；
所述化合物LP0具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物LP1的制备方法为：将化合物LP0和哌嗪在溶剂中进行混合溶解，得到混合物；在混合物中加入醋酸后进行亲核加成反应，得到亚胺离子；在亚胺离子中加入氰基硼氢化钠后进行还原反应，得到化合物LP1。
在本发明的一种实施方式中，所述化合物LP0、派嗪、醋酸和氰基硼氢化钠的投料摩尔比为0.5～1.5：1.5～2.5：3～5：3～5。
在本发明的一种实施方式中，所述亲核加成反应的温度为40～50℃、时间为4～8h。
在本发明的一种实施方式中，所述还原反应的温度为20～30℃、时间为20～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、四氢呋喃(THF)或二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
本发明还提供了上述分子探针在细胞程序性死亡-配体1显像中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
本发明还提供了一种靶向细胞程序性死亡-配体1的显像剂，所述显像剂含有上述分子探针。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种分子探针[18F]LP-F，此分子探针[18F]LP-F具有以下优势：
第一，对PD-L1具有亲和力，在PD-L1高表达的肿瘤中的摄取要高于PD-L1低表达的肿瘤，能区分PD-L1表达差异的肿瘤，并实现对瘤内的PD-L1表达水平的定量分析；
第二，能够较快到达PD-L1阳性肿瘤，在30～50min时即可获得较好的显像效果；
第三，属于小分子，小分子的体内代谢迅速，生物半衰期更短，在体内清除的时间明显短于抗体类分子探针，安全性较高；
第四，稳定性较好，在PBS和小鼠血清中孵育4h内一直保持单峰；
第五，合成步骤简易，标记方法简单，成本较低；
第六，所使用的一步18F-OTs标记法较氟离子交换法等标记方法具有更高的放射纯和稳定性，且不易脱氟。
综上，此分子探针[18F]LP-F可以通过PET成像从分子水平上实时、动态及全身地监测原发灶及转移病灶中PD-L1表达水平及变化，进而评估PD-1/PD-L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效。
附图说明
图1：化合物LP1的高效液相色谱图。
图2：化合物LP1的ESI-MS质谱图。
图3：化合物LP1的核磁共振氢谱图。
图4：化合物LP2的高效液相色谱图。
图5：化合物LP2的ESI-MS质谱图。
图6：化合物TsO-PEG4-F的高效液相色谱图。
图7：化合物TsO-PEG4-F的ESI-MS质谱图。
图8：化合物TsO-PEG4-F的核磁共振氢谱图。
图9：非放射性探针LP-F的高效液相色谱图。
图10：非放射性探针LP-F的ESI-MS质谱图。
图11：非放射性探针LP-F的核磁共振氢谱图。
图12：非放射性探针LP-F的核磁共振碳谱图。
图13：非放射性探针LP-F的核磁共振氟谱图。
图14：非放射性探针LP-F的紫外吸收谱图。
图15：非放射性探针LP-F的HPLC定量的标准曲线(即放射性探针[18F]LP-F的校正曲线)。
图16：非放射性探针LP-F和放射性探针[18F]LP-F的高效液相色谱图。
图17：放射性探针[18F]LP-F在PBS(pH＝7.4)孵育0、1、2、4小时后的稳定性HPLC分析。
图18：放射性探针[18F]LP-F在小鼠血清中孵育0、1、2、4小时后的稳定性HPLC分析。
图19：放射性探针[18F]LP-F的细胞摄取研究结果。
图20：放射性探针[18F]LP-F与A375-hPD-L1细胞的PD-L1特异性结合分析。
图21：放射性探针[18F]LP-F在A375/A375-hPD-L1双侧异种移植荷瘤小鼠的PET成像结果。图21中，(A)为代表性横断面和冠状面PET成像结果；(B)放射性探针[18F]LP-F在荷瘤小鼠的肿瘤与肌肉中摄取值的半定量分析结果；(C)放射性探针[18F]LP-F在荷瘤小鼠体内PET成像的肿瘤/肌肉摄取值比(T/M)；(D)放射性探针[18F]LP-F在荷瘤小鼠体内的A375-hPD-L1肿瘤中的摄取值与A375肿瘤的摄取值的比值。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F
本实施例提供了一种PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F，所述PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F具有如下所示结构：
实施例2：一种制备PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的方法
本实施例提供了实施例1所述PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：参照公开号为CN112028916A的专利申请文本制备化合物LP0(化合物LP0即为公开号为CN112028916A的专利申请文本中的化合物L3)；称取化合物LP0(3500mg，0.95mmol)和哌嗪(331mg，3.85mmol)于圆底烧瓶中，加入DMF(10mL)溶解，得到混合物；在混合物中滴入醋酸(239mg，3.98mmol)，在45℃下进行亲核加成反应5h，得到中间产物亚胺离子；将圆底烧瓶置于冰浴中冷却，在中间产物亚胺离子中加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN，241.1mg，3.83mmol)，之后在室温(25℃)下进行亚铵离子还原反应24h，得到还原产物；将还原产物倒入80mL水中，用二氯甲烷(40mL×3)萃取；收集有机相，用无水硫酸钠干燥；过滤后旋蒸；收集旋蒸产物，以二氯甲烷/甲醇(15：1，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到化合物LP1(128.0mg，产率为22.7％)；化合物LP1为白色固体，采用Waters1525对化合物LP1进行高效液相HPLC分析，HPLC分析结果如图1所示，采用电喷雾电离源对化合物LP1进行ESI-MS质谱分析，质谱分析结果如图2所示，核磁共振分析结果如图3所示。
化合物LP1的氢谱数据结果如下：
氢谱解析：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(bro,1H),7.98(s,1H),7.85(d,J＝8.0Hz,2H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.46(s,1H),7.45(d,J＝7.8Hz,1H),7.25(t,J＝7.5Hz,1H),7.19(dd,J＝7.8,1.0Hz,1H),7.17(s,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.77(d,J＝2.0Hz,1H),6.75(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),5.31(s,2H),5.26(s,2H),4.28(s,4H),3.50(s,2H),3.18(s,4H),2.50(s,4H),2.24(s,3H).
步骤二：称取化合物LP1(247mg，0.415mmol)、四乙二醇二对甲苯磺酸酯(675mg，1.34mmol)于圆底烧瓶中，加入乙腈(12.5mL)溶解，得到混合物；在混合物中加入碳酸钾(581mg，4.21mmol)，在氮气的保护下，于85℃加热回流反应24h，得到反应产物；将圆底烧瓶冷却至室温(25℃)，旋蒸除去乙腈；收集旋蒸产物，以三氯甲烷/甲醇(20：1，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到化合物LP2(130mg，产率为33.9％)；化合物LP2为无色油状，采用Waters1525对化合物LP2进行高效液相HPLC分析，HPLC分析结果如图4所示，采用电喷雾电离源对化合物LP2进行ESI-MS质谱分析，质谱分析结果如图5所示。
步骤三：将3.0mg化合物LP2溶于600μLDMSO，得到标记前体溶液；先用15mL 0.5M的NaHCO3溶液冲洗QMA柱，再用15mL去离子水冲洗柱子，得到活化Sep-Pak light QMA柱；先用10mL无水乙醇滴注C18柱，再用10mL去离子水滴注C18柱，得到活化Sep-Pak light C18柱；将含氨基聚醚(K2.2.2，13.0mg/mL)的乙腈溶液和含K2CO3(30mg/mL)的水溶液按照体积比10：1混合，得到K2.2.2/K2CO3乙腈水溶液；先用去离子水自动清洗反应管，干燥，再用无水乙腈自动清洗反应管，干燥，得到标记所需要用的反应管；以18O-H2O为靶材料，通过18O(p，n)18F反应生产18F-F-，经阴离子交换柱(QMA)固定吸附，用K2.2.2/K2CO3乙腈水溶液(1.5mL)将18F-F-从QMA柱上洗脱下来，并置于标记所需要用的反应管中，先于反应管中通入N2气流，升温至110℃蒸干溶剂后，冷却至室温(25℃)，然后于反应管中加入超干乙腈(2mL)，通入N2气流，升温至110℃共沸除水，冷却至室温(25℃)，再于反应管中加入标记前体溶液，升温至110℃，N2气流搅拌反应30min后，冷却至室温(25℃)，最后取反应管中的反应液经半制备高效液相纯化收集含有放射性分子探针[18F]LP-F的馏分；将馏分先用去离子水稀释至25mL，然后用Sep-Pak light C18固相萃取柱富集放射性分子探针[18F]LP-F，再用50mL去离子水洗涤，最后用1mL无水乙醇将放射性分子探针[18F]LP-F从C18柱上洗脱下来，得到PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(放射性产率为8.0％)；使用Radio-HPLC对放射性分子探针[18F]LP-F进行放射性HPLC检测，检测结果见图16，通过放射性产物峰面积/总峰面积计算放射性分子探针[18F]LP-F的放射化学纯度(RCP)，计算结果为：放射性分子探针[18F]LP-F的放射化学纯度高于99.0％。
对比例1：一种PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F
本实施例提供了一种PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F，所述PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F具有如下所示结构：
对比例2：一种制备PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F的方法
本实施例提供了实施例1所述PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：将四乙二醇二对甲苯磺酸酯(205mg，0.408mmol)于圆底烧瓶中溶于THF(四氢呋喃，5mL)，得到溶解液；在溶解液中加入四丁基氟化铵(TBAF，216mg，0.828mmol)，加热至80℃反应20min，得到反应产物；将圆底烧瓶置于冰浴中冷却至室温(25℃)，旋蒸除去THF；收集旋蒸产物，以正己烷/乙酸乙酯(1：1，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到化合物TsO-PEG4-F(71.4mg，产率为50.0％)；化合物TsO-PEG4-F为无色油状液体，采用Waters1525对化合物TsO-PEG4-F进行高效液相HPLC分析，HPLC分析结果如图6所示，采用电喷雾电离源对化合物TsO-PEG4-F进行ESI-MS质谱分析，质谱分析结果如图7所示，核磁共振分析结果如图8所示；
所述化合物TsO-PEG4-F具有如下所示结构：
化合物TsO-PEG4-F的氢谱数据结果如下：
氢谱解析：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),4.55(dt,2JH-F＝47.7Hz,3JH-H＝4.2Hz,2H),4.15(t,J＝4.8Hz,2H),3.77(t,J＝4.2Hz,1H),3.70–3.62(m,7H),3.59(s,4H),2,44(s,3H).
步骤二：称取化合物LP1(15mg，0.0252mmol)和化合物TsO-PEG4-F(13.3mg，0.038mmol)于圆底烧瓶中，加入乙腈(5mL)溶解，得到混合物；在混合物中加入碳酸钾(34.5mg，0.252mmol)，在氮气的保护下，于85℃加热回流反应24h，得到反应产物；将圆底烧瓶置于冰浴中冷却至室温(25℃)，旋蒸除去乙腈；收集旋蒸产物，以三氯甲烷/甲醇(15：1，v/v)为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F(13.3mg，产率为68.2％)；PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F为无色油状液体，采用Waters1525对非放射性分子探针LP-F进行高效液相HPLC分析，HPLC分析结果如图9所示，采用电喷雾电离源对非放射性分子探针LP-F进行ESI-MS质谱分析，质谱分析结果如图10所示，核磁共振分析结果如图11、图12和图13所示，紫外吸收图谱分析结果如图14所示；
所述非放射性分子探针LP-F具有如下所示结构：
非放射性分子探针LP-F的氢谱、碳谱和氟谱数据结果如下：
氢谱解析：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.84(d,J＝7.8Hz,1H),7.82(d,J＝7.8Hz,1H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.45(d,J＝6.7Hz,1H),7.29(s,1H),7.25(t,J＝7.6Hz,1H),7.18(dd,J＝7.7,1.1Hz,1H),7.08(s,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.78(d,J＝2.1Hz,1H),6.75(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),5.28(s,2H),5.22(s,2H),4.50(dt,2JH-F＝48.0Hz,3JH-H＝4.1Hz,2H),4.28(s,4H),3.63(dt,3JH-F＝31.2Hz,3JH-H＝4.1Hz,2H),3.53–3.47(m,10H),3.42(s,2H),2.46–2.30(m,10H),2.24(s,3H).
碳谱解析：13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ155.77,153.22,142.95,142.50,141.63,138.79,135.05,134.37,134.03,132.13,131.63,130.81,130.71,129.72,129.61,127.59,125.45,122.10,120.12,118.67,117.70,116.78,112.83,111.47,100.73,83.00(d,1JC-F＝169.3Hz),69.82,69.75,69.65(d,2JC-F＝18.9Hz),69.63,68.78,68.24,64.10,64.08,57.17,55.12,53.18,52.66,15.86.
氟谱解析：19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-222.7(tt,2JF-H＝47.5Hz,3JF-H＝29.9Hz).
实验例1：PD-L1靶向的分子探针的摩尔比活度实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的摩尔比活度的测定实验，具体过程如下：
将2.5mg对比例2制得的非放射性探针LP-F溶解于1mL的无水乙醇中，用无水乙醇依次加倍稀为原浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024，取25μL的上述LP-F的醇溶液，在286nm的波长下进行UV-HPLC分析，根据化合物LP-F的峰面积与相应的浓度建立标准曲线，如图15所示。取25μL纯化后的放射性探针[18F]LP-F的醇溶液(94μCi)进行UV-HPLC分析，根据分子探针[18F]LP-F在286nm波长下的峰面积与其校正曲线(即非放射性探针LP-F的标准曲线)计算出[18F]LP-F的浓度与物质的量，再利用[18F]LP-F的放射性活度计算得到分子探针[18F]LP-F的摩尔比活度；其中，摩尔比活度的计算公式如下：
摩尔比活度＝分子探针的放射性活度/分子探针的物质的量。
PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的摩尔比活度为18.8GBq/μmol。
实验例2：PD-L1靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的体外稳定性实验，具体过程如下：
实验一：将实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(～14.8MBq，40μL)与PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M，360μL)混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育1、2和4h；孵育结束后，取25μL孵育液使用Radio-HPLC进行放射性HPLC分析，分析结果见17。
实验二：将实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(～14.8MBq，40μL)与小鼠血清(取自购自南京森贝伽生物科技有限公司，360μL)混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2和4h；孵育结束后，取30μL孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心5min使血清与蛋白分离，吸取25μL上清液使用Radio-HPLC进行放射性HPLC分析，分析结果见图18。
由图17～18可知，PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F在37℃于小鼠血清和PBS中孵育4h内一直保持单峰，结果表明[18F]LP-F在PBS和小鼠血清中均有良好的稳定性。
实验例3：PD-L1靶向的分子探针的脂水分配系数实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的脂水分配系数实验，具体过程如下：
取1μL实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的乙醇溶液(～0.37MBq)置于5mL离心管中，加入1mL正辛醇和1mL去离子水，得到混合液；将混合液室温(25℃)下振荡5min后，于4000g下高速离心5min破乳使得两相分离；静止分层，取正辛醇相、水相各500μL，使用γ计数器检测正辛醇相、水相各自的放射性活度并通过公式Log P＝Log(Co/Cw)计算出[18F]LP-F的脂水分配系数，其中，Co表示探针在有机相中的浓度或放射性剂量，Cw表示探针在水相的浓度或放射性剂量。第一次测试结束后，在剩余500μL正辛醇和500μL水的5mL离心管中补加500μL正辛醇和500μL水，再次振荡、离心取样测Log P，继续重复两次，检测结果见表1。
由表1可知，PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的脂水分配系数为2.18±0.16，这说明放射性分子探针[18F]LP-F具有脂溶性，经体循环进入肿瘤后，不易被机体清除。
表1放射性分子探针[18F]LP-F的脂水分配系数
实验例4：PD-L1靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的细胞摄取实验，具体过程如下：
实验分为三组，其中二组为实验组，另外一组为阻断组(blocked)，其中，二组实验组为：将1×106个A375-hPD-L1细胞(PD-L1高表达细胞系，由苏州智核生物医药有限公司提供)和A375细胞(PD-L1低表达细胞系，由苏州智核生物医药有限公司提供)分别于放免管中和实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(1μCi/管)混合后，在37℃水浴锅中分别孵育30min、60min、120min和240min；阻断组为：在实验组的基础上，在加入实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F之前，先将100μL 50μM对比例2制得的PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F与A375-hPD-L1细胞在37℃水浴锅中孵育30min；孵育后，每管加入500μL冷(4℃)的PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M)，4000r/min离心5min；离心后，重复上述操作一次，并用伽马计数器进行计数检测样品的CPM值，细胞摄取％AD结果以细胞内的CPM与总剂量的CPM比值表示，检测结果见图19。
如图19所示，A375-hPD-L1对PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的摄取在每个时间点均高于A375细胞和阻断组的A375-hPD-L1细胞；虽然随着孵育时间的不断延长，A375细胞和阻断组细胞对[18F]LP-F摄取不断增加，最高摄取值为1.41％AD和1.72％AD，但是A375-hPD-L1细胞对[18F]LP-F的摄取比一直在3.64％AD以上，与A375细胞和阻断组中的细胞对探针[18F]LP-F的摄取相比，均具有显著性差异(P<0.05)。以上结果表明，PD-L1高表达的细胞系对PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F的摄取要比PD-L1低表达的细胞系高，且可以被PD-L1靶向的非放射性分子探针LP-F阻断减少细胞摄取，即PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F于体外可以在细胞水平被PD-L1高表达的细胞特异性地高摄取。
实验例5：PD-L1靶向的分子探针的饱和结合实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的饱和结合实验，具体过程如下：
本实验分为两组：总结合(total binding，TB)组和非特异性结合(non-specificbinding，NSB)组。总结合组中，将A375-hPD-L1细胞以每管2×105个细胞数置于放免管中，每管加入100μL梯度浓度的实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(0～128nM)，37℃孵育1小时后，先用冷(4℃)PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M)洗两次，再用伽马计数器检测每个放免管的CPM，数值为总结合剂量。非特异性结合组中，A375-hPD-L1细胞提前与100μL对比例2制得的非放射性探针LP-F(50μM)孵育半小时阻断，之后再与100μL梯度浓度的实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(0～128nM)共孵育1小时，接着用冷(4℃)PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M)洗两次，最后用伽马计数器检测每个放免管的CPM，数值为总结合剂量。测得总结合剂量后，计算特异性结合百分比(specific binding，SB)，特异性结合百分比由总结合剂量与非特异性结合剂量之差除以对照组计算所得；根据计算结果拟合特异性结合曲线(特异性结合曲线见图20)并计算解离常数Kd值。
分子探针[18F]LP-F的解离常数Kd值为226.0nM。
实验例6：PD-L1靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将A375细胞和A375-hPD-L1细胞分别按照1×106个的剂量以皮下注射的方式植入同一只雌性BALB/C小鼠(5周龄，购自常州卡文斯实验动物公司)的右前肢腋下和左前肢腋下，得到A375/A375-hPD-L1双侧荷瘤裸鼠模型；每隔一天监测肿瘤直径，当肿瘤体积达到200.0±25.0mm3(肿瘤体积计算公式：1/2×长径×短径2)时，用含有1.5％(v/v)异氟烷的氧气以2L/min的流速麻醉荷瘤小鼠；将荷瘤小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在200μL生理盐水中的实施例2制得的PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F(200μCi)分别通过尾静脉注射；探针注射完毕后，立即执行60min的动态PET扫描，PET显像结果见图21；扫描完成后，使用OSEM3D/MAP算法将60min的PET成像结果分割成12帧图像，每5min一帧，以实现对小鼠体内成像的实时分析，并利用软件(ASIPro，Siemens)计算摄取值(％ID/mL)。
由图21A可知，与A375肿瘤的显像效果相比，放射性分子探针[18F]LP-F可以清晰地显现出A375-hPD-L1肿瘤的轮廓。如图21B所示，放射性分子探针[18F]LP-F在A375-hPD-L1肿瘤中的摄取在不断增加，在50min达到最大值3.53±0.46％ID/mL；虽然分子探针在A375肿瘤中的摄取在不断增加，但最高摄取值在60min，仅为1.23±0.39％ID/mL。如图21C所示，A375-hPD-L1肿瘤的靶本比在30min为2.08±0.38，在50min增加至2.20±0.29；然而，A375肿瘤的靶本比一直在低于1，在0.75～0.82之间。如图21D，将分子探针在不同的肿瘤中的摄取值相比较，A375-hPD-L1肿瘤的摄取值一直高于A375肿瘤，且在50min前者为后者的2.95±0.39倍。
上述结果表明，PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F可以显像出PD-L1阳性瘤的轮廓，并且，其在肿瘤中的摄取与肿瘤内PD-L1的表达水平相关。可见，PD-L1靶向的放射性分子探针[18F]LP-F可以通过PET成像区分PD-L1表达有差异的肿瘤。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针具有如下所示结构：
2.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：
3.如权利要求1或2所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针靶向细胞程序性死亡-配体1。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物LP1和四乙二醇二对甲苯磺酸酯混合后进行烷基化反应，得到分子探针的标记前体LP2；对分子探针的标记前体LP2进行放射性核素标记，得到分子探针；
所述化合物LP1具有如下所示结构：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物LP1、四乙二醇二对甲苯磺酸酯在溶剂中进行混合溶解，得到混合物；在混合物中加入碳酸钾后，在氮气的保护下进行加热回流反应，得到分子探针的标记前体LP2；对分子探针的标记前体LP2进行放射性核素标记，得到分子探针。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化合物LP1、四乙二醇二对甲苯磺酸酯和碳酸钾的投料摩尔比为0.4～0.5：1～1.5：4～5。
7.如权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物LP1的制备方法为：将化合物LP0和哌嗪混合后进行还原胺化反应，得到化合物LP1；
所述化合物LP0具有如下所示结构：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化合物LP1的制备方法为：将化合物LP0和哌嗪在溶剂中进行混合溶解，得到混合物；在混合物中加入醋酸后进行亲核加成反应，得到亚胺离子；在亚胺离子中加入氰基硼氢化钠后进行还原反应，得到化合物LP1。
9.权利要求1或2所述分子探针在细胞程序性死亡-配体1显像中的应用，其特征在于，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
10.一种靶向细胞程序性死亡-配体1的显像剂，其特征在于，所述显像剂含有权利要求1或2所述分子探针。
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