CN102406949A - 一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物 - Google Patents

Abstract

本发明属医学诊断药物领域，涉及一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物。本发明选择G5做为探针载体优化目标影像药物的血循环时间和被动靶向性，通过将近红外荧光基团和Gd-DOTA顺磁性基团标记在G5树枝状高分子上，通过双功能的聚乙二醇PEG连接angiopep-2多肽和G5树枝状高分子，制成具有跨越血脑屏障能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影像药物。本发明中PEG链不但改善了纳米探针的水溶性，适当提高了其血液循环时间，同时减少了树枝状大分子由于立体位阻效应对angiopep-2肽链的血脑屏障跨越效率的影响。本发明药物可用于原位脑胶质瘤的无创动态示踪，尤其对血脑屏障未受破坏条件下的神经胶质瘤具有良好的靶向示踪功能。

Description

一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物

技术领域

本发明属医学诊断药物领域，涉及纳米影像药物，具体涉及一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物。本发明包括荧光/磁性多模式纳米药物的合成及表征，体外细胞毒性检测，癌细胞内吞效率，活体内受体介导的跨越血脑屏障功能评价，纳米影像药物对原位脑肿瘤的被动及主动受体介导靶向效率，以及在脑肿瘤多模式示踪过程中的应用。

背景技术

脑神经胶质瘤是脑肿瘤中最常见(总发生率的69％)和最致命(平均5年存活率为5％)的一类肿瘤，其具有高恶性和高复发性特点。手术切除是目前治疗脑胶质瘤的最主要手段。但由于脑胶质瘤的弥漫性和浸润性等特点，手术前对肿瘤的无创精确定位及手术过程中对肿瘤的准确切除变得十分困难。

磁共振显像(MRI)是目前手术前脑胶质瘤定位的主要手段。但临床上使用MRI准确描绘肿瘤的边界受到现有钆造影剂循环时间短、无靶向特异性和血脑屏障穿透能力差等因素的限制。研究显示，多数早期胶质瘤和20-30％的晚期胶质瘤血脑屏障并未明显破坏，现有造影剂对此类肿瘤难以有效地实现准确示踪。

有研究发现多肽angiopep-2做为低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的配体表现出比转铁蛋白(transferrin)和抑肽酶(ApoE)等脑靶向配体更强的跨血脑屏障效率[Demeule，M et al，J.Pharmacol.Exp.Ther.2008，324，1064；Demeule，M et al，J.Neurochem.2008，106，1534；Ke，Wet al，Biomaterials 2009，30，6976]。更重要的是，LRP不仅在脑毛细血管内皮细胞上表达，它在胶质瘤中也高度表达[Maletinska，L et al，Cancer Res.2000，60，2300]。现有技术表明多肽angiopep-2作为靶向基团能够有效地提高基因药物对完好BBB的穿越效率[Jiang，C.et al，Biomaterials，2008，29，238；Jiang，C.et al.，Biomaterials，2009，30，6976]并取得良好的治疗效果。因此标记有angiopep-2的影像药物有望通过受体介导作用穿越血脑屏障并对实现对脑胶质瘤的靶向性示踪。

树枝状大分子(dendrimers)具有高度支化、结构规整、单分散、多位点修饰，有单一的分子量等特点。聚乙二胺树枝状大分子(PAMAM dendrimer)做为一种新的药物载体可以标记多个影像基团或靶向基团(标记位点的多少取决于PAMAM的代数)以达到更高的靶向性和成像灵敏度。已有文献报道：标记有钆配合物的低代数树枝状高分子，包括G2(二代，直径：3nm)、G3(三代，5nm)和G4(四代，6nm)其在体内循环时间较短并通过肾脏快速排泄出体外，但由于减少了血管外渗，与小分子造影剂如Gd-DTPA(二乙烯三胺五乙酸螯合的钆剂)，Gd-DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸螯合的钆剂)相比，它们能更好地显示血管结构；中等代数的树枝状高分子造影剂，包括Gd-DTPA标记的G5(五代，7nm)和G6(六代，9nm)树枝状高分子，其体内循环时间延长到30分钟以上并通过肾脏和肝胆管共同排泄出体外；而对于G7(七代，11nm)和G8(八代，13nm)等高代数树枝状高分子而言，其几乎完全是通过肝胆系统排泄；更高代数的树枝状高分子则被肝脾等的网状内皮系统所捕获而很难用于影像示踪用途。

近年来，近红外荧光(Near-Infrared Fluorescence)探针在生物医学领域的应用悄然兴起。活体组织对波长范围在700～1000nm的近红外光吸收较弱，因此近红外荧光能够穿透较深的组织，从而得到灵敏度更高，且信噪比更好的图像。与光学成像技术相比，磁共振成像(MRI)具有高空间/时间分辨率，无探测深度和角度限制，易临床转化等优点，但灵敏度较低。

综上所述，研制一类在手术前可对脑肿瘤的位置、形态及边缘无创示踪的，并且在手术过程中可实现影像指导下脑肿瘤准确切除的影像药物对胶质瘤的早期诊断和治疗将具有重要的意义；构建能够在完整血脑屏障条件下对脑肿瘤实现准确示踪的影像药物对胶质瘤的早期诊断和手术准确切除显得尤为重要。

目前尚未见有关以angiopep-2为BBB跨越基团同时标记有光学和顺磁性双功能影像基团的纳米探针的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，尤其涉及具有跨越血脑屏障(B B B)能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影像药物，其用于原位脑胶质瘤的无创动态示踪，尤其对血脑屏障未受破坏条件下的神经胶质瘤具有靶向示踪功能。

本发明所述的血脑屏障未受破坏条件下的神经胶质瘤包括血脑屏障未破坏的毛细胞型星形细胞瘤(I级)；低度弥漫型星形细胞瘤(II级)；间变型星形细胞瘤(III级)和多型性胶质母细胞瘤(IV级)。

具体而言，本发明的一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，选择G5做为探针载体优化目标影像药物的血循环时间和被动靶向性(enhanced permeabilityand retention effect)，通过下述方法制备：

将近红外荧光基团Cy5.5(羰花青类近红外荧光染料5.5)和Gd-DOTA顺磁性基团标记在G5树枝状高分子上，通过双功能的聚乙二醇PEG连接angiopep-2多肽和G5树枝状高分子，制成具有跨越血脑屏障(BBB)能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影像药物。

本发明的纳米影像药物能达到较好的肿瘤示踪信噪比和灵敏度。

本发明中，具有跨BBB功能的目标纳米探针Den-angio和不具备跨BBB功能的参比探针合成路线如下：

标记angiopep-2靶头的纳米探针合成路线

未标记angiopep-2靶头的参比纳米探针合成路线

本发明所述的目标影像药物的结构为Den-(NIRP)_x-(MRI CA)_y-(PEG-angiopep-2)_z，

其中，Den：代表作为影像药物载体的树枝状高分子，本发明的一个实施例中，Den为2-8代的聚酰胺胺树枝状高分子；

NIRP为近红外荧光基团，x代表标记在载体上荧光基团数目，NIRP以酰胺键形式标记到树枝状高分子上；所述近红外荧光基团包括IR783、Cy5.5等在内的羰花青类近红外荧光染料；

MRI CA为T1加权磁共振造影基团，y代表标记在载体上磁共振基团数目；所述CA以酰胺键形式标记到树枝状高分子上；所述MRI CA为包括Gd-DOTA在内的钆金属配合物。

PEG为聚乙二醇，angiopep-2为可跨越血脑屏障并靶向脑肿瘤的肽链；树枝状高分子和angiopep-2多肽通过双功能化的PEG桥连在一起；z代表标记在载体上的PEG-angiopep-2数目。

本发明中，双功能化PEG的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺；所述PEG上伯胺基与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的PEG；PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到Den-PEG中间产物；

本发明中，angiopep-2肽链其氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，在其C端引入半胱氨酸得到序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC的新肽链；新肽链半胱氨酸上的巯基与标记在树枝状高分子上的2-吡啶二巯基缩合得到通过PEG桥连的Den-PEG-angiopep-2化合物。

本发明中，标记在影像纳米药物上的angiopep-2可特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体，是实现跨血脑屏障的和肿瘤靶向性的关键。

本发明中，多模式指磁共振成像和近红外荧光光学成像，诊断药物可被磁共振成像和光学成像同时无创监测。

本发明中，纳米药物上标记的angiopep-2肽链可与脑血管内皮细胞上表达的低密度脂蛋白相关受体结合，并通过受体介导的内吞作用实现跨BBB功能；纳米药物由angiopep-2肽链引导跨越BBB后，可与脑肿瘤细胞上高表达的低密度脂蛋白相关受体结合实现探针的肿瘤主动靶向作用。

本发明中，近红外荧光基团Cy5.5(羰花青类近红外荧光染料5.5)和Gd-DOTA顺磁性基团被标记在G5树枝状高分子上，具有跨BBB功能的angiopep-2多肽和树枝状高分子则通过双功能的聚乙二醇PEG连接在一起。PEG链不但改善了纳米探针的水溶性，适当提高了其血液循环时间，同时也尽可能减少了树枝状大分子由于立体位阻效应对angiopep-2肽链的血脑屏障跨越效率的影响。由于探针上标记了红色荧光基团rhodamine(罗丹明)，当用荧光显微镜观察离体细胞或组织切片时，很容易追踪此纳米探针。

本发明还具有如下优点：

本发明中采用的光学成像的优点恰好克服MRI在示踪灵敏度方面的限制，而MR高分辩率的优点又弥补了光学成像的不足。因此本发明的多功能分子影像探针技术，尤其是将MR和光学成像相结合的分子影像探针技术，既能克服单一成像技术灵敏度或分辨率的限制，同时还能通过影像对比得到更丰富的生理和病理信息。与氧化铁产生的MR负向信号相比，钆配合物产生的MR正向信号较少受到病变组织干扰，且解剖结构清晰、分辨率高。本发明以Gd-DOTA配合物作为磁共振成像基团，由于所述的Gd-DOTA配合物具有良好的热力学稳定性，不易与生理内源性的Zn²⁺，Ca²⁺等离子发生交换并游离出毒性的Gd³⁺离子。

附图说明

图1是C-angiopep-2的ESI-MS图谱，

其中，多肽TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC分子量：2404.6Da。

图2是C-angiopep-2的分析型HPLC图谱，

其中，色谱方法：色谱柱：YMC HPLC COLUMN 150×4.6mml.D；流动相A：0.1％TFA乙腈溶液；流动相B：0.1％TFA水溶液；流速：0.7mL/min；时间：45分钟，在214和280nm处探测；洗脱程序：在0到26分钟，洗脱程序从90％到65％的B线性变化后，27-32分钟，维持10％的B冲洗柱子，最后，用90％的B冲洗柱子至平衡。

图3是C-angiopep-2的¹H NMR核磁图。

图4是化合物2的¹H NMR核磁图。

图5是化合物3的¹H NMR核磁图。

图6是化合物4的¹H NMR核磁图，

其中，苯丙氨酸芳香族质子峰在7.4-6.6ppm。

图7是G5的¹H NMR核磁图，其中，G5的光谱在3.3-2.2ppm。

图8是化合物7的¹H NMR核磁图，其中，PEG的O-CH₂基团光谱在3.7ppm。

图9是化合物8的¹H NMR核磁图。

图10是纳米探针的流体动力学粒径分布和Zeta电位图，

其中，用动态光散射的方法来测定纳米探针的流体动力学粒径分布(A)和Zeta电位(B)，Den-Angio和Den-PEG的平均粒径分别是14.2nm和9.3nm，平均Zeta电位是+11.6mV和+16.7mV。

图11表明纳米探针对人类脑胶质瘤U87MG肿瘤细胞的细胞毒性，

其中，Den-Angio和Den-PEG对人类脑胶质瘤U87MG肿瘤细胞的细胞毒性均比未修饰的G5明显低，数据用平均值±方差表示(每个浓度的实验n＝8)。

图12是细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像，

其中，Den-Angio通过LRP-受体介导的细胞内吞而高效进入人脑胶质瘤U87MG肿瘤细胞，(A)对用2μM Den-Angio在4℃培养了15分钟的活细胞以及先用2μM RAP处理半小时再用Den-Angio处理15分钟(均在4℃)的活细胞进行共聚焦荧光显微镜成像，标尺：20ìm，用2μM Den-Angio或者Den-PEG在37℃处理了1小时(B)和24小时(C)的活细胞的共聚焦荧光显微镜图像；(D)用纳米探针37℃处理过的活细胞的时间依赖的荧光强度；荧光强度用NIH Image J软件来定量；数据用平均值±方差表示，n＞32，标尺：方差。

图13表明荷瘤裸鼠注射纳米探针后光学和磁共振成像的T/N信号比，

其中，体内的磁共振和光学成像均证实，Den-Angio相对于Den-PEG有更高的T/N信号比；纳米探针经尾静脉注射后，体内的时间依赖的标准化的肿瘤和周围正常脑组织的近红外荧光强度比(A)和T1加权的磁共振信号比(B)(T/N比值)；T/N值用注射前的比值标准化，数据用平均值±方差表示(n＝3)；注射剂量磁共振显像1.2mg/mouse(相当于0.05mmol[Gd³⁺]/mouse)，而光学显像0.4mg/mouse。

图14是正常小鼠中，两种纳米探针在各个时间点T1加权的磁共振图像，以及表明皮层和海马时间依赖的T1加权磁共振信号在各个时间点的变化，

其中，Den-Angio在血脑屏障完整的正常小鼠中表现出比Den-PEG更高的大脑摄取率；(A)正常小鼠大脑在纳米探针注射前和注射后30分钟，2小时和24小时代表性的T1加权磁共振图像(1.2mg/mouse，相当于0.05mmol[Gd³⁺]/mouse)；红色箭头指向脑室，白色箭头指向海马；(B)&(C)时间依赖的T1加权的磁共振信号在正常小鼠尾静脉注射纳米探针前、后在皮层和海马区域的变化(n＝4)。

图15是荷瘤小鼠激光共聚焦荧光显微镜图像，

其中，共聚焦荧光显微镜图像显示，Den-Angio比Den-PEG显示出更好的脑肿瘤成像能力；图片显示的是脑部种植有U87MG肿瘤的荷瘤裸鼠在尾静脉注射(4nmol/mouse)Den-Angio(上排)和Den-PEG(下排)24h后的荧光显微镜图片；罗丹明标记的探针显示出红色荧光，细胞核的DAPI染色显示出蓝色荧光；组织切片的核染色有助于界定肿瘤和正常脑组织的边界。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1半胱氨酸修饰的可穿越BBB多肽angiopep-2的合成

为了将具有BBB穿越能力的angiopep-2修饰到G5树枝状高分子上，同时也不影响其与低密度脂蛋白相关受体结合的特异性，采用Boc保护的固相多肽合成方法合成C端修饰有一个半胱氨酸残基的angiopep-2：TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC(MW＝2402Da)。

1.称取0.156g Boc-L-Cys(pMeBzl)-PAM树脂(取代度0.8mmol/g，约0.125mmol)，用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶胀20分钟，并洗涤数次；

2.连续用TFA(三氟乙酸)脱保护2次，加量至浸没树脂，每次搅拌1分钟，DMF洗涤数次；

3.称取所需氨基酸1.1mmol，用2ml的HBTU(苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)和0.5ml的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)溶解，加入树脂中，恒温振荡器上反应20分钟；

4.用DMF洗涤。挑取芝麻大小的树脂进行NT(茚三酮)检测确定是否反应完全，NT检测液：A液为8ml苯酚加2ml乙醇，B液为吡啶，C液为1g茚三酮加10ml乙醇，NT检测：挑取的树脂中加入A液10ul，B液20ul，C液10ul，120℃电烤约1分钟，若树脂变蓝则反应不完全，需要重新称取此氨基酸进行反应；若树脂仍为黄色，则反应完全，重复2、3、4；

依次反应的氨基酸分别是Boc-Tyr(Br-Z)(有保护基团的酪氨酸)、Boc-Glu(OcHex)(有保护基团的谷氨酸)、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Thr(Bzl)(有保护基团的苏氨酸)、Boc-Lys(Cl-Z)(有保护基团的赖氨酸)、Boc-Phe(有保护基团的苯丙氨酸)、Boc-Asn(Xan)-OH(有保护基团的天冬氨酸)、Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH(有保护基团的精氨酸)、Boc-Lys(Cl-Z)、Boc-Gly(有保护基团的甘氨酸)、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Ser(Bzl)(有保护基团的丝氨酸)、Boc-Gly、Boc-Gl y、Boc-Tyr(Br-Z)、Boc-Phe、Boc-Phe、Boc-Thr(Bzl)，得到的未去保护的线状肽链为：H-Thr(Bzl)-Phe-Phe-Tyr(Br-Z)-Gly-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Lys(Cl-Z)-Arg(Tos)-Asn(Xan)-Asn(Xan)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Glu(OcHex)-Glu(OcHex)-Tyr(Br-Z)-Cys(PMeBzl)-OH；

5.同上，用TFA脱保护两次，用甲醇洗涤树脂数次，再用之浸泡树脂15～20分钟，抽干甲醇(约30分钟)，放入塑料筒中，并加入适量的p-cresol(4-甲基苯酚)、加入磁子，挂到切割仪上，并使塑料筒浸没入液氮中，抽真空，通HF(氢氟酸)，待HF在塑料筒中冷凝约2ml，关闭HF，在冰水浴中磁力搅拌1小时，抽吸HF(约30分钟)，冰乙醚沉淀产物，用砂芯漏斗过滤得沉淀，适量50％乙腈溶解，旋蒸去乙腈，冻干，得到粗产物约280mg。

6.称取100mg粗产物，适量蒸馏水溶解，制备型HPLC(高效液相色谱仪)纯化、冻干，产物的纯度通过分析型HPLC证实；ESI-MS中有一个单一的802.5[M³⁺]峰，计算分子量为2404.6[M+H⁺]，ESI-MS和分析型HPLC结果如图1、2所示；C-angiopep-2的¹HNMR核磁图如图3所示。

制备型HPLC纯化方法：制备柱：Symmetry^R 300A C187μm 19×300mm steal Column；流动相A：5％乙腈，流动相B：35％乙腈；洗脱程序：0-60分钟0％B-100％B；流速：10ml/min；柱温：25℃；检测：UV 214nm和280nm。

分析型HPLC方法：如图2所示。

实施例2化合物1的合成

2.1mg(6.8×10^-6mol，1.3倍)的SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯溶于300μL的DMF中，缓慢逐滴加入磁力搅拌下的1.0mL的10.4mg(5.2×10^-6mol，分子量认为是2KDa)NH₂-PEG^2k-Malemide(氨基-聚乙二醇^2k-马来酰亚胺)的1X PBS(pH 7.4)溶液中。常温下反应45分钟后，形成一端是马来酰亚胺，另一端是3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯的PEG衍生物。

实施例3化合物2的合成

将以上反应液直接加入1.0mL的11.6mg(4×10^-7mol)的树枝状大分子PAMAM G5的1X PBS(pH 7.4～8.0)溶液中。常温下搅拌1小时后，形成化合物2，其中SPDP通过PEG连接到G5树枝状高分子表面。用分子量为10，000Da的滤膜超滤管离心纯化(4000转/分钟，30分钟×3次)得到目标产物。G5和PEG之间的摩尔比通过化合物2的¹H NMR图谱中的质子积分来计算。化合物2中SPDP的标记水平通过DTT(二硫苏糖醇)实验来定量。简化的操作过程为：过量的DTT加入化合物2的PBS溶液中，搅拌15分钟，测量上述溶液在343nm处的吸光度。SPDP和G5之间的摩尔比通过公式R＝ΔA₃₄₃/8080×C_dendrimer来计算，R代表摩尔比，ΔA₃₄₃代表DTT加入前后343nm处吸光度的变化，C_dendrimer代表G5的摩尔浓度，数值8080代表吡啶-2-硫酮在343nm处的消光系数。实验结果表明平均每个G5上标记有8个SPDP。化合物2的¹H NMR核磁图如图4所示。

实施例4化合物3的合成

0.4mg(8×10^-7mol，2.0倍.)的rhodamine-NHS(罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯)和1.2mg(8.0×10^-7mol，2.0倍)的Cy5.5-NHS溶解在50μL无水DMF中，然后缓慢逐滴加入1.0mL化合物2的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液(0.1M，pH 8.3)。常温下搅拌1小时，荧光基团标记的G5用分子量10，000Da的超滤管纯化(4000转/分钟)，并浓缩到约2.0mL 0.5M的HEPES中(pH 8.3)。50.7mg(5.12×10^-5mol，128倍.)DOTA-NHS白色粉末逐渐加入到上述溶液中，pH计监测溶液的pH值，并用5.0M NaOH(氢氧化钠)调节溶液pH值在8.5左右。常温下避光搅拌4小时后，混合物用分子量10，000Da的离心超滤管纯化得到罗丹明、Cy5.5和DOTA修饰的紫色树枝状大分子3溶液。通过对¹H NMR光谱计算得出每个G5分子上标记了约94个DOTA螯合剂。另外，根据朗伯-比尔定律，平均有1.4个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到化合物3上。罗丹明和Cy5.5在水溶液中的吸光系数分别为(ε₅₅₂＝60，000M^-1cm^-1)和(ε₆₇₅＝250，000M^-1cm^-1)。化合物3的¹H NMR核磁图如图5所示。

实施例5化合物4的合成

将化合物3溶解在2mL的PBS溶液中，同时逐滴加入溶解于200μL DMF中的Cysteine-angiopep-2(12mg，5.2×10^-6mol，13倍.)。室温下避光搅拌过夜。Angiopep-2标记的G5化合物经超滤纯化后，化合物4中的多肽angiopep-2标记率通过¹H NMR谱图加以计算。化合物四种，平均有5.6个angiopep-2标记到一个G5分子上。

化合物4的¹H NMR核磁图如图6所示。

实施例6化合物5的合成

12.7mg Gd₂(CO₃)₃(6×10^-5mol，64倍.)加入溶于2mL化合物4溶液中。此悬浊液在60℃下避光搅拌12小时。多余的Gd₂(CO₃)₃离心除去(2000转/分钟，8分钟)，上清液经超滤纯化后，获得Den-Angio化合物，产率大约为82％(根据G5计算)。

实施例7化合物6的合成

0.4mg(8×10^-7mol，2.0倍.)rhodamine-NHS溶于50μL无水DMF中，并缓慢逐滴加入到1mL 11.6mg(4×10^-7mol)G5(0.1M HEPES)中(pH 8.3)。常温下搅拌1小时后，混合液离心超滤纯化得到罗丹明标记的G5树枝状高分子。1.2mg(8.0×10^-7mol，2.0倍)Cy5.5-NHS溶于50μL无水DMF中，同上述反应一样加入到G5的1mL0.1MHEPES溶液中。常温下搅拌1小时后，连接有双荧光基团的树枝状大分子经超滤纯化得到化合物6的紫色溶液。通过吸光光度法计算平均有1.5个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到一个化合物6分子上。化合物6的¹H NMR核磁图如图7所示。

实施例8化合物7的合成

化合物6溶解在2.0mL 1X PBS(pH7.4)中，加入溶于2.0mL PBS中的10.4mg(5.2×10^-6mol，13倍.)PEG^2K-NHS。常温下搅拌1小时后，产物经超滤纯化得到紫色化合物7溶液(产率是82％，约18.9mg，3.28×10^-7mol)。化合物7中G5和PEG间的摩尔比通过它们在¹H NMR光谱中的质子积分定量。

化合物7的¹H NMR核磁图如图8所示。

实施例9化合物8的合成

3.28×10^-7mol化合物7溶于2mL 0.5M HEPES缓冲液中(pH 8.3)。41.6mg(4.2×10^-5mol，128倍)的DOTA-NHS以固体形式加入以上溶液中。pH计监测反应体系pH值，并用5.0M NaOH溶液调节在8.5左右。反应液在常温下搅拌过夜，离心超滤纯化后得到产率为92％的化合物8。标记到G5上的DOTA数量通过¹H NMR谱中的质子积分来定量，约为95个。

化合物8的¹H NMR核磁图如图9所示。

实施例10化合物9的合成

9.5mg(1.93×10^-5mol，64倍.)Gd₂(CO₃)₃加入到溶于4mL 0.1M HEPES(pH 8.3)的3.0×10^-7mol(基于G5的摩尔数)的化合物8中。此悬浊液在60℃下避光搅拌12小时。多余的Gd₂(CO₃)₃经离心沉淀除去，上清液经离心超滤纯化，产率为95％(基于G5的摩尔数)。

实施例11纳米探针粒径分布和Zeta电位的测定

纳米探针和未修饰的G5树枝状大分子在水溶液中的粒径通过动态光散射的方法测定。溶于蒸馏水的2.0mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液对设备进行校准。样品用孔径为0.45μm的滤膜纯化后并用1X PBS稀释到100g/mL。纳米探针的粒径和分布通过动态光散射仪加以测定。在测定纳米探针的表面电荷时，纳米探针溶液用0.45μm的滤头过滤并稀释到10mM的NaCl溶液中。

Den-Angio和Den-PEG的平均直径是14.2nm和9.3nm，平均Zeta电位是+11.6和+16.7mV。

纳米探针的粒径分布和Zeta电位如图10所示。

实施例12用ICP-AES测定纳米探针中的Gd³⁺含量

纳米探针中的Gd³⁺含量用Hitachi P-4010型号ICP-AES(Inductively CoupledPlasma Atomic Emission Spectroscopy，电感耦合等离子体发射光谱仪)进行测定，射频能量为1100W，喷雾器气流速度为0.9L/min。准备好用3％硝酸溶解的Gd³⁺浓度分别为1，5，10，20，50，100，200ppm的标准溶液，标绘相应的色谱峰来绘制标准曲线以对应Gd³⁺含量。0.1mM的纳米探针母液用3％的硝酸稀释100倍。样品的Gd³⁺含量通过对Gd³⁺标准曲线拟合得到。实验结果显示，Gd³⁺-DOTA配合物在探针Den-Angio和Den-PEG中的含量均平均达95个。

实施例13检测纳米探针的驰豫率

纳米探针和商品化的磁共振造影剂Gd³⁺-DOTA的纵向驰豫率根据方程r_1p＝(1/T_sample-1/T_PBS)/[Gd].来计算。其中r_1p为纵向磁豫率，T_sample为溶液的纵向磁豫时间，T_PBS为PBS溶液的磁豫时间。将探针稀释成四种不同浓度的PBS溶液(pH 7.4)，其T1值在4.7T的磁共振上测定。根据ICP-AES测定的Gd³⁺浓度描绘出纳米探针的(1/T_sample-1/T_PBS)值，从而得出纳米探针的驰豫率。Gd³⁺-DOTA，Den-Angio和Den-PEG的纵向驰豫率分别为4.7，6.9 and 7.4mM^-1s^-1。

实施例14体外细胞毒性实验

1.细胞培养人类胶质母细胞瘤U87MG细胞系用最低基础培养基在75-cm²培养瓶中单层培养，即用加有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、1％青、链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Alpha 1X培养基(MEM，Mediatech，Manassas，VA)，置于有充分湿气的含5％CO₂的37℃培养箱中培养。当细胞长满80％的面积时可以消化收集，以使细胞保持在指数增长状态。

2.体外细胞毒性实验MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)细胞增殖实验用来测定用纳米探针和未修饰的G5对照处理后的细胞的活力。处于指数增长期的细胞单层用0.25％胰酶消化收集，得到单细胞悬液。用血细胞计数器和普通光学显微镜(OLYMPUS BH-2)来计数细胞。优化细胞数量以使得在整个MTT实验中，细胞处于指数增长期。因此，用适量细胞培养液重悬细胞，在96孔板的每个孔中加入含有约2×10³个细胞的100μL单细胞悬液。每个浓度准备了8个复孔。细胞贴壁24小时后，用纳米探针或者未修饰的G5来处理这些细胞。样品溶液用

-HV的0.22μm注射器式滤器过滤除菌，并且终浓度的梯度范围在0.05-10μM。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4天后，细胞用PBS冲洗干净，然后用MTT来测定细胞的活力。用纳米探针和G5处理过的细胞的活力用未处理过的细胞的值来进行标准化。图11显示了细胞毒性。

实施例15活细胞摄取纳米探针的共聚焦荧光显微镜成像

为了避免固定过程中出现的假阳性，所有的实验都在活的U87MG细胞中进行。细胞(2×10⁴)培养在35mm的玻璃底培养皿(14mm小孔，MatTek，Ashland，MA)中，大概长满皿底的50％，用2ml溶解有2μM纳米探针的10％FBS培养液在4℃或37℃培养细胞一定的时间。孵育结束后，用HBSS(Hank’s Balance Salt Solution，Hank’s平衡盐溶液)洗涤三次，并加入1ml无酚红培养基。立即用共聚焦荧光显微镜观察细胞。

实施例16体外细胞摄取纳米探针的竞争实验

培养在35mm玻璃底培养皿中的活U87MG细胞先用溶解有2μM低密度脂蛋白受体缔合性蛋白(RAP)的常规培养液在4℃培养30分钟，RAP用作LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白)受体的通用拮抗剂。孵育结束后，洗涤细胞并加入溶解有2μM RAP和2μM Den-Angio的培养液继续在4℃培养15分钟。孵育结束后，细胞用HBSS洗涤三次，并用共聚焦荧光显微镜观察。

细胞摄取纳米探针及竞争实验的共聚焦荧光显微镜成像结果如图12所示。

实施例17小鼠模型和肿瘤原位种植

所有的动物实验都依照复旦大学伦理委员会评估和认可的指南进行。人源U87MG胶质细胞瘤细胞(1.0×10⁶细胞重悬于5μl PBS)在有小鼠衔接器的立体定位仪的协助下被接种到裸鼠的右侧纹状体(前囟点旁开1.8mm，往前0.6mm，深3mm)。接种后14-18天，颅内肿瘤长到直径0.2-0.5mm大小，即进行显像实验。

实施例18体内和离体的光学显像研究

光学显像研究在柯达公司的活体光学成像系统上进行，设置感光滤光片为630nm，而发射谱带通滤色片为700nm。成像前，小鼠用氯胺酮(25mg/kg)和乙酰丙嗪(2.5mg/kg)的混合麻醉剂麻醉，并且脸朝上固定在成像板上。X线显像(曝光时间30秒)，白光摄影(曝光时间0.2秒)和近红外荧光显像(曝光时间15秒)分别在一样的大小的视野(FOV)下摄取(FOV＝12.8cm，f/stop＝4，Bin＝high resolution)，时间点包括注射前和全身注射纳米探针后的几个选定的时间点，每只小鼠注射4.0nmol的纳米探针(基于G5的摩尔数)。X线成像和近红外荧光成像叠加起来来确定位于颅内部分的大小。时间依赖的肿瘤和周围正常脑组织的荧光强度比(T/N比值)用纳米探针注射前的值进行标准化。最后，小鼠被处死并心脏灌流PFA进行预固定。小鼠的大脑被小心地剥离出来，而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则用组织切片器(Braintree Scientific Inc.，Braintree，MA)切成约厚1-2mm。荧光显微镜下肿瘤和周围正常脑组织的荧光强度由ImageJ软件(National Institutes of Health，Bethesda，MD)定量。

实施例19磁共振成像

体内磁共振成像在Bruker Biospec 47/30磁共振仪上进行。实验前，小鼠尾静脉用自制的导管系统置管，该导管系统用一个小的T形接头(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)连接，使得纳米探针溶液在装置中的死容积最小化(小于50μL)。麻醉的小鼠的头被固定在自制的螺线管线圈里，小鼠在磁体中的体温通过一个温度调节装置加热板维持，呼吸则通过Bruke PhysioGard系统进行持续监控。小鼠被安置在磁共振线圈里后，异氟烷(0.5-2％)和100％的氧气一起给予，并且持续的呼吸监测随时进行调整。每只老鼠从尾静脉注射0.05mmol/kg[Gd³⁺]，总共0.25mL体积的纳米探针PBS溶液，收集注射前、后脑部动态T1加权像。观察T1加权的磁共振信号在注射后0-120分钟和24小时的增强情况。冠状为的脑部影像以1mm厚来获取图像，使用了一个自旋回波脉冲序列，视野(FOV)2cm×2cm，矩阵128×128，TR＝300ms，TE＝11ms，NA＝8。3D的T1加权像用一个快速小角度激发成像序列(FLASH)来获得，flip angle＝45°，FOV＝1.5cm×1.5cm×1.5cm，矩阵128×128×32，TR＝35ms，TE＝6.2ms，NA＝8。感兴趣区(ROI)在时间点的增强强度(IE)通过以下公式表示IE＝(RI(t)-RI(0))/RI(0)×100％，其中，RI(t)对应于在各个时间点测定的标准化的信号强度，而RI(0)是纳米探针注射前标准化的信号强度。时间依赖的肿瘤和周围正常脑组织之间的荧光强度比(T/N比值)用纳米探针注射前的值进行标准化。

光学和磁共振成像的T/N信号比变化如图13所示。

两种纳米探针在各个时间点T1加权的磁共振像，以及皮层和海马时间依赖的T1加权磁共振信号在各个时间点的变化如图14所示。

实施例18冰冻大脑切片共聚焦显微镜成像

体内成像后，常规处理小鼠大脑，浸在4％PFA(多聚甲醛)中12小时，再放入30％的蔗糖溶液中脱水至沉底，然后冰冻切片厚15μm，包埋切片并用Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜(Leica Inc.，Wetzlar，Germany)观察，所用的镜头是HCXPL APO CS 40×1.25oil immersion lens和HCPL APO CS 10×0.40immersion lens。罗丹明用543nm激光激发，发射光则用560nm带通滤色片的光电倍增管检测。同时，用405nm激光激发DAPI，发射光则用具有490nm二色分光镜和420-480nm带通滤色片的二级光电倍增管检测。同时，共聚焦Z轴方向进行0.8μm厚的扫描。图15显示了冰冻切片的激光共聚焦荧光显微镜图像。

实施例19组织学成像

用纳米探针处理过的小鼠大脑被离体并浸没在formalin(福尔马林)和PFA的混合液中(体积1∶9混合)固定适当时间。固定好的组织用石蜡包埋并切成3-4μm厚。切片进行H&E染色，并用Leica MZ75高性能立体显微镜2.5X和5.0X的物镜观察。

结果显示，本发明能克服单一成像技术灵敏度或分辨率的限制，同时还能通过影像对比得到更丰富的生理和病理信息。

Claims (12)

1.一种靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，选择G5做为探针载体优化目标影像药物的血循环时间和被动靶向性，通过下述方法制备：将近红外荧光基团和Gd-DOTA顺磁性基团标记在G5树枝状高分子上，通过双功能的聚乙二醇PEG连接angiopep-2多肽和G5树枝状高分子，制成具有跨越血脑屏障能力并标记有光学和磁性双功能影像基团的纳米影像药物。

2.按权利要求1所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的目标影像药物的结构为Den-(NIRP)_x-(MRI CA)_y-(PEG-angiopep-2)_z；

其中，Den：代表作为影像药物载体的树枝状高分子，

NIRP为近红外荧光基团，

x代表标记在载体上荧光基团数目，

MRI CA为T1加权磁共振造影基团，

y代表标记在载体上磁共振基团数目，

PEG为聚乙二醇，

angiopep-2为可跨越血脑屏障并靶向脑肿瘤的肽链，

z代表标记在载体上的PEG-angiopep-2数目。

3.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的Den为2-8代的聚酰胺胺树枝状高分子。

4.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的NIRP以酰胺键形式标记到树枝状高分子上。

5.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的近红外荧光基团选自IR783或Cy5.5羰花青类近红外荧光染料。

6.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的所述MRI CA为包括Gd-DOTA在内的钆金属配合物；所述CA以酰胺键形式标记到树枝状高分子上。

7.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的树枝状高分子和angiopep-2多肽通过双功能化的PEG桥连在一起。

8.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的双功能化PEG的两端分别是伯胺基和马来酰亚胺；所述PEG上伯胺基与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应得到修饰有吡啶二巯基的PEG；PEG上的马来酰亚胺与树枝状高分子上伯胺基反应得到Den-PEG中间产物。

9.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的angiopep-2肽链其氨基酸序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY。

10.按权利要求2所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的angiopep-2肽链在其C端引入半胱氨酸得到序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC的肽链；该肽链半胱氨酸上的巯基与标记在树枝状高分子上的2-吡啶二巯基缩合得到通过PEG桥连的Den-PEG-angiopep-2化合物。

11.按权利要求1所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的标记在影像纳米药物上的angiopep-2特异性识别脑血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上低密度脂蛋白相关受体。

12.按权利要求1所述的靶向示踪的多模式诊断纳米影像药物，其特征在于，所述的纳米影像药物被磁共振成像和光学成像同时无创监测。

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