CN104511026A - 修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医学领域，涉及修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途，所述纳米探针的通式为IR783-Den-(PEG-Reg)x，其中Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer）；IR783为近红外荧光基团，PEG为分子量为10k-40k的聚乙二醇；Reg为腺苷A2A受体特异性激动剂Regadenason,x为标记在探针上PEG-Reg的数目。本发明中在双功能聚乙二醇（Mal-PEG-NHS）的一端通过马来酰亚胺基连接探针载体Den，另一端通过N-羟基琥珀酰亚胺基连接腺苷受体激动剂Reg。通过控制投料比调节探针表面修饰腺苷受体激动剂的数量。本发明对提高脑部疾病诊疗效果，降低治疗过程中毒副作用，促进脑部疾病个性化治疗方案临床转化均具有重要研究和临床意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途。本发明通过构建介导脑毛细血管内皮细胞上腺苷受体活性的纳米探针实现对血脑屏障开启时间窗口的的调控，从而实现对脑肿瘤、缺血性脑卒中等脑部重大疾病的诊疗效率。
背景技术
近年来脑部重大疾病包括脑肿瘤、缺血性脑卒中、帕金森症、奥尔海默氏病等发病率不断攀升，且具有复发率高、治愈率低、和病人生活质量差等特点。目前上述疾病诊疗面临最大困难是血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）阻止诊断和治疗药物高效入脑。BBB是由内皮细胞、周细胞、星状细胞和基底膜构成生理结构，是保护大脑的生理和免疫屏障。但由于其低通透性低，大约98%的小分子药物和绝大多数的大分子药物不能有效入脑。不同程度脑部疾病虽然会伴随局部BBB损伤，但构成BBB低通透性关键结构紧密连接(Tight Junctions,TJs)的存在仍限制治疗和诊断药物在脑内大内有效诊疗浓度。目前跨BBB药物递送方法主要有三种：（1）化学方法，通过注射甘露醇等渗透调节剂改变内皮细胞渗透压达到开启BBB目的。但其无选择性、不可控开启易造成电解质紊乱、癫痫等严重功能障碍性疾病。（2）物理方法，利用聚焦超声联合微泡等方法将药物定点“挤压”入脑。但其对血管壁和神经元潜在机械损伤，需要对病灶部位精确定位等因素限制其临床应用。（3）生物转胞吞方法，脑毛细血管内皮细胞可通过受体介导的转胞吞作用或吸附介导的转胞吞作用将蛋白或大分子药物转运入脑。此方法具有非侵入性，副作用小等特点。但由于受体表达水平，内涵体小穴形成速度、胞内转运效率等因素制约，该方法效率较低，而且无区域选择性。
腺嘌呤核苷受体是一类以腺嘌呤核苷为内源性配体的G蛋白偶联受体。Bynoe等最近发现在腺苷受体四个亚型（A1,A2A,A2B和A3）中，A1和A2A亚型受体激活后引发脑血管内皮细胞的细胞骨架重组，导致紧密连接暂时性打开，从而提高药物跨BBB效率。与传统方法不同的是，腺苷受体介导的BBB通透性增加是通过暂时性开启内皮细胞间紧密连接（TJs）而实现的。该途径不但具有非侵入性、递药效率高及不受药物分子量影响等优点，而且该可逆过程对BBB结构、功能影响较小，BBB功能的恢复能够将其通透性增加带来的副作用降到最低。Regadenason作为心肌灌注成像造影剂于2008年被FDA批准临床使用，其主要成分2-（N-吡唑基）-腺苷衍生物可特异性激活腺苷A2A受体。与非特异性激动剂如腺苷相比，Regadenason不但更高效地调节BBB通透性，还能有效避免非特异性腺苷受体激活引起的支气管痉挛等副作用。因此基于腺苷A2A受体介导的跨BBB递药方法具有重要的科研及临床意义。
有研究发现改变标记在纳米探针上的Angiopep-2肽的数目可以调控低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）参与的受体介导转胞吞跨BBB效率。另外，Jacobson等也发现多位点标记的受体激动剂能够有效提高纳米粒对腺苷受体的选择性和激动效率。由于诊断或治疗药物分子量、表面电荷和极性差异很大，针对目标药物药动学性质调控BBB开启时间窗口将可能提高药物入脑效率，同时避免药物血液停留时间与BBB开启时间窗口不匹配带来的毒副作用。因此，本申请的发明人拟改变探针载体上激动剂标记数目以调节BBB开启时间窗口，从而实现不同类型药物的跨BBB入脑效率。
发明内容
本发明的目的是在于提供修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途。以期实现对脑部疾病的高效、安全、可调控递药。本发明中，所述纳米探针能够根据不同药物药代动力学性质调控BBB的开启时间，实现颅内递药高效性和安全性的最大化。
与小分子相比，纳米载体在肿瘤诊断和治疗过程中具有被动靶向性，血液循环时间可调和多位点效应等优点。为调节BBB开启时间窗口，本发明构建了基于腺苷A2A受体激动剂的纳米探针。其通式如下：
IR783-Den-(PEG-Reg)x
通式中Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer）；PEG为分子量为10-40k的聚乙二醇；IR783为羰花青类近红外荧光基团，Reg为腺苷A2A受体激动剂Regadenason,x代表修饰在纳米探针上腺苷受体激动剂数目。
更具体的，本发明的修饰腺苷受体激动剂纳米探针可调节血脑屏障通透性，其由以下四个功能部分组成：
(1)作为探针载体的第五代聚酰胺-胺型树枝状高分子Dendrimer，具有分子量及物理尺寸均一、形貌规整、粒径合适（≈7nm）、低毒及易于标记（128个伯胺基）等优点；
(2)探针上修饰的聚乙二醇链既能够将腺苷A2A受体激动剂桥连到载体上，降低激动剂与受体作用的空间位阻，又可以提高纳米探针的生物相容性，延长其的血液循环时间，减少其被肝脏和脾脏中网状内皮系统吞噬；
(3)近红外荧光基团IR783，具有穿透能力强、光稳定性好、吸光系数和量子产率高等优点；IR783可以通过N-羟基琥珀酰亚胺基直接标记在载体表面；IR783的分子式如下所示:
(4)易于探针标记的腺苷A2A受体激动剂Reg-NH2；目标探针中，受体激动剂Regadenason是通过其氨基衍生物Reg-NH2与双功能PEG反应连接到载体分子上的；Reg-NH2的分子式如下所示:
本发明构建了标记不同数量的激动剂分子的目标探针，经试验注射探针后，结果显示，所述的探针能特异性激活脑部腺苷A2A受体实现BBB的通透性增加，在BBB开启时间窗口内注入药物能够实现脑部高效递药；经过一段时间后，受体激动效应消失，BBB恢复到正常水平，从而将BBB开启造成毒副作用降到最低。
本发明提供了所述的纳米探针的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：Reg-NH2的制备。2,6-二氯嘌呤核苷溶于氨饱和甲醇溶液中，80℃搅拌反应过夜，旋蒸除去溶剂，产物过硅胶柱纯化（二氯甲烷：甲醇=9:1），得2-氯腺嘌呤核苷。将2-氯腺嘌呤核苷与一水合肼室温搅拌反应10h，旋蒸除去未反应的肼，产物过硅胶柱纯化（二氯甲烷：甲醇=5:1）得2-肼基腺嘌呤核苷。将2,2-二甲酰基乙酸甲酯加入2-肼基腺嘌呤核苷的乙醇混悬液中回流反应2h得缩合产物。经硅胶柱纯化（二氯甲烷：甲醇=5:1）的缩合产物加入1.0M氢氧化钾甲醇溶液中室温搅拌反应12h，酯键断裂得羧酸衍生物。羧酸衍生物与N-叔丁氧羰基-乙二胺缩合得Boc保护的产物Reg-NH2-Boc。Reg-NH2-Boc在三氟乙酸和二氯甲烷1:1的溶液中搅拌反应4h，脱保护得Reg-NH2，Reg-NH2在甲醇中重结晶纯化。
步骤2：参比探针IR783-Den-(PEG)x的制备。将载体材料Den溶于1×PBS（pH7.4）中，逐滴加入PEG-NHS的DMF溶液，室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得Den-PEG。适量Den-PEG溶于05M HEPES（pH8.3）中，逐滴加入IR783-NHS的DMF溶液，室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即为参比探针IR783-Den-(PEG)x。
步骤3：目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)x。Reg-NH2溶于无水DMF中.加入三乙胺（TEA），迅速和溶于DMF的Mal-PEG-NHS混合，室温搅拌反应2h。IR783-Den-PEG溶于05M HEPES（pH8.3）中，将DMF混合液缓慢滴入此溶液中，室温搅拌反应过夜。将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)x。
本发明提供的可调节血脑屏障通透性的纳米探针具有以下优点：
（1）通过特异性激活腺苷A2A受体提高BBB通透性。与现有方法相比，腺苷A2A受体介导跨BBB机制具有非侵入性，高效，安全等优点。
（2）本发明提供的纳米探针，合成方法简单，条件温和、所需原材料易得、价格低廉、易于表征。利用马来酰亚胺与树枝状高分子伯胺基间高键合效率（≈100%），实现了载体分子上受体激动剂标记个数的精确调控
（3）跨BBB策略方面，通过改变探针上激动剂标记数目实现对BBB开启时间窗口的调控，不同类型的药物均可以实现高效、安全入脑，较少受药物或个体因素限制，具有普适性。
（4）本发明提供的纳米探针表面还具有不同数目的伯氨基，可以进一步与其它功能基团偶联，使之具有特定功能。
附图说明
图1，腺苷A2A受体激动剂Reg-NH2的合成路线图。
图2，Reg-NH2的氢谱及碳谱图。
图3，纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)x的合成路线图。
图4，纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)x的氢谱图。
图5，参比探针IR783-Den-(PEG)x的氢谱图。
图6，纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)8和参比探针IR783-Den-(PEG)8的粒径、电位与SDS-PAGE图。
图7，体外BBB模型中不同纳米探针开启血脑屏障时间窗口。
图8，激光共聚焦显微镜图片，其中显示经相应探针（10μM）处理30min后染色，标有罗丹明的鬼笔环肽染的细胞骨架actin为红色，DAPI染细胞核为蓝色。
图9，γ相机活体影像图。
图10，纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16和参比探针IR783-Den-(PEG)16组小鼠脑组织切片自显影图像。
图11，注射纳米探针和参比探针的小鼠脑部SPECT/CT活体影像图，其中显示分别注射纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16（5nmol，200μL）和参比探针IR783-Den-(PEG)16（5nmol，200μl），30min后注射模型药物Dextran20k-99mTc（1mCi，150μl），药物注射30min后进行小鼠脑部SPECT/CT成像，白色箭头指示放射性药物入脑。
具体实施方式
实施例1，可用于探针标记活性激动剂Reg-NH2的合成路线如图1所示：
化合物1（500mg,1.56mmol）溶于氨饱和甲醇溶液，加入高压反应瓶中，80℃搅拌反应7h，减压蒸去溶剂，产物过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=9:1)得化合物2。将化合物2（380mg,1.25mmol）溶于2ml一水合肼中，室温搅拌反应10h，减压蒸发除去未反应的肼，产物过硅胶柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=5:1）得化合物3。将化合物3（237mg,0.8mmol）混悬于150ml乙醇中，加入2,2-二甲酰基乙酸甲酯（149mg,1.04mmol），混合液液回流反应2h。减压蒸发除去反应溶剂，黄色固体产物经硅胶柱层析纯化（二氯甲烷:甲醇=5:1）得化合物4；将化合物4（202mg,0.5mmol）混悬于10ml1M氢氧化钾的甲醇溶液中，室温搅拌反应20h，酯键断裂得，减压蒸去有机溶剂，固体溶于ml水，用1M HCl调至pH4.0，析出的固体过滤、洗涤得化合物5。化合物5（170mg,0.45mmol）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（427mg,0.9mol）和1-羟基苯并三唑（171mg,0.9mol）溶于2ml无水DMF，加入95μl N-叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应17h，减压蒸去溶剂，固体产物在甲醇中重结晶得化合物6。将化合物6（150mg,0.27mmol）溶于6ml三氟乙酸和二氯甲烷1:1的混合溶液中，室温搅拌反应4h，减压蒸发除去溶剂得白色固体即为目的产物Reg-NH2。图2为Reg-NH2氢谱图。
实施例2，目标纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)8的合成如图3所示：
Reg-NH2（12.6mg,0.03mmol）溶于500μL的DMF中，加入6μL三乙胺。磁力搅拌下逐滴加入300μL的Mal-PEG2k-NHS（40mg,0.02mmol）的DMF溶液。常温下搅拌反应2小时后，形成Regadenason的PEG衍生物Mal-PEG-Reg。上述反应液滴入第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物Dendrimer（50mg,1.7×10-3mmol）的1×PBS溶液中（pH7.4）。室温搅拌反应12h。反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，转速4000rpm，每次30min，浓缩液冷冻干燥得白色絮状产物Den-PEG-Reg。IR783-NHS（1.8mg,1.8×10-3mol）)溶于200μl无水DMF中，将上述溶液滴入2.0ml Den-PEG-Reg（59mg,1.2×10-3mol）的0.01M PBS溶液中，调节pH7.4，避光反应2h，反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，转速4000rpm，每次30min，浓缩液冷冻干燥得绿色目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)8。图4为IR783-Den-(PEG-Reg)8氢谱图。
实施例3,参比探针IR783-Den-(PEG)8的合成
参比探针IR783-Den-(PEG)8的合成步骤是将Mal-PEG2k-NHS的DMF溶液直接滴入Dendrimer的1×PBS溶液中反应。其余反应和操作步骤与目标探针的相同。图5为IR783-Den-(PEG)8的氢谱图。
实施例4,目标探针和参比探针的表征
纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)8和IR783-Den-(PEG)8的粒径和Zeta电位是在马尔文粒径分析仪上采用动态光散射法完成的。2.0mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液用于设备校准。粒径分析样品为100μg/mL的1×PBS（pH7.4）溶液。Zeta电位分析样品为200μg/mL的10mM NaCl溶液。所有测试样品用0.45μm的针孔式过滤器过滤。IR783-Den-(PEG-Reg)8和IR783-Den-(PEG)8的平均粒径分别为8.6nm和9.2nm，平均Zeta电位为+15.6和+9.3mV。粒径和Zeta电位图谱如图6所示；
纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)8和IR783-Den-(PEG)8的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。纳米探针上样量为80ng，体积为30μL，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为8%。电压100V下电泳分离2h后，在Maestro小动物活体成像系统拍摄胶板的近红外荧光图谱，电泳结果结果如图6所示，由电泳图可得出两种纳米探针分子量分布集中，纯度较高。
实施例5，按照实施例1，2，3的实验方法，固定原料的种类，调节Dendrimer、PEG、Reg-NH2、IR783之间的投料比，可以合成标记不同数目腺苷A2A激动剂的目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)x，以及参比探针IR783-Den-(PEG)x。
实施例6，体外血脑屏障模拟实验
用永生化小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3建立体外血脑屏障模型。将bEnd.3细胞以每个小室1000个细胞接种在Transwell的上层小室（小室面积0.32cm2，孔径大小为0.4μm）中，通过电阻仪监测bEnd.3细胞成长过程中的跨内皮细胞电阻抗值，当电阻抗值高于140Ω·cm2时，认为体外血脑屏障模型成功建立。按照实施例1、2、3的方法，改变Reg-NH2、Mal-PEG-NHS和Dendrimer的投料比分别合成了每分子探针表面标记1、4、8、16个激动剂Regadenason的纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)1、IR783-Den-(PEG-Reg)4、IR783-Den-(PEG-Reg)8、IR783-Den-(PEG-Reg)16以及参比探针IR783-Den-(PEG)16。分别使用含5μMIR783-Den-(PEG)16、IR783-Den-(PEG-Reg)1、IR783-Den-(PEG-Reg)4、IR783-Den-(PEG-Reg)8、IR783-Den-(PEG-Reg)16的培养液处理Transwell上层小室的细胞，于10,30,45min,1,2,4,8,12h测定跨内皮细胞电阻抗值，取电阻抗值低于80%为开启BBB模型的标准，比较各探针开启BBB时间。结果显示（如图7所示），随探针表面激动剂数量的增多，血脑屏障开启的时间和程度均显著增高。
实施例,7，Actin共聚焦显微镜实验
本实施例进一步探索纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16调节血脑屏障通透性的机制，进行了免疫荧光实验。将小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3接种在四室腔室玻片上。实验分为4组：正常对照组，Regadenason组，IR783-Den-(PEG)16组和IR783-Den-(PEG-Reg)16组。经相应探针（10μM）处理30min后，依次用4%PFA固定、0.2%Triton透化、5%BSA封闭。用标记有罗丹明的鬼笔环肽染细胞骨架actin，DAPI染细胞核。玻片去除腔室隔板后用抗荧光淬灭液封闭，并于激光共聚焦显微镜拍摄细胞骨架的变化。实验结果如图8所示。经Regadenason和IR783-Den-(PEG-Reg)16处理后，细胞内actin重组，在胞浆内形成大量较粗的纤维丝。正常细胞和IR783-Den-(PEG)16处理的细胞中，actin在细胞周边分布较多，纤维丝较细，在细胞浆内呈弥散分布。上述结果说明Regadenason和目标探针是通过引起细胞骨架重组，细胞收缩的方式增加内皮细胞间隙，从而调节血脑屏障通透性的。
实施例8，γ相机成像及放射自显影成像实验
通过γ相机活体影像实验，考察了活体状态下纳米探针开启血脑屏障的时间窗口。按照实施例1、2、3的方法合成了IR783-Den-(PEG-Reg)16和IR783-Den-(PEG)16。将雄性ICR小鼠随机分为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4共8组。A组小鼠注射纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16（5nmol,200μl），分别于注射探针10min（A1），30min（A2），2h（A3），4h（A4）注射考察血脑屏障通透性的模型药物Dextran20k-99mTc（500μCi，150μL）。注射模型药物后30min，用γ相机活体成像，考察模型药物入脑情况。活体成像后将小鼠麻醉后灌流，取出脑组织用4%PFA固定,脑组织切片,自显影成像。B组小鼠注射参比探针IR783-Den-(PEG)16(5nmol，200μl)后，按A组相同方法进行试验。实验结果如图9所示，与B组小鼠相比，A组小鼠模型药物入脑量显著提高，且在注射探针10min时血脑屏障通透性提高，30min时达到最高，4h后恢复正常。脑组织切片自显影图像（图10）也验证了上述结果。说明纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16可以可逆的开启血脑屏障，实现药物入脑。
实施例9，活体SPECT/CT成像实验
活体SPECT/CT成像在Bioscan NanoSPECT/CT成像系统上完成。通过SPECT/CT成像验证了纳米探针开启血脑屏障的作用，并考察了开启脑部血脑屏障的空间位置。雄性ICR小鼠随机分为两组。分别注射纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16（5nmol，200μL）和参比探针IR783-Den-(PEG)16（5nmol，200μl），30min后注射模型药物Dextran20k-99mTc（1mCi，150μl），药物注射30min后进行小鼠脑部SPECT/CT成像。SPECT成像参数：扫描时间：20分钟，步距角：15°,投影数目：24，扫描速度：150s/360°；图像矩阵128×128，层厚：0.2mm。CT成像参数：180投影数目：180；矩阵192×192，X-射线源：45kVp，曝光时间：500ms，层厚：0.2mm。小鼠脑部纵切面SPECT/CT图像如图11所示，与参比组相比，纳米探针IR783-Den-(PEG-Reg)16可以调节血脑屏障通透性，提高模型药物入脑量，且在纹状体、丘脑和小脑部位通透性提高效果最明显，这可能与腺苷受体在这些部位的表达量较高有关。由于Regadenason本身具有扩张血管的作用，小鼠头部的血管和其他部位模型药物量也显著高于参比组。
Claims (8)
1.修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其通式如下：
IR783-Den-(PEG-Reg)x
通式中，Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer）；PEG为分子量为10-40k的聚乙二醇；IR783为羰花青类近红外荧光基团，Reg为腺苷A2A受体激动剂Regadenason,x代表修饰在纳米探针上腺苷受体激动剂数目。
2.如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的腺苷A2A受体激动剂Regadenason通过其氨基衍生物Reg-NH2与双功能聚乙二醇键连标记到载体分子上，Reg-NH2的分子式如下所示:
3.如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，Reg-NH2通过双功能聚乙二醇[马来酰亚胺-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Mal-PEG-NHS)]连接到载体分子上，Mal-PEG-NHS的分子式如下所示：
4.如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的载体材料Den为第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，每分子载体连接激动剂的数目为1-40个。
5.如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的载体材料Den为第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，每分子载体连接激动剂的数目为1，4，8或16个。
6.权利要求1的修饰腺苷受体激动剂纳米探针的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
步骤1：制备Reg-NH2
2,6-二氯嘌呤核苷溶于氨饱和甲醇溶液中，80℃搅拌反应过夜，旋蒸除去溶剂，产物过硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=9:1，得2-氯腺嘌呤核苷；将2-氯腺嘌呤核苷与一水合肼室温搅拌反应10h，旋蒸除去未反应的肼，产物过硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=5:1，得2-肼基腺嘌呤核苷；将2,2-二甲酰基乙酸甲酯加入2-肼基腺嘌呤核苷的乙醇混悬液中回流反应2h得缩合产物；经硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=5:1，的缩合产物加入1.0M氢氧化钾甲醇溶液中室温搅拌反应12h，酯键断裂得羧酸衍生物；羧酸衍生物与N-叔丁氧羰基-乙二胺缩合得叔丁氧羰基保护的产物Reg-NH2-Boc；Reg-NH2-Boc在三氟乙酸和二氯甲烷1:1的溶液中搅拌反应4h，脱保护得Reg-NH2，Reg-NH2在甲醇中重结晶纯化；
步骤2：制备参比探针IR783-Den-(PEG)x
将载体材料Den溶于1X PBS（pH7.4）中，滴加入聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液，室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得Den-PEG；适量Den-PEG溶于05M4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES，pH8.3）中，逐滴加入IR783-N-羟基琥珀酰亚胺酯（IR783-NHS）的DMF溶液，室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即为参比探针IR783-Den-(PEG)x，x代表修饰在探针上PEG基团的数目；
步骤3：制备目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)x
Reg-NH2溶于无水DMF中.加入三乙胺（TEA），与溶于DMF的Mal-PEG-NHS混合，室温搅拌反应2h；IR783-Den-PEG溶于05M4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES，pH8.3）中，将DMF混合液滴入此溶液中，室温搅拌反应过夜；将反应液用截留分子量为10kDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即目标探针IR783-Den-(PEG-Reg)x。
7.权利要求1的修饰腺苷受体激动剂纳米探针在制备有序调控对血脑屏障开启时间窗口中的用途，其中通过调节探针表面腺苷受体激动剂的标记数目实现所述的有序调控。
8.按权利要求7所述的用途，其特征在于所述的有序调控是根据不同药物的药动学性质，调节血脑屏障开启的时间窗口，实现不同类型药物或诊断试剂跨血脑屏障递送。
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Citations (5)
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2013
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Patent Citations (5)
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