CN102294038A - 基于树状大分子的ct/mri双模态成像造影剂的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，包括：(1)在第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，加入DOTA-NHS溶液，再加入EDC活化后的mPEG-COOH溶液，搅拌反应，得到功能化树状大分子溶液；(2)在上述功能化树状大分子溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，搅拌反应；然后加入硝酸钆溶液搅拌，再加入三乙胺和乙酸酐，搅拌反应8-24h；(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压；本发明制备得到的CT/MRI双模态成像造影剂具有良好的CT/MRI成像效果，为新型多功能造影剂的开发打下了良好的基础。

Description

基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备

技术领域

本发明属于CT/MRI双成像造影剂的制备领域，特别涉及一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法。

背景技术

由于CT、MRI成像在医学成像上各有优点和缺点，临床上为了提高疾病早期诊断的灵敏度和准确度，常常将两者有机地结合，使当前影像学检查既扩大了检查的范围，又提高了诊断水平。而将CT和MRI以互补形式作为医疗成像检测手段，通常需要CT和MRI两种成像造影剂。虽然多种CT或MRI成像造影剂各自能够获较好的造影效果，但是若采用两种造影剂，一方面给临床应用造成了不便，另一方面也会增加造影剂对患者的毒副作用。因此，可以想象，一种多功能的造影剂系统，能够完成多模态成像造影诊断，将会大大提高诊断的灵敏度与准确度，而且会减轻对患者的因多次注射造成的痛苦和毒副作用，在临床应用中将具有极大的价值，可以提供更全面的诊断信息和疾病发展的动态过程。

虽然目前只有少数CT/MRI双成像造影剂研制成功，如Alric等(C.Alric；J.Taleb；G.LeDuc；et al.J.Am.Chem.Soc.2008，130，5908-5915.)以DTDTPA稳定纳米金颗粒，再螯合Gd³⁺，取得了很好的双模态成像造影效果。但其制备方法较为复杂，造影剂用量较高，血液循环时间较短，因而限制了其临床应用。可以肯定的是，随着CT和MRI以互补形式作为医疗成像检测手段在临床上的广泛应用，CT/MRI双模态造影剂将成为医学成像研究的热点。

聚酰胺胺(poly(amidoamine)，PAMAM)树状大分子是通过支化单元逐步重复反应得到的具有树状高度支化结构的大分子。它具有高度支化、高度单分散性，拥有可控的、规则的结构和组成。它不仅由于表面拥有众多的功能基团而具有独特的表面物理、化学性质，而且具有独特的内部空腔结构。表面大量的官能基团，可以通过共价键对其进行修饰与功能化，也可以通过静电作用等作用力等稳定或鳌合金属离子，形成复合材料。另外其内部的空腔结构还可以包裹目标分子，有选择性地结合客体分子，十分适合于作为金属纳米颗粒的载体。例如Shi X.Y.等(Shi，X.Y.；Wang，S.H.；Meshinchi，S.；et al.Small 2007，3，1245.)利用端基为氨基的第五代PAMAM树状大分子为模板原位还原制备了，金纳米颗粒，并在包裹纳米金的树状大分子外围修饰靶向分子、染料等，制备得到的金纳米颗粒(平均直径为3.2nm)具有良好的生物相容性，可对癌症细胞进行有效地靶向和成像。

检索国内外有关CT/MRI双模态造影剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于树状大分子的包裹金纳米粒子螯合钆的CT/MRI造影剂的制备与应用方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，该双模态成像造影剂具有良好的CT/MRI成像效果，为新型多功能造影剂的开发打下了良好的基础。

本发明的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，包括：

(1)在第五代聚酰胺-胺树状大分子(购于Dendritech公司)的DMSO溶液中，加入DOTA-NHS的DMSO溶液，反应12-30h；再加入EDC活化后的mPEG-COOH(购于上海炎翌生物科技有限公司)的DMSO溶液，搅拌反应2-4d，得到功能化树状大分子溶液；

(2)在上述功能化树状大分子溶液中加入氯金酸溶液搅拌20-40min，再加入硼氢化钠溶液还原纳米金颗粒，搅拌反应1-4h；然后加入硝酸钆溶液搅拌2-15h，将钆离子螯合进接枝在树状大分子上的DOTA内，再加入三乙胺搅拌20-40min，最后加入乙酸酐，将树状大分子表面剩余的氨基乙酰化，搅拌反应8-24h；

(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得螯合钆包裹金纳米粒子的功能化树状大分子{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

所述步骤(1)中第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.0500-0.500mmol/L，其溶剂为DMSO；DOTA-NHS溶液的浓度为2.50-4.485mmol/L，其溶剂为DMSO；DOTA-NHS与树状大分子的摩尔比为5-20∶1。

所述步骤(1)中的DOTA-NHS购于CheMatech公司，其英文名称是2，2′，2″-(10-(2-(2，5-dioxopyrrolidin-1-yloxy)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetic acid(2，2′，2″-(10-(2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三)三乙酸)

所述步骤(1)中EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液的制备方法为：在mPEG-COOH的DMSO溶液中加入EDC的DMSO溶液，然后搅拌2-4h；其中mPEG-COOH的DMSO溶液的浓度为8.55mg/mL，EDC的DMSO溶液的浓度为17.2mg/mL，mPEG-COOH与EDC的体积比为2∶1。

所述步骤(1)中EDC、mPEG-COOH和树状大分子摩尔比为20-300∶5-20∶1。

所述步骤(2)中氯金酸溶液的溶剂为DMSO和水，其中DMSO和水的体积比为1-3∶1。

所述步骤(2)中HAuCl₄·4H₂O和树状大分子的摩尔比为50-250∶1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为2-5∶1。

所述步骤(2)中Gd(NO₃)₃·6H₂O和DOTA的摩尔比为1-5∶1；N(C₂H₅)₃、Ac₂O和树状大分子的摩尔比为120-660∶100-550∶1。

所述步骤(2)中的硼氢化钠溶液的溶剂为水和甲醇，其中水与甲醇的体积比为2∶1。

所述步骤(3)中的透析为用纤维素透析膜(MWCO＝14000)在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天。

本发明中将钆螯合剂DOTA-NHS接枝到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子表面，DOTA-NHS采用在快速搅拌下逐滴滴加的方式加入到树状大分子溶液中，以保证树状大分子接枝DOTA的均一性。

本发明中使用1-20倍量EDC活化mPEG-COOH的羧基，增强与树状大分子反应的活性，活化的mPEG-COOH也采用逐滴滴加的方式加入到树状大分子溶液中，以保证树状大分子接枝PEG的均一性。同时PEG的加入可以增加该材料的体内循环时间，并增加后续包裹纳米金的量，达到更加灵敏的CT造影效果。

本发明中氯金酸溶液加入后，搅拌20-40min，使氯金酸分子与树状大分子充分混合，利用AuCl₄ ^-与树状大分子氨基的亲和力使得其进入树状大分子内部空腔，再以强还原剂NaBH₄还原，得到树状大分子包裹的金纳米颗粒，很好地防止了金纳米颗粒的聚集。HAuCl₄·4H₂O∶NaBH₄∶树状大分子摩尔比为50-250∶100-1250∶1(NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比≥2∶1)，既保证纳米金的胶体稳定性，又有效提高纳米金的含量。

本发明中以乙酰化树状大分子表面剩余的氨基以降低其表面电势，提高材料的生物相容性。以三乙胺保持溶液的碱性环境保证乙酰化反应的顺利进行。

本发明中(5)中的透析过程采用纤维素透析膜MWCO＝14000；磷酸盐缓冲液，蒸馏水。

使用UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、CT成像及MRI成像表征本发明获得的具有双模态造影功能的树状大分子的结果分别如下：

(1)UV-Vis测试结果

UV-Vis测试结果表明：本发明中制备得到的CT/MRI双模态造影剂颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰位于528nm，参见说明书附图2。这表明本发明中制备得到了金纳米颗粒。

(2)TEM测试结果

TEM测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布，参见说明书附图3。金纳米颗粒平均直径约4.55nm，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。

(3)CT成像测试结果

CT成像测试结果表明制备的材料的X-射线衰减强度随金浓度的提高呈线性上升趋势，表现出良好的X-射线衰减特性，参见说明书附图4。

(4)MRI测试结果

MRI测试结果表明随着钆(III)浓度的提高，所制备的材料具有较大的r₁弛豫率。参见说明书附图5。

(5)大鼠活体肾和膀胱CT成像

将800μL{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Au]＝0.1164mol/L)尾部静脉注射进体重为210g的大鼠体内，通过CT扫描检测得到的图片(附图6，附图7)，从图中能够清楚地看到大鼠的膀胱和肾，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs具有较好的CT成像效果。

(6)小鼠活体肾和膀胱MR成像

将100μL{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Gd]＝12.42mmol/L)尾部静脉注射进体重为15g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的图片(附图8，附图9)，从图中能够清楚地看到小鼠的膀胱和肾，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs具有较好的MR成像效果。

本发明方法制备的螯合钆包裹金纳米粒子的功能化树状大分子材料，其金纳米颗粒尺寸分布较窄，具有良好的分散性。X-射线衰减强度测试结果表明，金纳米颗粒的X-射线衰减强度信号较好，体内试验也表明其具有良好的CT成像性能。磁共振成像测试结果表明，螯合的钆离子可以显著地缩短T₁弛豫时间，显示信号增强，体内试验也表明其良好的MR成像性能。

以表面具有大量氨基，内部具有大量空腔和结构精确可控的聚酰胺-胺树状大分子为模板和稳定剂，制备了功能化的基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂，本发明涉及了四个基本原理：

(1)充分利用聚酰胺-胺树状大分子的表面大量的可修饰化氨基，接枝钆螯合剂DOTA和mPEG，既修饰了MRI造影剂钆(III)螯合剂DOTA，又提高了该造影剂的血液循环时间和生物相容性。

(2)充分利用聚酰胺-胺树状大分子的内部空腔包裹稳定纳米金颗粒。在还原前，其内部空腔可以对AuCl₄ ^-进行络合；还原后，可以起到防止金纳米颗粒团聚的作用。采用强还原剂NaBH₄对金属离子进行快速还原，在树状大分子内部空腔的约束下，产生稳定的金纳米颗粒。

(3)金纳米颗粒对X-射线有良好的衰减能力。X-射线衰减强度测试结果表明，该材料有较高的X-射线衰减强度及更好的成像对比度。说明树状大分子包裹金纳米颗粒的造影剂可以作为一种充满希望的CT造影剂。且小鼠活体CT成像测试表明，其具有良好的CT成像效果。

(4)钆(III)对MR成像有很好的造影效果。MR测试结果表明，该材料有较高的r₁弛豫率及更好的成像对比度。说明树状大分子-钆磁共振成像造影剂可以作为一种充满希望的T₁造影剂。且小鼠活体MR成像测试表明，其具有良好的MR成像效果，是一种优良的T₁造影剂。

制备CT/MRI双模态造影剂的关键要素就是找到一个合适的载体平台以负载不同的造影元素，形成多功能造影剂复合体。聚酰胺胺(poly(amidoamine)，PAMAM)树状大分子是通过支化单元逐步重复反应得到的具有树状高度支化结构的大分子。它具有高度支化、高度单分散性，拥有可控的、规则的结构和组成。它不仅由于表面拥有众多的功能基团而具有独特的表面物理、化学性质，而且具有独特的内部空腔结构。表面大量的官能基团，可以通过共价键对其进行修饰与功能化，也可以通过静电作用等作用力等稳定或鳌合金属离子，形成复合材料。所以PAMAM树状大分子可以有效用作一种纳米平台，修饰或装载不同的造影元素，可以满足多模态成像造影剂的要求。利用树状大分子所具备的优异的单分散性、表面大量官能团的可修饰性、内部空腔结构所具有的载药性和经修饰后具备的良好的生物相容性，我们通过树状大分子对无机纳米颗粒进行修饰、组装及生物功能化，以及各种小分子造影剂的接枝，制备出优良的多功能分子影像学造影剂用于CT/MRI双模态成像，应用于疾病的早期诊断。

本发明利用树状大分子的特定结构和性质，将钆螯合剂DOTA接枝在树状大分子表面以螯合钆实现MRI成像，然后将EDC活化的mPEG-COOH接枝在树状大分子表面以增加其血液循环时间，并提高生物相容性，最后在树状大分子内部包裹纳米金颗粒用于CT成像，并乙酰化树状大分子表面剩余氨基降低表面正电荷性，以降低其毒性，制备出优良的CT/MRI双模态造影剂。

有益效果

(1)本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化树状大分子的制备，以及MR和CT造影剂用于CT/MRI双模态成像，具有很好的使用价值；

(2)本发明所采用的制备程序可用于制备具有靶向性的MR和CT造影剂用于CT/MRI靶向双模态成像，具有很好的使用价值；

(3)本发明制备得到的功能化的基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂具有良好的CT/MRI成像效果，为新型多功能造影剂的开发打下了良好的基础。

附图说明

图1为本发明反应方程式简图。

图2为本发明制备的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs的紫外吸收光谱图。

图3为本发明制备的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs的TEM图片(a)和粒径分布直方图(b)。

图4为本发明制备的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs(1)和{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs(2)的CT图片(a)和X-射线衰减与金浓度的线性关系图(b)。

图5为本发明制备的G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac(1)和{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs(2)的T₁-权重自旋回波伪彩图(a)和T₁弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图(b)；

图6为800μL的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Au]＝0.1164mol/L)尾部静脉注射进大鼠体内，通过CT扫描检测得到的大鼠膀胱(如箭头所示)的CT图片，从左至右依次为注射前5min，注射后5min，15min，30min，45min。

图7为800μL的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Au]＝0.1164mol/L)尾部静脉注射进大鼠体内，通过CT扫描检测得到的大鼠肾(如箭头所示)的CT图片，从左至右依次为注射前5min，注射后5min，15min，30min，45min。

图8为100μL的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Gd]＝12.42mmol/L)尾部静脉注射进小鼠体内，通过MR扫描检测得到的小鼠膀胱(如箭头所示)的MRI图片，从左至右依次为注射前5min，注射后15min，30min，45min。

图9为100μL的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Gd]＝12.42mmol/L)尾部静脉注射进小鼠体内，通过MR扫描检测得到的小鼠肾(如箭头所示)的MRI图片，从左至右依次为注射前5min，注射后15min，30min，45min。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)用10mL的DMSO溶解干重为22.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于4mLDMSO溶液的干重为6.44mg的DOTA-NHS，其中DOTA-NHS：树状大分子摩尔比为10∶1，反应24小时。在4mL mPEG-COOH的DMSO溶液(8.55mg/mL)中，加入2mL EDC的DMSO溶液(17.2mg/mL)，搅拌反应3小时后逐滴滴加到G5PAMAM树状大分子与DOTA-NHS的反应液中，搅拌反应72小时。

(2)取步骤(1)反应液10mL，加入10mL DMSO和10mL水，搅拌混匀后，加入2.29mL HAuCl₄水溶液(20mg/mL)混合，在室温下搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入1.236mL的20mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应3h；

(3)向步骤(2)的反应液中加入0.535mL Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液(12mg/mL)，搅拌反应12小时，再加入39.24μL三乙胺，搅拌反应30min后，向反应液中加入22.3μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝14000)逐次在磷酸盐缓冲溶液4L×3和蒸馏水4L×3中透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到功能化的基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子载体表面修饰了8.8个DOTA分子，18个mPEG分子。对得到的产品{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs进行紫外吸收表征如附图2，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰在528nm，证明了金纳米颗粒的形成，TEM图片(附图2)表明金纳米颗粒直径约4.55nm，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为250个金原子，载钆量为27个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

实施例2

(1)用5mL的DMSO溶解干重为11.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于4mL DMSO溶液的干重为3.22mg的DOTA-NHS，其中DOTA-NHS：树状大分子摩尔比为10∶1，反应18小时。在2mL mPEG-COOH的DMSO溶液(8.55mg/mL)中，加入1mL EDC的DMSO溶液(17.2mg/mL)，搅拌反应3小时后逐滴滴加到G5PAMAM树状大分子与DOTA-NHS的反应液中，搅拌反应72小时。

(2)取步骤(1)反应液6mL，加入10mL DMSO和10mL水，搅拌混匀后，加入115mL HAuCl₄水溶液(20mg/mL)混合，在室温下搅拌20min，溶液变成浅黄色，随后加入0.618mL的20mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应1h；

(3)向步骤(2)的反应液中加入0.535mL Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液(6mg/mL)，搅拌反应12小时，再加入19.62μL三乙胺，搅拌反应20min后向反应液中加入11.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝14000)逐次在磷酸盐缓冲溶液4L×3和蒸馏水4L×3中透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到功能化的基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子载体表面修饰了8.8个DOTA分子，18个mPEG分子。对得到的产品{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs进行紫外吸收表征如附图2，纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰在528nm，证明了金纳米颗粒的形成，TEM图片(附图3)表明金纳米颗粒平均直径为4.55nm，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为250个金原子，载钆量为27个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

实施例3

以体外CT测试的HU值来检验实施例1和对比例1合成的两种材料{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs与{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs的CT成像效果。取实例1样品29.88mg溶解在580μL的PBS缓冲液中配制金浓度为0.1M的溶液，再分别稀释到金浓度为0.08M，0.05M，0.03M，0.02M，0.01M的溶液各200μL。取对比例1样品26.51mg溶解在580μL的PBS缓冲液中配制金浓度为0.1M的溶液，再分别稀释到金浓度为0.08M，0.05M，0.03M，0.02M，0.01M的溶液各200μL。用CT测试仪测试各个样品的HU值并得出X-射线衰减与金浓度的线性关系。附图4(a)为样品的CT图片(其中1为{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs和2为{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs)，附图4(b)为样品1，2的X-射线衰减与金浓度的线性关系图。从图4(a)中可以看出相同浓度的样品1比样品2的CT图片亮度高，HU值大，说明在Gd(III)离子的存在可以增强材料的CT造影效果。同样图4(b)中两个材料的浓度和HU值线性关系良好，样品1的HU值与金浓度的线性关系的斜率为5249大于样品2(4580)，进一步说明Gd(III)离子的存在可以增强材料的CT造影效果，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs具有较好的CT成像效果。

实施例4

以体外MR测试的T₁值来检验实施例1和对比例2合成的两种材料{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs与G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac的MRI成像效果。取实例1样品37.35mg溶解在2.9mL的PBS缓冲液中配制钆浓度为2.7mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为2.16mM，1.35mM，0.81mM，0.54mM，0.27mM的溶液各1mL。取对比例2样品23mg溶解在2.9mL的PBS缓冲液中配制钆浓度为1.3mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为1.04mM，0.65M，0.39M，0.26M，0.13M的溶液各1mL。用医用3T MR测试仪测试各个样品的T₁值并得出1/T₁的值与钆浓度的线性关系。附图5(a)为样品的T₁-权重自旋回波伪彩图(其中1为G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac，2为{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs)，附图5(b)为样品1，2的T₁弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图。从图5(a)中可以看出相同浓度的样品1比样品2MR图片的T₁值低，说明金纳米粒子的存在使得材料的T₁权重值较高，MR信号对比性差。同样图5(b)中两个材料的浓度和1/T₁值线性关系良好，但是样品1的纵向驰豫率(t₁)为4.84mM^-1s^-1大于样品2的1.05mM^-1s^-1，进一步说明金纳米粒子的存在降低了材料的MR造影效果。

实施例5

将800μL实施例1或2中得到的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Au]＝0.1164mol/L)尾部静脉注射进体重为210g的大鼠体内，用药前5min对其通过CT扫描检测得到大鼠膀胱和肾的图片(附图6t₀-5min，附图7t₀-5min)，用药后5min，15min，30min，45min再分别通过CT扫描得到大鼠膀胱和肾的CT图片(附图6t₀+5min，6t₀+15min，6t₀+30min，6t₀+45min，附图7t₀+5min，7t₀+15min，7t₀+30min，7t₀+45min)，从图中可以看出，与用药前的CT图片相比，用药后大鼠的膀胱和肾的CT信号有明显的增强，膀胱和肾更加清晰，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs具有较好的CT成像效果。

实施例6

将100μL实施例1或2中得到的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs([Gd]＝12.42mmol/L)尾部静脉注射进体重为15g的小鼠体内，用药前5min对其通过MR扫描检测得到小鼠膀胱和肾的图片(附图8t₀-5min，附图9t₀-5min)，用药5min，15min，30min，45min后再分别通过MRI扫描得到小鼠膀胱和肾的MR图片(附图8t₀+5min，8t₀+15min，8t₀+30min，8t₀+45min，附图9t₀+5min，9t₀+15min，9t₀+30min，9t₀+45min)，从图中可以看出，与用药前的MR图片相比，用药后小鼠的膀胱和肾的T₁信号有明显的增强，膀胱和肾更加清晰，证明本方法合成的{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs具有较好的MR成像效果。

对比例1

(1)用5mL的DMSO溶解干重为11.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于4mL DMSO的干重为3.22mg的DOTA-NHS，其中DOTA-NHS∶树状大分子摩尔比为10∶1，反应18小时。在2mL mPEG-COOH的DMSO溶液(8.55mg/mL)中，加入1mL EDC的DMSO溶液(17.2mg/mL)，搅拌反应3小时后逐滴滴加到G5PAMAM树状大分子与DOTA-NHS的反应液中，搅拌反应72小时。

(2)取步骤(1)反应液6mL，加入10mL DMSO和10mL水，搅拌混匀后，加入115mL HAuCl₄水溶液(20mg/mL)混合，在室温下搅拌20min，溶液变成浅黄色，随后加入0.618mL的20mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应0.5h；

(3)向步骤(2)的反应液中加入加入19.62μL三乙胺，搅拌反应20min后向反应液中加入11.2μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝14000)逐次在磷酸盐缓冲溶液4L×3和蒸馏水4L×3中透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到不含钆的成像造影剂对比产物{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载金量为250个金原子，载钆量为0个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含钆的成像造影剂对比产物{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

对比例2

(1)用5mL的DMSO溶液溶解干重为11.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边逐滴滴加溶于4mL DMSO溶液的干重为3.22mg的DOTA-NHS，其中DOTA-NHS∶树状大分子摩尔比为10∶1，反应18小时。在2mL mPEG-COOH的DMSO溶液(8.55mg/mL)中，加入1mL EDC的DMSO溶液(17.2mg/mL)，搅拌反应3小时后逐滴滴加到G5PAMAM树状大分子与DOTA-NHS的反应液中，搅拌反应72小时。

(2)向步骤(1)的反应液中加入0.265mL Gd(NO₃)₃·6H₂O的水溶液(12mg/mL)，搅拌反应12小时，再加入39.24μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入22.3μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝14000)逐次在磷酸盐缓冲溶液4L×3和蒸馏水4L×3中透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到不含金的成像造影剂对照产物G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac。

电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个树状大分子的载钆量为13个Gd(III)离子，0个金原子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含金的成像造影剂对照产物G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac。

Claims (9)

1.一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，包括：

(1)在第五代聚酰胺-胺树状大分子的DMSO溶液中，加入DOTA-NHS的DMSO溶液，反应12-30h；再加入EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液，搅拌反应2-4d，得到功能化树状大分子溶液；

(2)在上述功能化树状大分子溶液中加入氯金酸溶液搅拌20-40min，再加入硼氢化钠溶液，搅拌反应1-4h；然后加入硝酸钆溶液搅拌2-15h，再加入三乙胺搅拌20-40min，最后加入乙酸酐，搅拌反应8-24h；

(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得螯合钆包裹金纳米粒子的功能化树状大分子{(Au⁰)₂₅₀-G5-DOTA(GdIII)₁₀-PEG₂₀-Ac}DENPs。

2.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.0500-0.500mmol/L，其溶剂为DMSO；DOTA-NHS溶液的浓度为2.50-4.485mmol/L，其溶剂为DMSO；DOTA-NHS与树状大分子的摩尔比为5-20∶1。

3.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液的制备方法为：在mPEG-COOH的DMSO溶液中加入EDC的DMSO溶液，然后搅拌2-4h；其中mPEG-COOH的DMSO溶液的浓度为8.55mg/mL，EDC的DMSO溶液的浓度为17.2mg/mL，mPEG-COOH与EDC的体积比为2∶1。

4.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中EDC、mPEG-COOH和树状大分子摩尔比为20-300∶5-20∶1。

5.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中氯金酸溶液的溶剂为DMSO和水，其中DMSO和水的体积比为1-3∶1。

6.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中HAuCl₄·4H₂O和树状大分子的摩尔比为50-250∶1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为2-5∶1。

7.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中Gd(NO₃)₃·6H₂O和DOTA的摩尔比为1-5∶1；N(C₂H₅)₃、Ac₂O和树状大分子的摩尔比为120-660∶100-550∶1。

8.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的硼氢化钠溶液的溶剂为水和甲醇，其中水与甲醇的体积比为2∶1。

9.根据权利要求1所述的一种基于树状大分子的CT/MRI双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的透析为用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天。

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