CN108478815A - 一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法 - Google Patents

一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，包括：(1)在氨基末端的树状大分子上通过酰胺键修饰吡啶基团并作乙酰化处理得到乙酰化树状大分子‑吡啶复合物G5.NHAc‑Pyr；(2)二价铜离子与(1)中乙酰化树状大分子‑吡啶复合物G5.NHAc‑Pyr直接络合形成杂化纳米材料G5.NHAc‑Pyr/Cu。本发明制备得到的吡啶修饰的树状大分子铜络合物的杂化纳米材料，具有良好的水溶性、胶体稳定性，在对肿瘤细胞具有抑制性的同时可以有一定的r1弛豫率，可用于老鼠肿瘤的化疗和MR成像，具有诊疗一体化效应。

Description

一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备 方法
技术领域
本发明属于功能性杂化纳米材料的制备领域，特别涉及一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法。
背景技术
树状大分子(dendrimer)以其分子结构的高度分散性，可精准控制的三维结构和表面化学，可以用作纳米载体或支架，为多种抗肿瘤药物的传递及生物活性化合物的设计提供了可能。随着纳米技术和纳米医学的不断发展，树状大分子纳米材料在生物医学领域的各个方面，特别是药物传递、分子影像和肿瘤诊疗领域，表现出极大的应用潜力。已有文献报道通过负载钆离子的功能化聚酰胺胺型树状大分子/阿霉素络合物用于癌细胞的靶向MR成像和化疗(Zhu et al.,RSC Advances,2015,5,30286-30296)以及聚酰胺胺型树状大分子标记131I用于SPECT成像和放疗一体化研究(Zhu et al.,Nanoscale,2015,7,18169-18178)。通过功能化树状大分子和金属颗粒复合或者金属离子络合形成的杂化纳米材料不仅表现出功能化树状大分子的特性，同时也表现出金属复合物或络合物特有的性质，在诊疗一体化纳米材料方面有着广泛的用途。
自顺铂发现以来，新型金属抗肿瘤药物有了广泛的研究。除了常见的用于化疗的Pt(Ⅱ)和Pt(Ⅳ)类化合物，基于一些其它金属的抗癌药物也倍受关注，如铁、钴、锰、铜等。目前已有报道使用第0代树状大分子(PAMAM G0)为母体，通过化学修饰构建席夫碱树状大分子结构，从而络合铜离子(Zhao et al.,J.Inorg.Biochem.,2010,104,105-110)。该六核铜(Ⅱ)金属树状大分子对白血病MOLT-4细胞系和乳腺癌MCF-7细胞系展现出很好的体外细胞毒性。但此工作仅停留在细胞层面，没有验证动物体内的抗肿瘤活性。
另有文章报道，单次低剂量(5Gy)的放射治疗可以诱发瞬时、动态、局部的肿瘤微血管的“爆裂”，从而增加血管的渗透性，使血管外的纳米粒子更容易进入到肿瘤内(Milleret al.Sci.Transl.Med.,2017,9)。
检索国内外文献尚没有发现关于利用功能化树状大分子络合铜离子用于放疗加强的诊疗一体化的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，该方法制备得到的吡啶修饰的树状大分子铜络合物的杂化纳米材料，具有良好的水溶性、胶体稳定性，在对肿瘤细胞具有抑制性的同时可以有一定的r1弛豫率，可用于老鼠肿瘤的化疗和MR成像，具有诊疗一体化效应。
本发明提供了一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，包括：
(1)取2-吡啶甲酸Pyr溶于超纯水中，得到Pyr水溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化；然后将溶液逐滴加入到端基为氨基的第5代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2水溶液中，室温搅拌24-30小时，经透析纯化和冷冻干燥得到吡啶修饰的树状大分子G5.NH2-Pyr；其中，G5.NH2、Pyr和EDC的摩尔比为1:50:100～1:50:250；
(2)将G5.NH2-Pyr溶于超纯水中，加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌24-30小时，经透析纯化和冷冻干燥得到乙酰化树状大分子-吡啶复合物G5.NHAc-Pyr；其中，G5.NH2-Pyr、醋酸酐与三乙胺的摩尔比为1:100:100～1:100:120；
(3)将G5.NHAc-Pyr溶于生理盐水中，加入氯化铜，超声分散，得到吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料G5.NHAc-Pyr/Cu；其中，G5.NHAc-Pyr与氯化铜的摩尔比为1:40-60。
所述步骤(1)中的Pyr水溶液的浓度为5mg/mL；G5.NH2水溶液的浓度为20mg/mL。
所述步骤(1)中的EDC活化时间为0.5～1h；Pyr和EDC的摩尔比例为1:2-5。
所述步骤(2)中的G5.NH2-Pyr水溶液的浓度为20mg/mL。
所述步骤(1)和(2)中的透析纯化具体为：采用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。
所述步骤(3)中的超声分散时间为2～4min。
本发明的杂化纳米材料具有诊疗一体化性能，可用于放疗加强的肿瘤核磁共振成像(MRI)和化疗的应用，包括：
(1)利用杂化纳米材料(G5.NHAc-Pyr/Cu)通过尾静脉注射用于荷瘤鼠模型的放疗加强的肿瘤MR成像；
(2)利用杂化纳米材料(G5.NHAc-Pyr/Cu)通过尾静脉注射用于体外抗肿瘤研究及体内荷瘤鼠模型的放疗加强的肿瘤化疗。
本发明利用氨基末端的第五代树状大分子通过酰胺键修饰吡啶并作乙酰化处理，得到化学结构更加稳定的乙酰化树状大分子-吡啶复合物，从而络合铜离子构建杂化纳米材料用于化疗研究。在此基础上，作为过渡金属，铜(Ⅱ)离子具有孤对电子，其电子顺磁共振(EPR)信号已有文献报道(Ottaviani et al.,J.Phys.Chem.B,2013,117,14163-14172)。本发明利用络合金属铜(Ⅱ)离子的杂化纳米材料应用于核磁共振成像，取得不错的成像效果。通过对纳米材料的理性设计和精准合成，将目前临床上诊断和治疗两个分离的过程/功能集成于一个纳米材料中，利用乙酰化树状大分子-吡啶复合物络合铜离子构建了具有肿瘤MR成像及化疗效果的诊疗一体化杂化纳米材料。
本发明以荷瘤小鼠作为模型，结合低剂量放疗，研究杂化纳米材料的小鼠体内诊疗一体化性能的变化。结果发现在放疗后杂化纳米材料的MR成像效果有明显增强，并且联合放疗使络合物的肿瘤抑制效果得到了显著的提高。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)等手段表征制备的杂化纳米材料(G5.NHAc-Pyr/Cu)。然后利用CCK-8法评价杂化纳米材料(G5.NHAc-Pyr/Cu)及相关对比材料的细胞毒性，并对比铜及铜的络合物及其在不同肿瘤细胞的IC50数值。分析并对比铜离子及相关铜的络合物诱导4T1细胞凋亡情况，同时测定其体外成像性能。最后进行白鼠体内肿瘤模型的放疗加强的肿瘤核磁共振成像(MRI)和放疗加强的化疗实验，考察所制备的杂化纳米材料(G5.NHAc-Pyr/Cu)的体内MR成像及治疗效果。
有益效果
(1)本发明方法简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源商品化；
(2)本发明制备得到的吡啶修饰的树状大分子铜络合物的杂化纳米材料，具有良好的水溶性、胶体稳定性，在对肿瘤细胞具有抑制性的同时可以有一定的r1弛豫率，可用于老鼠肿瘤的化疗和MR成像，具有诊疗一体化效应；
(3)本发明利用放疗促进了诊疗一体化效果，在动物层面利用放疗增强了杂化纳米材料的MR成像效果；利用放疗增强了杂化纳米材料的肿瘤抑制效果，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明制备杂化纳米材料G5.NHAc-Pyr/Cu的工艺示意图；
图2为实施例1制备的G5-Pyr的核磁共振氢谱图(a)；实施例1制备的G5.NHAc-Pyr的核磁共振氢谱图(b)；对比例1制备的G5.NHAc的核磁共振氢谱图(c)；
图3为对比例1制备的G5.NHAc与不同比例的铜离子滴定的UV-Vis图(A)以及吸光度分析图(B)；实施例1制备的G5.NHAc-Pyr与不同比例的铜离子滴定的UV-Vis图(C)以及吸光度分析图(D)；
图4为实施例1和对比例1制备的纳米材料的UV-Vis对比图(A)、实物照片(B,1为水溶液，2为吡啶的水溶液，3为氯化铜的水溶液，4为吡啶-铜的水溶液，5为G5.NHAc-Pyr/Cu的水溶液)、表面电势对比图(C)和水动力学直径对比图(D)；
图5为经不同纳米材料处理24小时后的KB细胞存活率折线分析图(A)；铜及铜的络合物处理24小时后的不同肿瘤细胞的IC50数值(B)；
图6为经不同浓度的氯化铜及铜的络合物处理24小时后的4T1细胞流式检测分析图；
图7为经不同浓度的铜及铜的络合物处理后，正常细胞、早凋细胞和晚凋细胞百分比数据图；
图8为铜及铜的络合物的T1弛豫时间的倒数随Cu度变化的线性关系图；
图9为实施例6中将实施例1制备的G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(A)；在老鼠放疗后将实施例1制备的G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(B)；
图10为实施例6中将对比例1制备的Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(A)；将对比例1制备的Pyr/Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(B)；
图11为实施例6中将实施例1及对比例1制备的铜及铜的络合物的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠相应的肿瘤部位信噪比变化；图(A)为图9中小鼠肿瘤的信噪比数值对比，图(B)为图10中小鼠肿瘤的信噪比数值对比；
图12为实施例7中尾静脉注射实施例1制备的G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)体内抗肿瘤效果；(A)为放疗-治疗组老鼠经放疗及治疗处理的过程示意图，经22天治疗后小鼠相对肿瘤体积变化图(B)及体重变化图(C)；以及小鼠经22天治疗后处死取出的肿瘤重量柱状图(D)和实物照片(E)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取2-吡啶甲酸(23.66mg)溶于5mL超纯水中，加入EDC(73.70mg)活化0.5h，然后逐滴加入到5mL溶有端基为氨基的第5代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2(100mg)的超纯水溶液(20mg/mL)中，室温搅拌24小时，然后使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到吡啶修饰的树状大分子G5.NH2-Pyr。
(2)将G5.NH2-Pyr(112.12mg)溶于5mL超纯水中，加入三乙胺(38.90mg)混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液(39.25mg)，室温搅拌24小时，然后使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到乙酰化树状大分子-吡啶复合物G5.NHAc-Pyr；
(3)将G5.NHAc-Pyr(125.04mg)溶于生理盐水中，加入氯化铜固体(25.84mg)并超声分散，得到吡啶修饰的树状大分子铜络合物G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液。图1为制备杂化纳米材料G5.NHAc-Pyr/Cu的工艺示意图。
对比例1
对照材料乙酰化后的树状大分子(G5.NHAc)的制备方法为：取100mg树状大分子分散于5mL超纯水中，加入三乙胺(38.90mg)混合均匀，再向反应液中滴入醋酸酐溶液(39.25mg)，室温搅拌24小时，然后使用截留分子量5000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后冷冻干燥得到乙酰化树状大分子G5.NHAc。
将G5.NHAc(117.43mg)溶于生理盐水中，加入氯化铜固体(25.84mg)并超声分散，得到乙酰化树状大分子铜络合物G5.NHAc/Cu的生理盐水溶液。
对照材料Pyr/Cu的制备方法为：取10mg 2-吡啶甲酸(Pyr)溶于生理盐水中，加入氯化铜固体(10.9mg)并超声分散，得到吡啶铜络合物的生理盐水溶液。
对照材料Cu的制备方法为：取氯化铜(CuCl2)溶于生理盐水中，超声分散，得到铜的生理盐水溶液。
实施例2
取实施例1制备的G5.NH2-Pyr和G5.NHAc-Pyr和对比例1制备的G5.NHAc溶于氘代水中，使用Bruker400MHz核磁共振仪进行氢谱测试。由图2a可知，在G5.NH2-Pyr的核磁共振氢谱图中，7.5、8和8.5ppm是吡啶环上的特征质子峰，2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH2的亚甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个G5.NH2上链接了29.7个Pyr分子(其投料摩尔比为G5.NH2:Pyr＝1:50)。制备的G5.NH2-Pyr经过乙酰化反应之后，在1.9ppm之间出现乙酰基的甲基质子峰(图2b)，表明树状大分子G5.NH2表面剩余氨基已被乙酰化，根据它们积分面积之比，计算出经乙酰化后每个G5.NH2-Pyr上有80个乙酰基。由图2c可知，2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH2的亚甲基质子峰，1.9ppm是乙酰基的甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出经乙酰化后每个G5.NH2上有108个乙酰基。
通过测定实施例1制备的G5.NHAc-Pyr和对比例1制备的G5.NHAc的铜离子滴定UV-Vis图谱(图3)，图3A为铜离子与乙酰化树状大分子在不同摩尔比例下(0：1，10：1，20：1，30：1，40：1，50：1，60：1，70：1，80：1，90：1，100：1)的紫外-可见光光谱图。同时对其最大吸收峰602nm处的吸光度与铜离子与乙酰化树状大分子的比例进行非线性拟合(图3B)，得到每摩尔乙酰化树状大分子可以络合50～60摩尔铜离子。图3C为铜离子与吡啶修饰的乙酰化树状大分子在不同摩尔比例下(0：1，5：1，10：1，15：1，20：1，25：1，30：1，35：1，40：1，50：1，60：1，70：1，80：1，90：1，100：1)的紫外-可见光光谱图。同时对其620nm处的吸光度与铜离子与吡啶修饰的乙酰化树状大分子的比例进行非线性拟合(图3D)，可以观察到铜离子络合状态的改变，得到每摩尔吡啶修饰的树状大分子最多可以络合60摩尔铜离子。最终以铜离子与吡啶修饰的乙酰化树状大分子在50：1的摩尔比例下进行后续实验。
通过测定CuCl2、Pyr、Pyr/Cu、G5.NHAc/Cu和G5.NHAc-Pyr/Cu的UV-Vis图谱(图4A)，结果表明氯化铜水溶液的最大吸收峰在814nm处；吡啶的铜络合物Pyr/Cu水溶液的最大吸收峰在780nm处，乙酰化树状大分子铜络合物G5.NHAc/Cu的最大吸收峰出现在602nm处，吡啶修饰的树状大分子铜络合物G5.NHAc-Pyr/Cu的最大吸收峰红移至620nm处，表明由于吡啶的修饰造成铜络合物周围环境的变化，从而影响了其吸收峰的位置。同时，络合物UV-Vis图谱中铜离子的吸收峰消失标志着溶液中不存在游离的铜离子，G5.NHAc-Pyr与50摩尔当量的铜离子络合后，铜离子完全处于络合状态。如图4B所示，瓶中依次为同等浓度下水、吡啶溶液、铜离子溶液和铜络合物溶液(Pyr/Cu和G5.NHAc-Pyr/Cu)的实物照片。
将相应材料的水溶液用于测表面电势和水动力直径。Zeta电势测定结果(图4C)表明G5.NH2的表面电势为+41.4mV，修饰吡啶后表面电势有所下降，为+30.2mV，进一步乙酰化后表面电势降为+7.63mV，络合铜离子后表面电势为+8.48mV，与G5.NHAc/Cu的电势(+8.45mV)相比，没有明显的区别。如图4D所示，修饰吡啶后G5.NHAc-Pyr的水动力学直径为较G5.NHAc相比有所增加，从133.1nm增加至165.9nm，络合铜离子后呈现出下降趋势(153.2nm)，无吡啶修饰的乙酰化树状大分子与铜络合后也显示出同样的趋势，从133.1nm下降至68.66nm。
实施例3
收集对数生长期KB细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育过夜。弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料浓度为0.01、0.1、1、2、5、10mM)或生理盐水(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养3h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图5A所示。与生理盐水对照组相比，G5.NHAc在试验浓度范围内对KB细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在95％以上，说明G5.NHAc本身不具有肿瘤细胞抑制性。与G5.NHAc组相比，G5.NHAc-Pyr在试验浓度范围内对KB细胞具有一定的细胞毒性，浓度为10mM时细胞存活率为72.09％，络合铜离子后，G5.NHAc-Pyr/Cu各浓度的细胞存活率较G5.NHAc-Pyr相比有了明显的下降，说明铜离子的存在有助于增强材料的肿瘤细胞抑制性。同时，对比G5.NHAc-Pyr/Cu、G5.NHAc/Cu和Cu的细胞存活率发现，都存在铜离子的情况下，G5.NHAc与铜离子络合后提高了细胞的存活率而G5.NHAc-Pyr与铜离子络合后降低了细胞的存活率，说明吡啶的修饰有助于增强材料肿瘤细胞抑制性。同时，选择铜及铜的络合物Pyr/Cu、G5.NHAc-Pyr/Cu通过CCK-8法测试并计算IC50进一步验证其对其他肿瘤细胞(A549、C6和4T1)的细胞抑制性。结果如图5B所示，与细胞共培养24小时后，铜及铜的络合物Pyr/Cu、G5.NHAc-Pyr/Cu(以Cu离子浓度为统一标准)对4TI细胞表现出了统一且最为明显的抑制性，在后面的实验中选择4T1作为模型细胞做进一步研究。
实施例4
将每孔2×105 4T1细胞种植于12孔板中，培养过夜后倒掉培养基，加入含有不同浓度的铜及铜的络合物Pyr/Cu、G5.NHAc-Pyr/Cu的培养基共培养24小时。之后倒掉培养基，经PBS洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转移到5ml离心管中，1000转离心5分钟去除上清液，加PBS 1ml吹匀，放入冰盒，经Annexin V/PI凋亡检测试剂盒染色后用300目(孔径40～50微米)尼龙网过滤，上机检测。图6显示经不同浓度的铜及铜的络合物处理后，细胞出现了凋亡现象。图7为经不同浓度的铜及铜的络合物处理后，正常细胞、早调细胞和晚凋细胞百分比。在实验同等浓度下，经G5.NHAc-Pyr/Cu处理过4T1细胞比经Cu和Pyr/Cu处理过的4T1细胞表现出更明显的凋亡现象。
实施例5
分别配制Cu浓度为0.05，0.1，0.2，0.3和0.4mM的铜及铜的络合物Pyr/Cu、G5.NHAc-Pyr/Cu的水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Cu浓度下的T1弛豫效应(如图8)。通过计算得出Cu、Pyr/Cu和G5.NHAc-Pyr/Cu的r1值分别为0.74，0.36，和0.70mM-1s-1。铜离子和G5.NHAc-Pyr络合后仍然保持相似的r1值，而铜离子和Pyr络合后r1值下降为原来的一半，说明G5.NHAc-Pyr/Cu可以作为MR分子影像诊断中的T1阳性造影剂。
实施例6
在白鼠体内构建4T1皮下瘤模型，通过尾静脉注射氯化铜、对比例1制备的铜的络合物Pyr/Cu以及实施例1制备的G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液(100μL，[Cu]＝8mM)来评价肿瘤部位MR成像效果。如图9A所示，与注射前的空白组相比较，在注射10min后，小鼠肿瘤部位的MR信号逐渐增强；如图9B所示，对荷瘤鼠放疗处理后三天后，通过尾静脉注射纳米杂化材料G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液，在MR成像结果中可以观察到比未放疗实验组更明显的MR信号。此外，注射Cu和Pyr/Cu的生理盐水溶液后后小鼠肿瘤部位的MR信号也呈现出增强趋势(图10)，说明铜及铜的络合物可以随着血液流通在肿瘤部位富集并显示出MR信号，MR信号值定量分析结果如图11B所示。但铜及小分子铜络合物在小鼠肿瘤部位的MR信号的维持时间均少于1小时，而高分子铜络合物维持时间高达两个小时以上，在实际应用中具有更高的使用价值。同时MR信号值定量分析结果(图11A)显示，注射G5.NHAc-Pyr/Cu 90min后肿瘤部位信噪比SNR达到最大值，放疗并注射G5.NHAc-Pyr/Cu70min后肿瘤部位信噪比SNR达到最大值，并且在实验各个时间点放疗组都比未放疗组肿瘤部位信噪比SNR数值高，这可能是因为低剂量放疗导致肿瘤部位血管渗透性增强，更多的纳米材料聚集在肿瘤部位，从而产生更强的MR成像效果；以上结果说明G5.NHAc-Pyr/Cu可以作为T1造影剂应用于放疗增强的体内肿瘤MR成像诊断。
实施例7
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周的雌性BALB/cAnSlac小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。按照3×106 4T1细胞/鼠的剂量在白鼠右腿部注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到0.5-1.2cm3(大约在注射肿瘤细胞两周后)时随机将成瘤白鼠分为4组(对照组、放疗组、治疗组和放疗-治疗组)，每组白鼠数量为8只，此时记作实验开始的第0天。在第1天对放疗组和放疗-治疗组经行放疗。三天后将100μL生理盐水(NS)、G5.NHAc-Pyr/Cu的生理盐水溶液(Cu的最终浓度为8mM)通过尾静脉注射到各组白鼠体内，记为第一次给药。间隔3天给药一次，总共给药4次。肿瘤体积每3天测量一次，小鼠重量每3天称一次。肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
在给药治疗22天后，每组选出五只代表性的小鼠，将其处死取其主要器官和肿瘤，对各组实验组肿瘤进行拍照并称重。图12A显示放疗-治疗组老鼠经放疗及治疗处理的过程。图12B说明，本发明制备的经放疗促进的G5.NHAc-Pyr/Cu组(放疗-治疗组)小鼠相对肿瘤体积变化最小，仅注射G5.NHAc-Pyr/Cu组(治疗组)小鼠次之，仅放疗组再次之，生理盐水组小鼠相对肿瘤体积增长最大。图12C说明每组小鼠在经过22天的治疗后期重量无明显变化。肿瘤重量统计发现，生理盐水组的肿瘤重量最大，放疗组次之，G5.NHAc-Pyr/Cu组(治疗组)再次之，经放疗促进的G5.NHAc-Pyr/Cu组(放疗-治疗组)小鼠肿瘤重量最小(图12D和12E)。综上所述，本发明制备的杂化纳米材料G5.NHAc-Pyr/Cu具有良好的放疗促进的体内抗肿瘤活性。

Claims (6)

1.一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，包括：
(1)取2-吡啶甲酸Pyr溶于超纯水中，得到Pyr水溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化；然后将溶液逐滴加入到端基为氨基的第5代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2水溶液中，室温搅拌24-30小时，经透析纯化和冷冻干燥得到吡啶修饰的树状大分子G5.NH2-Pyr；其中，G5.NH2、Pyr和EDC的摩尔比为1:50:100～1:50:250；
(2)将G5.NH2-Pyr溶于超纯水中，加入三乙胺混合均匀，逐滴加入醋酸酐溶液，室温搅拌24-30小时，经透析纯化和冷冻干燥得到乙酰化树状大分子-吡啶复合物G5.NHAc-Pyr；其中，G5.NH2-Pyr、醋酸酐与三乙胺的摩尔比为1:100:100～1:100:120；
(3)将G5.NHAc-Pyr溶于生理盐水中，加入氯化铜，超声分散，得到吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料G5.NHAc-Pyr/Cu；其中，G5.NHAc-Pyr与氯化铜的摩尔比为1:40-60。
2.根据权利要求1所述的一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的Pyr水溶液的浓度为5mg/mL；G5.NH2水溶液的浓度为20mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的EDC活化时间为0.5～1h；Pyr和EDC的摩尔比例为1:2-5。
4.根据权利要求1所述的一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的G5.NH2-Pyr水溶液的浓度为20mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的透析纯化具体为：采用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水中透析3天。
6.根据权利要求1所述的一种吡啶修饰的树状大分子铜络合物杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的超声分散时间为2～4min。
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