CN107802844A - 一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法 - Google Patents
一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，包括：将AG溶于超纯水中，加入EDC和NHS活化；然后逐滴加入到溶有AOT的DCM溶液中，搅拌，得到W/O乳液；然后逐滴加入到PVA的超纯水溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液；将PEI‑Au‑Gd NPs的水溶液加入到上述W/O/W聚合物乳液中，搅拌过夜，继续反应，分离纯化，得到AG/PEI‑Au‑Gd NGs。本发明易于操作分离，原料来源广泛，成本低廉；制得的AG/PEI‑Au‑Gd NGs粒径分布均匀，X射线衰减性能较好，并能显著提高r1弛豫率，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性，对生物体无不良影响。
Description
技术领域
本发明属于纳米造影剂技术领域，特别涉及一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法。
背景技术
计算机断层扫描(CT)成像技术由于其低廉的价格，较高的空间分辨率，较短的图像采集时间，并能提供高分辨的3D断层信息，使其成为临床上疾病诊断最为常见的一种工具，但是CT成像技术也存在一些亟需解决的问题，如软组织分辨率差、检测过程中存在较高的放射性辐射、传统含碘小分子CT造影剂高浓度使用时存在肾脏毒性等。磁共振(MR)成像技术是随着集成电路技术、超导体技术的发展而迅速发展起来的一种分子成像手段，具有较高的软组织分辨率和灵敏度，同时无电离辐射损伤，对人体友好。但是MR成像技术敏感性低、扫描时间长、空间分辨率低、测试费用昂贵，且临床上使用的钆剂也存在一定的肾脏毒性。发展一种新型的、多功能的CT/MR双模态成像造影剂，可以结合CT和MR两种成像技术的各自的优点从而提高疾病诊断的准确度，同时可以克服传统医用CT或MR成像造影剂的缺陷，如成像时间短，较高浓度存在肾脏毒性等。这对于疾病的诊断尤其是癌症的早期诊断具有重大意义，它一方面减少造影剂对患者的毒副作用，另一方面可以提供更加全面而清晰的诊断信息。
近年来随着纳米科学和纳米技术的快速发展，越来越多的纳米载体，例如胶束、纳米凝胶和树状大分子等，已经被广泛地运用于构建不同的成像造影剂。其中纳米凝胶(NGs)这类载体在生物医学领域的各个方面，特别是药物传递、肿瘤诊断和组织工程领域，表现出极大的应用潜力。纳米凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网状结构的水凝胶颗粒，它是一种纳米尺度的软体材料。纳米凝胶具有许多优良的特性，如良好的胶体稳定性、生物相容性、高负载能力、易于多功能化、易进入肿瘤组织等，促进了其在诸多领域尤其是在分子影像学的应用。同时有文献报道表明，以纳米凝胶作为载体负载MR成像造影元素，可显著提高r1或r2弛豫率(J.Mater.Res.2014,29(15),1626-1634；Biomater.Sci.2016,4(10),1422-1430)。此外，借助于纳米凝胶形成的团簇结构可能会产生协同效应增强材料的X射线衰减能力(Adv.Healthcare Mater.2014,3(10),1680-1687)。
海藻酸钠(Alginate,AG)是一种天然多糖类物质，具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时价廉易得，广泛用于合成纳米凝胶。它是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，是由-D-甘露糖醛酸和-L-古洛糖醛酸以1,4-糖苷键连接而成的线性聚合物，每个糖醛酸单元上含有一个羧基。海藻酸钠的分子式为(C6H7O6Na)n，相对分子量为2000-200000。海藻酸钠具有无毒，良好的水溶性、生物相容性和生物降解性等优点，已广泛用于生物医学领域。
检索国内外文献尚没有发现关于利用海藻酸钠纳米凝胶负载双造影元素金纳米颗粒和钆离子用于CT/MR双模态成像的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，该方法易于操作分离，成本低廉，原料来源广泛、生物可降解，具有良好的发展前景。
本发明的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将海藻酸钠AG溶于超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化；然后逐滴加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌，得到W/O乳液；然后逐滴加入到聚乙烯醇PVA的超纯水溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液；其中AG、EDC和NHS的摩尔比为1:2:2～1:5:5；
(2)将聚乙二醇化的聚乙烯亚胺修饰的金钆复合纳米颗粒PEI-Au-Gd NPs的水溶液作为交联剂加入到步骤(1)得到的W/O/W聚合物乳液中，搅拌过夜，继续反应，分离纯化，得到负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Au-Gd NGs；其中PEI-Au-Gd NPs与步骤(1)中AG的质量比为0.5:1～4:1。
所述步骤(1)中的AG水溶液的浓度为1～3wt％。
所述步骤(1)中的AOT的DCM溶液的浓度为30～35mg/mL。
所述步骤(1)中的PVA水溶液的浓度为15～25mg/mL。
所述步骤(1)中的AG水溶液、AOT溶液和PVA溶液的体积比为1:1:10～1:2:15。
所述步骤(1)中活化的时间为2～3h。
所述步骤(1)中搅拌、继续搅拌的时间均为30～45min。
所述步骤(1)和(2)中的搅拌的转速为900～1100rpm。
所述步骤(2)中的PEI-Au-Gd NPs是通过将金属螯合剂二乙烯基三胺基五乙酸二酐DTPA与六水硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O的水溶液混合搅拌1～2d，得到DTPA-Gd复合物；将马来酰亚胺聚乙二醇单甲醚mPEG-MAL与聚乙烯亚胺PEI分别溶解在超纯水中混合搅拌1～2d，用蒸馏水透析3d，冷冻干燥，得到mPEG-PEI·NH2粉末；将mPEG-PEI·NH2分散于超纯水中，加入四水氯金酸HAuCl4·4H2O水溶液，搅拌0.5h；然后加入NaBH4的冰水溶液作为还原剂，继续搅拌3h，加入DTPA-Gd复合物水溶液，继续搅拌1d，最后用蒸馏水透析3d，冷冻干燥制得；其中PEI、mPEG-MAL、HAuCl4·4H2O、NaBH4、DTPA、Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:30:200:1000:10:10。
所述步骤(2)中PEI-Au-Gd NPs的水溶液的浓度为8～12mg/mL。
所述步骤(2)中反应的时间为22～26h。
所述步骤(2)中分离纯化的工艺条件为：先使用截留分子量100000的透析袋对反应液透析1～2d，然后13000rpm，15min离心水洗2～3次。
所述步骤(2)得到的AG/PEI-Au-Gd NGs用作增强的磁共振成像和计算机断层扫描成像的造影剂。
本发明通过金属螯合剂DTPA螯合三价钆离子得到DTPA-Gd复合物；以NaBH4为还原剂，采用一步还原法合成mPEG化PEI稳定的Au纳米颗粒mPEG-PEI·NH2-(Au0)200，与DTPA-Gd复合物反应得到PEI-Au-Gd纳米颗粒；AG的水溶液经EDC/NHS活化、双乳化处理后得到W/O/W乳液；然后以PEI-Au-Gd纳米颗粒作为交联剂加入到W/O/W乳液中，通过化学交联反应制得负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶。
有益效果
(1)本发明的方法简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源广泛、价廉、生物可降解，具有良好的发展前景。
(2)本发明制备得到的负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Au-GdNGs粒径较小，分布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性，对生物体无不良影响，与临床MR造影剂和临床CT造影剂相比，体现出较高的r1弛豫率高和较好的X射线衰减性能，在MR/CT成像领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs在不同储存时间的水动力学直径变化图。
图2为实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs及AG/PEI-Au-Gd NGs的UV-Vis图。
图3为实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs及AG/PEI-Au-Gd NGs的TGA分析曲线。
图4为实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs、AG/PEI-Au-Gd NGs及AG的FTIR图谱。
图5为实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs(a)及AG/PEI-Au-Gd NGs(b,c)的TEM图。
图6为实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs(1)、PEI-Au-Gd NPs(2)及临床钆剂马根维显(3)的T1成像图(a)和T1弛豫时间的倒数随Gd浓度变化的线性关系图(b)；AG/PEI-Au-GdNGs(1)、PEI-Au-Gd NPs(2)及临床用欧乃派克(3)的CT成像图(c)和X射线衰减与Au或I的浓度的线性关系图(d)。
图7为实施例4中HeLa细胞经实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs(Au浓度为20、40、60、80和100μM)和纯PBS处理24h后的CCK-8细胞活力分析结果图。
图8为实施例4中HeLa细胞经过PBS缓冲液(空白对照，a)和实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs(Au浓度为b:20、c:40、d:60、e:80和f:100μM)处理24小时后的细胞形态。
图9为实施例5中经过PBS缓冲液、对照材料PEI.Ac-Au-Gd NPs和实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs(Au浓度为50μM和100μM)处理4h后HeLa细胞的Au含量(**p<0.01)。
图10为实施例6中HeLa细胞经过PBS缓冲液、和实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs(Au浓度为50μM和100μM)处理4h后的细胞T1MR成像图片(a)，相应的MR信号强度变化(b)，细胞CT成像图片(c)及对应的细胞CT信号值随Au浓度变化的关系图(d)。
图11为实施例7中将实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs的PBS溶液(100μL，[Au]＝20mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(a)，相应的肿瘤部位信噪比变化(b)，小鼠肿瘤的CT成像图(c)及相应的肿瘤部位CT信号值变化(d)。
图12为实施例8中尾静脉注射实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs的PBS溶液(100μL，[Au]＝20mM)后不同时间点，Au元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的组织分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取2mL浓度为1wt％AG(20mg)水溶液，先用35.48mg EDC和21.3mg NHS活化3h，然后逐滴加入到4mL AOT的DCM溶液(34mg/mL)中，搅拌30min，形成W/O乳液，然后将该W/O乳液逐滴加入到30mL浓度为2wt％PVA水溶液(20mg/mL)中，搅拌30min，得到W/O/W聚合物乳液。
(2)将DTPA(0.02mmol)与等摩尔量的Gd(NO3)3·6H2O(0.02mmol)混合分散于10mL超纯水中，搅拌反应24h，得到DTPA-Gd复合物；将mPEG-MAL(0.06mmol)分散于10mL超纯水中，然后逐滴加入到20mL含PEI(0.002mmol)的水溶液中，搅拌反应24h，蒸馏水透析3d，冷冻干燥得到mPEG-PEI·NH2粉末；将mPEG-PEI·NH2粉末分散于超纯水中(1mg/mL)，加入HAuCl4·4H2O(0.4mmol)水溶液，搅拌0.5h，然后向其中加入NaBH4(2mmol)的冰水溶液作为还原剂，继续搅拌3h，之后加入上述得到的DTPA-Gd复合物水溶液，继续搅拌1d，最后用蒸馏水透析3d，冷冻干燥后得到PEI-Au-Gd NPs粉末。
(3)取步骤(2)得到的PEI-Au-Gd NPs(10mg/mL)的水溶液2mL作为交联剂加入到步骤(1)得到的W/O/W聚合物乳液中，搅拌过夜，继续敞口反应24h，蒸发除去有机溶剂，然后使用截留分子量100000的透析袋对反应溶液透析2天(2L/次，3次/天)，最后13000 rpm，15min离心水洗3次，得到负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Au-Gd NGs。
实施例2
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、热重分析(TGA)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、磁共振(MR)成像分析及X射线衰减性能评价等手段表征本发明中制备的负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Au-Gd NGs。然后利用CCK-8法评价纳米凝胶的细胞毒性，用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌，并评价其在肿瘤细胞的吞噬情况。最后进行体外细胞、裸鼠体内肿瘤模型的MR/CT成像实验，考察AG/PEI-Au-Gd NGs的体外、体内MR/CT成像效果。此外，通过组织分布实验研究AG/PEI-Au-Gd NGs在生物体内的代谢情况。
Zeta电势及动态光散射分析测试：
采用ICP-AES测试法测定实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs中Au元素的含量。取实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs的水溶液(Au的浓度为0.1mM)，用于测表面电势和水动力直径，结果如表1所示，可知PEI-Au-Gd NPs的表面电势为+18.8mV，水动力学直径为90.2nm，而AG/PEI-Au-Gd NGs呈现出翻转的表面电势-16.3mV和增大的水动力学直径167.7nm，证明了AG和PEI-Au-Gd NPs的成功交联。对实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs的水溶液在不同储存时间的水动力学直径变化进行测试，测试结果如图1所示，可知AG/PEI-Au-Gd NGs的水动力直径能长时间保持几乎不变，从而说明AG/PEI-Au-Gd NGs具有良好的胶体稳定性。
表1样品表面电势、水动力学直径及多分散性指数的测定结果
| 样品 | 表面电势(mV) | 水动力学直径(nm) | 多分散性指数(PDI) |
| PEI-Au-Gd NPs | 18.8±1.0 | 90.2±2.9 | 0.3±0.3 |
| AG/PEI-Au-Gd NGs | -16.3±0.5 | 167.7±5.0 | 0.1±0.1 |
紫外可见吸收光谱测试：
对实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs进行UV-Vis图谱测试，结果如图2所示，结果表明PEI-Au-Gd NPs的吸收峰出现在515nm处，AG/PEI-Au-Gd NGs的吸收峰红移至520nm处，表明由于纳米凝胶的形成造成Au NPs周围环境的变化，从而影响了其吸收峰的位置。
热重分析测试：
对实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs进行TGA测试，结果如图3所示，表明AG/PEI-Au-Gd NGs纳米凝胶中AG的含量为19.34％。
傅里叶变换红外光谱测试：
对实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs以及AG进行FTIR测试，图谱变化结果如图4所示，其中谱线3中在1416cm-1和1614cm-1处吸收峰减弱或消失，以及1740cm-1处和1637cm-1出现的吸收峰，说明AG上羧基数量的减少和AG/PEI-Au-Gd NGs中酰胺键的存在，进一步说明PEI-Au-Gd NPs与AG成功地发生了化学交联反应。
透射电子显微镜测试：
通过TEM观察实施例1中制备PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs形貌，如图5所示，结果表明PEI-Au-Gd NPs呈球形，平均粒径为4.0nm，交联之后的AG/PEI-Au-Gd NGs呈近球形，可观察到明显的纳米颗粒团簇现象，尺寸较均匀，平均直径大小约为83.3nm，没有明显的团聚现象。
实施例3
磁共振成像分析及X射线衰减性能测试：
通过ICP-AES测试法测定实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs中Au和Gd元素的含量。分别配制Gd浓度为0.05，0.1，0.2，0.3和0.4mM的PEI-Au-Gd NPs、AG/PEI-Au-Gd NGs及临床钆剂马根维显的水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T1成像图，如图6(a)所示，T1弛豫时间的倒数随Gd浓度变化的线性关系结果如图6(b)所示，通过计算得出PEI-Au-Gd NPs、AG/PEI-Au-Gd NGs及临床钆剂马根维显的r1值分别为0.78，9.24，和4.56mM-1s-1。交联后r1增大11.8倍，并且高于临床钆剂马根维显的r1值，说明实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs可以作为MR分子影像诊断中的优良T1阳性造影剂。
分别配制Au浓度为5，10，15，20和30mM的PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs的水溶液2mL，通过CT成像分析仪测定材料在不同Au浓度下的CT成像性能，同时通过配制相同I浓度的临床用小分子碘剂欧乃派克的水溶液作为对比，CT成像图如图6(c)所示，X射线衰减与Au或I的浓度的线性关系结果如图6(d)所示，由于Au相对于I具有较高的原子序数，PEI-Au-Gd NPs和AG/PEI-Au-Gd NGs与欧乃派克相比均呈现出较好X射线衰减性能，同时也说明AG/PEI-Au-Gd NGs用于CT成像的优越性。
实施例4
细胞活力评价和相差显微镜测试：
收集对数生长期HeLa细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含不同浓度的AG/PEI-Au-Gd NGs(最终Au浓度为20、40、60、80、100μM)或纯PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含10μLCCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图7所示，与PBS对照组相比，AG/PEI-Au-Gd NGs在试验浓度范围内对HeLa细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在80％以上，说明AG/PEI-Au-Gd NGs具有良好的生物相容性。同时，通过相差显微镜观察法进一步验证了AG/PEI-Au-Gd NGs对细胞形貌的影响，结果如图8所示，不同浓度AG/PEI-Au-Gd NGs(最终Au浓度为20、40、60、80、100μM)与细胞共培养24小时后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说明了AG/PEI-Au-GdNGs具有良好的细胞相容性。
实施例5
细胞吞噬试验：
以乙酰化后的PEI-Au-Gd NPs(PEI.Ac-Au-Gd NPs)作为对照材料，制备方法为：取50mg实施例1中PEI-Au-Gd NPs粉末分散于10mL水中，然后向其中加入142.1μL三乙胺，混合搅拌30min后，再向反应液中滴入115.6μL乙酸酐，之后继续反应12h。反应结束后，以截留分子量8000-14000的透析袋用蒸馏水透析3d，然后冷冻干燥得到乙酰化后的PEI-Au-Gd NPs(PEI.Ac-Au-Gd NPs)。
配制不同浓度的实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs和对照材料PEI.Ac-Au-Gd NPs的PBS溶液，评价HeLa细胞对两种不同状态纳米材料的吞噬情况，以验证纳米凝胶相对于单个纳米颗粒更易被肿瘤细胞吞噬的特点。将HeLa细胞接种在6孔细胞培养板上(接种密度为每孔30万)，加2mL DMEM培养基，细胞培养板置于5％CO2和37℃的环境中培养12h。之后每孔更换1800μL DMEM培养基，并分别添加200μL不同浓度的AG/PEI-Au-Gd NGs和PEI.Ac-Au-GdNPs的PBS溶液(Au元素浓度为50和100μM)，共培养4h，以PBS培养作为空白对照组。PBS清洗细胞3遍之后，用王水(盐酸/硝酸；体积比3:1)消化，然后利用ICP-AES测量细胞吞噬的Au含量，结果如图9所示，相对于单个的PEI.Ac-Au-Gd NPs，经AG/PEI-Au-Gd NGs处理的细胞Au吞噬量呈现明显差异(**p<0.01)，表明AG/PEI-Au-Gd NGs易于被肿瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。
实施例6
体外细胞MR/CT成像测试：
在体内实验之前，进一步评价了实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs的细胞MR/CT成像效果。取HeLa细胞与实施例1制备的PEI-Au-Gd NPs(Au浓度为50μM和100μM)在5％CO2，37℃下共培养4h，并且以PBS处理的细胞作为空白组，在培养结束后细胞用PBS清洗5次，再用胰酶消化、离心、过滤，最后分散在0.2mL PBS(含0.5％琼脂糖)中，用核磁共振成像仪和CT成像仪测量各细胞样品的T1弛豫及CT成像效应，细胞T1MR成像图片如图10(a)所示，相应的MR信号强度变化结果如图10(b)所示；细胞CT成像图片如图10(c)所示，对应的细胞CT信号值随Au浓度变化的关系结果如图10(d)所示，可知随着Au浓度的增加，经AG/PEI-Au-Gd NGs处理后的细胞表现出MR信号及CT信号增强的趋势，说明实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs具有良好的细胞MR/CT成像性能。
实施例7
体内肿瘤MR/CT成像测试：
在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射实施例1制备的AG/PEI-Au-GdNGs的PBS溶液(100μL，[Au]＝20mM，[Gd]＝0.8mM)来评价肿瘤部位MR/CT双模态成像效果，经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图如图11(a)所示，相应的肿瘤部位信噪比变化结果如图11(b)所示，小鼠肿瘤的CT成像图如图11(c)所示，相应的肿瘤部位CT信号值变化结果如图11(d)所示。与注射前的空白组相比较，在注射后60min内，注射AG/PEI-Au-Gd NGs的小鼠肿瘤部位的MR和CT信号增强，然后逐渐开始恢复，说明纳米凝胶可以随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去。同时MR信号值定量分析结果显示，注射前肿瘤部位信噪比SNR为15.63，注射AG/PEI-Au-Gd NGs 60min后肿瘤部位信噪比SNR为35.82，ΔSNR为20.19；此外，注射后60min后，CT信号值从注射前26.5增加到44.7，到120min时与注射前相比仍保持一个较高的水平。说明实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs可以作为造影剂应用于增强的体内肿瘤MR/CT双模态成像诊断。
实施例8
体内组织分布测试：
以实施例7构建的HeLa肿瘤模型裸鼠来研究实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs在生物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs的PBS溶液(100μL，[Au]＝20mM)，分别在注射30、60、90和120min后，处死小鼠，取出各个主要器官和肿瘤部位并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-AES测定各个组织样品中Au的含量。Au元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的组织分布结果，如图12所示，在注射后，肺中Au的含量较高然后随时间增加逐渐降低，肝脏和脾脏中Au含量随时间增加逐渐升高。肿瘤部位Au含量在注射60min后达到最高，然后逐渐降低，与体内肿瘤MR/CT成像结果相对应。说明实施例1制备的AG/PEI-Au-Gd NGs能在小鼠体内正常的代谢清除。
Claims (10)
1.一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将海藻酸钠AG溶于超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化；然后逐滴加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯钠AOT的二氯甲烷DCM溶液中，搅拌，得到W/O乳液；然后逐滴加入到聚乙烯醇PVA的超纯水溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液；其中AG、EDC和NHS的摩尔比为1:2:2～1:5:5；
(2)将聚乙二醇化的聚乙烯亚胺修饰的金钆复合纳米颗粒PEI-Au-Gd NPs的水溶液作为交联剂加入到步骤(1)得到的W/O/W聚合物乳液中，搅拌过夜，继续反应，分离纯化，得到负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶AG/PEI-Au-Gd NGs；其中PEI-Au-Gd NPs与步骤(1)中AG的质量比为0.5:1～4:1。
2.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的AG水溶液的浓度为1～3wt％；AOT的DCM溶液的浓度为30～35mg/mL；PVA水溶液的浓度为15～25mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的AG水溶液、AOT溶液和PVA溶液的体积比为1:1:10～1:2:15。
4.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中活化的时间为2～3h；搅拌、继续搅拌的时间均为30～45min。
5.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的搅拌的转速为900～1100rpm。
6.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PEI-Au-Gd NPs是通过将金属螯合剂二乙烯基三胺基五乙酸二酐DTPA与六水硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O的水溶液混合搅拌1～2d，得到DTPA-Gd复合物；将马来酰亚胺聚乙二醇单甲醚mPEG-MAL与聚乙烯亚胺PEI分别溶解在超纯水中混合搅拌1～2d，用蒸馏水透析3d，冷冻干燥，得到mPEG-PEI·NH2粉末；将mPEG-PEI·NH2分散于超纯水中，加入四水氯金酸HAuCl4·4H2O水溶液，搅拌0.5h；然后加入NaBH4的冰水溶液作为还原剂，继续搅拌3h，加入DTPA-Gd复合物水溶液，继续搅拌1d，最后用蒸馏水透析3d，冷冻干燥制得；其中PEI、mPEG-MAL、HAuCl4·4H2O、NaBH4、DTPA、Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:30:200:1000:10:10。
7.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PEI-Au-Gd NPs的水溶液的浓度为8～12mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中反应的时间为22～26h。
9.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中分离纯化的工艺条件为：先使用截留分子量100000的透析袋对反应液透析1～2d，然后13000rpm，15min离心水洗2～3次。
10.根据权利要求1所述的一种负载双造影元素的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)得到的AG/PEI-Au-Gd NGs用作增强的磁共振成像和计算机断层扫描成像的造影剂。
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