CN109078196B - 一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备和应用。该纳米水凝胶是海藻酸钠和聚乙烯亚胺修饰的超小四氧化三铁。制备方法包括：柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒的制备，Fe₃O₄‑PEI的水溶液制备，W/O/W聚合物乳液制备，负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶制备，骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶制备。该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。

Description

一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备和应用

技术领域

本发明属于磁共振成像(MRI)造影剂及其制备和应用领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

一直以来，恶性肿瘤都是危害人类生命的头号杀手，具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点。因此，肿瘤的早期诊断和特异性治疗显得尤为重要。目前，肿瘤的检测手段主要有：超声成像、CT成像、核医学(PET或SPECT)成像以及磁共振成像(MRI)。随着磁共振技术的发展，其扫描时间逐渐缩短，分辨率逐渐提高，对于小病灶的检测也更加准确，这也使得磁共振成像技术成为近年来发展起来的新型疾病检测手段。为了提高MRI成像诊断的灵敏度和特异性，有必要选择合适的MRI造影剂。常规的MRI造影剂主要分为两类：一类是T1加权的MRI造影剂，一类是T2加权的MRI造影剂。至今已有大量文献报道利用磁性氧化铁纳米颗粒作为MRI阴性造影剂应用于癌症的诊断。然而，在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人体组织损伤部位在T2成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干扰临床诊断。因此，临床医学界更期望开发具有信号增强作用的T1造影剂。而目前应用于临床MRI的小分子T1造影剂都存在不可克服的缺陷，如血液循环时间过短、靶向能力不足、成像不精准等，尤其是钆基造影剂一定浓度下还存在肾毒性。相比之下，金属或者金属氧化物纳米颗粒更加具有安全性。因此我们需要研发一种具有普适性靶向能力的MR造影剂。作为生物体内MRI阳性造影剂，超小Fe₃O₄纳米颗粒必须具有良好的水溶性、稳定性、生物相容性、和较高的T1弛豫率。柠檬酸钠是一种小分子羧酸盐，拥有三个羧基，被广泛地应用于纳米材料合成过程中的晶体生长抑制剂和稳定剂，不仅能提供影响纳米颗粒胶体稳定性的电荷排斥力，还使得纳米颗粒表面带上负电荷的羧基官能团，为纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行性。

纳米凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网状结构的水凝胶颗粒，纳米凝胶具有许多优良的特性，如良好的胶体稳定性、生物相容性、高负载能力、易于多功能化、易进入肿瘤组织等，促进了其在诸多领域尤其是在分子影像学的应用。同时有文献报道(J.Mater.Res.2014,29(15),1626-1634Biomater.Sci.2016,4(10),1422-1430) 以纳米凝胶作为载体负载MRI造影元素，可显著提高r1或r2弛豫率。AG是一种天然多糖类物质，具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时价廉易得，广泛用于合成纳米凝胶。它是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸以1,4-糖苷键连接而成的线性聚合物，每个糖醛酸单元上含有一个羧基。海藻酸钠的分子式为(C6H7O6Na)n，相对分子量为2000-200000。海藻酸钠具有无毒，良好的水溶性、生物相容性和生物降解性等优点，已广泛用于生物医学领域。

间充质干细胞是一类新型靶向实体肿瘤的生物载体。近两年，间充质干细胞作为一种普适性的纳米药物载体靶向治疗开始成为国际医学和材料界一个前沿研究领域。纳米材料如纳米金棒、高分子聚合物纳米颗粒、以及介孔纳米二氧化硅等通过与间充质干细胞结合，用于输送化疗药物或者光热介质。骨髓间充质干细胞作为间充质干细胞的一种，因其独特的优点而备受青睐，其中包括它的生物安全性好，免疫原性低，可自体来源，采集相对方便。Rachael 等人(Rachael et al.Acs.Nano,2014,12450–1246)报道了负载金纳米棒的间充质干细胞比单独的金纳米棒材料表现出更好的靶向肿瘤效应，骨髓间充质干细胞具有很多独特的优势，首先对肿瘤细胞有很强的趋向性；其次可以躲避机体的免疫杀伤，避免大量的纳米材料损失；然后能自我更新，这样可以在体内维持干细胞整体的稳定，更有利于将纳米材料稳定输送。

检索国内外相关文献和专利结果表明：尚未发现骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶用作造影剂的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶及其制备方法和应用，以克服现有技术中造影剂靶向能力不足、成像不精准等缺陷。

本发明的一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶，所述纳米水凝胶是海藻酸钠和聚乙烯亚胺修饰的超小四氧化三铁，所述纳米水凝胶的分子式为AG-PEI-Fe₃O₄。

所述海藻酸钠、聚乙烯亚胺和超小四氧化三铁的质量比为4.8～5.2:3.8～4.2:5.8～6.2。

所述纳米水凝胶是将海藻酸钠双乳化处理后得到聚合物乳液，然后将PEI-Fe₃O₄溶液作为交联剂加入到乳液中，通过化学交联得到。

本发明的一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶的制备方法，包括：

(1)将三价铁盐溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，溶解，加入无水醋酸钠，溶解，溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒，其中三价铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水醋酸钠的比例为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；

(2)将步骤(1)中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在超纯水中，超声，经过 EDC和NHS活化，然后逐滴加入到PEI的超纯水溶液中反应，得到PEI修饰的氧化铁纳米颗粒Fe₃O₄-PEI的水溶液，其中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为160～168：134～144：65～70，柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒与PEI的质量比为9～12：55～60；

(3)将海藻酸钠溶解于溶剂中得到海藻酸钠溶液，经过EDC和NHS活化，加入到磺基琥珀酸二辛酯钠AOT溶液中，搅拌，再加入到聚乙烯醇PVA溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液，其中海藻酸钠、EDC和NHS的摩尔比为1:1:1～1:5:5，海藻酸钠溶液的浓度为 1wt％～3wt％，海藻酸钠溶液、AOT溶液和PVA溶液的体积比为1:1:10～1:3:15；

(4)将步骤(2)中Fe₃O₄-PEI的水溶液作为交联剂加入到步骤(3)中W/O/W聚合物乳液中，搅拌反应，分离洗涤，得到负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶，其中Fe₃O₄-PEI与步骤(3)中海藻酸钠的质量比为0.5:1～3:1；

(5)将步骤(4)中负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶与骨髓间充质干细胞共孵育，清洗，加入胰酶消化，离心，用PBS重悬，得到骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶，其中孵育时负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米凝胶的浓度为0.0125mM～0.2mM。

所述步骤(1)中三价铁盐为氯化铁，溶剂为一缩二乙二醇DEG。

所述步骤(1)中柠檬酸钠作为稳定剂，无水醋酸钠作为反应助剂、阴离子表面活性剂。

所述步骤(1)中搅拌温度为70～90℃，搅拌时间为1～2h；溶剂热反应温度为190～200℃，溶剂热反应时间为3～4小时。

所述步骤(1)中溶剂热反应的容器为50ml的高压反应釜。

所述步骤(1)中离心为：8500～9000rpm离心10～15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶， 8500～9000rpm离心10～15分钟，重复操作2～3次。

所述步骤(1)中干燥为：60～65℃烘干。

所述步骤(2)中活化时间为2～3h；反应温度为室温，反应时间为48～72h。

所述步骤(3)中溶剂为水；AOT溶液的溶剂为二氯甲烷。

所述步骤(3)中AOT溶液的浓度为2.3～2.6wt％。

所述步骤(3)中PVA溶液的溶剂为水；PVA溶液的浓度为1.8～2.2wt％。

所述步骤(3)中活化时间为2～3h；搅拌、继续搅拌的时间均为20～30min。

所述步骤(4)中搅拌反应为：搅拌过夜，继续敞口反应20～30h。

所述步骤(4)中分离洗涤为：先使用透析袋对水溶液透析2～3天，然后6500rpm，离心水洗3～5次。

所述步骤(4)中负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米凝胶颗粒分布均匀，具有较高的r1弛豫率，用作磁共振成像的造影剂，可用于肿瘤模型的磁共振成像造影诊断。

所述步骤(5)中骨髓间充质干细胞采用的细胞代数为第三代到第六代。

所述步骤(5)中孵育时间为4h～8h；消化时间为2～3min。

所述步骤(5)中离心速率为1000～1200r/min，离心时间为3～6min。

所述步骤(5)中负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米凝胶与骨髓间充质干细胞共孵育具体为：以10000个/ml浓度接种骨髓间充质干细胞于培养皿中，然后加入纳米水凝胶材料共孵育。

本发明的一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶的应用。包括用于肿瘤诊断和治疗。

本发明先利用一步溶剂热法合成柠檬酸钠稳定的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，再将PEI-NH₂修饰到纳米颗粒表面。将海藻酸钠(Alginate,AG)经EDC/NHS活化和双乳化过程后，PEI-Fe₃O₄作为交联剂，发生化学交联反应形成负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶。最后将纳米水凝胶与骨髓间充质干细胞共培养得到骨髓间充质干细胞负载的纳米水凝胶。该方法制备的干细胞负载的纳米水凝胶增加了单独水凝胶在肿瘤部位的运输和分布，在肿瘤诊断和治疗方面有潜在的应用价值。

本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、热重分析(TGA)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和核磁共振(MR) 成像分析等手段表征制备的负载氧化铁杂化海藻酸钠纳米水凝胶(AG/PEI-Fe₃O₄)。

有益效果

(1)本发明第一次采用骨髓间充质干细胞和纳米水凝胶的有机结合，骨髓间充质干细胞具有很好的免疫逃逸及生物相容性，避免大量的纳米材料损失；然后能自我更新，这样可以在体内维持干细胞整体的稳定，更有利于将纳米材料稳定输送肿瘤部位，本发明在动物实验中表明，采用骨髓间充质干细胞负载的纳米水凝胶体系可以促进纳米水凝胶的靶向输送及在肿瘤内的分布浸润，相比单独的纳米水凝胶有更好的MR成像效果，为进一步的肿瘤治疗研究打下基础。

(2)本发明制备方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。

(3)本发明制得的海藻酸钠包裹的纳米水凝胶(AG/PEI-Fe₃O₄)粒径分布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性，对生物体无不良影响，在肿瘤诊断和治疗中有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明的负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米凝胶的制备示意图；

图2为实施例1中Fe₃O₄纳米材料在明场(a)和暗场(b)中的透射电子显微镜图及粒径分布图(c)；

图3为实施例1中AG/PEI-Fe₃O₄纳米材料在明场(b)和暗场(a)中的透射电子显微镜图及粒径分布图(c)；

图4为实施例3中Fe₃O₄纳米材料、Fe₃O₄-PEI纳米材料和AG/PEI-Fe₃O₄纳米材料的热重分析曲线；

图5为实施例3中Fe₃O₄纳米材料、Fe₃O₄-PEI纳米材料和AG/PEI-Fe₃O₄纳米材料的红外吸收光谱图；

图6为实施案例4中Fe₃O₄纳米颗粒和AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的MR T1加权成像(a)以及T1弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图(b)；

图7是实施例5中CCK-8法测得BMSC细胞经过PBS缓冲液(对照)、AG/PEI-Fe₃O₄在铁浓度为0-0.32mM条件下处理24小时后的细胞活力；

图8是实施例5中BMSC细胞经过PBS缓冲液(对照)、AG/PEI-Fe₃O₄在铁浓度0-0.2mM条件下处理24小时后相差显微镜下观察到的细胞形态图；

图9是实施例6中BMSC细胞经过PBS缓冲液、AG/PEI-Fe₃O₄在铁浓度0-0.2mM条件下处理4小时后经普鲁士蓝染色后的结果；

图10是实施例6中BMSC细胞经过PBS缓冲液、AG/PEI-Fe₃O₄在铁浓度0-0.2mM条件下处理4h、6h、8h后收集细胞，经王水消化后利用ICP-OES测定得到每个细胞内的铁含量结果图；

图11是实施例8中尾静脉注射制备得到的AG/PEI-Fe₃O₄和BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄后不同时间点小白鼠皮下瘤的T1加权MR成像；

图12实施例8中尾静脉注射制备得到的对照组材料AG/PEI-Fe₃O₄和实验组BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄(Fe浓度为100μg，200μL)后不同时间点大鼠主动脉MRI信噪比值变化柱状图；

图13是实施例8中尾静脉注射制备得到AG/PEI-Fe₃O₄和BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄后不同时间点小白鼠原位脑胶质瘤的T1加权MR成像；

图14是实施例8中通过裸鼠尾静脉注射AG/PEI-Fe₃O₄和BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄以及T1加权MR成像的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例原料来源如下表所示：

实施例1

(1)将1.09g六水合氯化铁溶解在40mL一缩二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，然后将0.47g 柠檬酸钠(Na₃Cit)溶解在上述溶液，并于空气气氛下80℃搅拌1小时，待柠檬酸钠完全溶解后再将1.312g的无水醋酸钠加入到上述溶液中，持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，然后将溶液转移至50mL的高压反应釜中，于200℃反应4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将产物转移至50mL离心管中8500rpm离心15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500rpm离心15分钟，重复操作3次，然后将沉淀物在60℃烘干得到超小四氧化三铁纳米颗粒，即表面柠檬酸钠稳定的超小氧化铁纳米颗粒。

(2)分别称取PEI(840mg)和Fe₃O₄纳米颗粒(168mg)，使用EDC(144mg)和NHS(70mg)活化Fe₃O₄水溶液3小时，将活化后的Fe₃O₄溶液逐滴加入到PEI(水溶液)中，室温下反应72小时，得到Fe₃O₄-PEI的水溶液。

(3)取5mL浓度为1wt％AG(50mg)水溶液，先用88.7mgEDC和53.25mg NHS活化3h，然后逐滴加入到10mL 2.5wt％AOT的二氯甲烷溶液中，搅拌30min，形成W/O乳液，然后将该W/O乳液逐滴加入到75mL2wt％PVA的水溶液中，搅拌30min，得到W/O/W聚合物乳液。

(4)将步骤(2)中聚乙烯亚胺PEI修饰的氧化铁纳米颗粒PEI-Fe₃O₄(100mg,5mg/mL)水溶液作为交联剂加入到步骤(3)中W/O/W聚合物乳液中，搅拌过夜，继续敞口反应24h，蒸发除去有机溶剂，然后使用截留分子量8000～14000的透析袋对水溶液透析3天(2L/次，3次/天)，最后 6500rpm离心水洗3次，即得AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶。制备得到的Fe₃O₄纳米颗粒表面有大量的柠檬酸钠，具有较高的负电荷，这使得纳米颗粒之间产生相互排斥作用而具有很好的胶体稳定性。

通过对合成纳米材料进行透射电子显微镜分析(见图2)，图2表明：Fe₃O₄纳米颗粒尺寸均匀，纳米颗粒大小约为3.56nm，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。图3表明：AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，凝胶直径大小约为 43.68nm，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。

实施例2

分别取实施例1制备的Fe₃O₄、PEI-Fe₃O₄纳米颗粒和AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶2mg溶解在超纯水中，超声均匀，测表面电势和水合粒径，如表1所示，制备得的Fe₃O₄、PEI-Fe₃O₄和AG/PEI-Fe₃O₄电势分别为-34.5mV、+42.6mV、-18.7mV；水合粒径分别为26.3nm、115.8nm 和216.2nm。从实验结果得出，超小氧化铁纳米颗粒在修饰PEI后表面电势升高，水动力直径增大，主要是由PEI表面修饰引起的。Zeta电势测定结果表明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶的表面电势为-18.7mV，交联剂PEI-Fe₃O₄的表面电势为+42.6mV，证明了AG和PEI-Fe₃O₄的成功交联。其水动力学直径为216.2nm，粒径分布均一，从而说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的胶体稳定性。

表1

样品名称	电势(mV)	水动力直径(nm)	多分散系数
				Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>	-34.5	26.3	0.586
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-PEI	+42.6	115.8	0.278
				AG/PEI-Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>	-18.7	216.2	0.439

实施例3

分别称取实施例1制备得到的三种材料：Fe₃O₄、PEI-Fe₃O₄和AG/PEI-Fe₃O₄进行热重分析 (如图4所示)和红外光谱测试(如图5所示)。TGA测试结果表明，Fe₃O₄的失重量为74.8％(见图 4中a)，Fe₃O₄-PEI和AG/PEI-Fe₃O₄的失重分别是56.2％(见图4中b)和31.7％(见图4中c)，由此定量分析出AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶中PEI和AG的含量分别为18.6％和24.5％。红外测试表明a、 b、c中3397cm^-1处的峰为吸附的水分子上OH的伸缩振动峰，2926cm^-1和2855cm^-1附近的特征吸收峰归属于柠檬酸钠上亚甲基的伸缩振动，同时在1396-1642cm^-1(C＝O的伸缩振动)和 1028-1075cm^-1(C-O-C的伸缩振动)处的峰，均在Fe₃O₄、Fe₃O₄-PEI和AG/PEI-Fe₃O₄样品上得到体现。466-601cm^-1上出现的特征吸收峰为Fe₃O₄上Fe-O的伸缩振动(图a，b，c)。Fe-O键的吸收峰减弱，可能是由于PEI修饰的和水凝胶包裹的缘故。红外光谱图结果表明PEI-Fe₃O₄和 AG/PEI-Fe₃O₄都有Fe₃O₄的存在。

实施例4

r1弛豫率反映Fe₃O₄纳米颗粒和AG/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的纵向弛豫时间，可通过不同浓度下的T1弛豫时间的倒数拟合计算得到。将实施例1中制备的Fe₃O₄纳米颗粒和AG/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶通过ICP-OES测试法测得溶液中Fe元素的浓度，再用超纯水配制Fe浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液2mL，测定不同Fe浓度下的T1弛豫时间和T1加权成像(见图6)。弛豫率测试结果表明Fe₃O₄纳米颗粒和 AG/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的T1弛豫时间倒数在Fe浓度为0.1-1.6mM范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可得Fe₃O₄纳米颗粒和AG/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的r1弛豫率分别为0.9mM^-1s^-1和1.5mM^-1s^-1。可以看出随着Fe浓度提高，MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系，测试结果说明实施例1制备AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶可以作为MR分子影像诊断中的优良T1阳性造影剂。

实施例5

收集对数生长期BMSC细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于 5％CO2，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含不同浓度的AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(最终凝胶铁浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mM)或纯PBS(对照组)。将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基，加入含10μL CCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长 450nm下测试吸光值，结果如图7所示。与PBS对照组相比，AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在试验浓度范围(0.0125mM-0.2mM)内对BMSC细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在80％以上，在纳米凝胶的浓度为0.32mM时，细胞活力小于80％，说明AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶在(0.0125mM-0.2mM)具有良好的生物相容性。同时，通过相差显微镜观察法进一步验证了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶对细胞形貌的影响。如图8所示，纯PBS和不同浓度AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶(最终凝胶铁浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mM)在37℃下与细胞共培养24小时后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说明了AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶具有良好的细胞相容性。

实施例6

通过普鲁士蓝染色法检测不同浓度的纳米凝胶与BMSC细胞共培养4小时后细胞的普鲁士蓝染色(如图9)来评价海藻酸钠纳米水凝胶被BMSC细胞内吞的效果。BMSC细胞以2×10⁵个/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与实施例5中不同浓度的纳米凝胶共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于1mL PBS中。普鲁士蓝染色后用相差显微镜拍照记录，根据细胞染成蓝色的深浅来定性分析细胞吞噬纳米凝胶的多少。在图9中随着Fe浓度的提高，与纳米凝胶共培养的细胞经染色后蓝色逐渐加深，说明BMSC细胞对纳米凝胶的吞噬能力呈浓度依赖性，此外，还采用ICP-OES技术定量分析了平均每个细胞吞噬纳米水凝胶的质量(见图10)，细胞的处理方式与普鲁士蓝染色一致。当不同浓度的纳米颗粒与细胞共培养4-8小时后，用PBS洗涤细胞3 次，然后胰酶消化、计数，最后用王水消化细胞，用ICP-OES测试每孔吞噬铁元素的总量，再除以细胞数目，得出每个细胞吞噬铁含量。如图10所示，在相同Fe浓度下，细胞与纳米水凝胶共培养6小时时对纳米水凝胶的吞噬量最大。

实施例7

以10000个/ml浓度接种骨髓间充质干细胞于25T培养瓶中，然后加入纳米水凝胶材料，加入的纳米水凝胶材料浓度为0.2Mm。共孵育6h后PBS清洗2-3遍，胰酶消化3min，离心速率为 1000rpm，离心时间为5min,弃上清液，PBS重悬收集得到骨髓间充质干细胞负载的纳米水凝胶材料。

实施例8

在裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型和C6原位脑胶质瘤模型。通过尾静脉注射实施例7制备的骨髓间充质干细胞负载的纳米水凝胶材料(BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄)和对照材料(实施例1 制备得到AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶)的PBS溶液(100μg,200μL)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见图11和图13)。与注射前的空白组相比较，在注射后40min内，注AG/PEI--Fe₃O₄纳米凝胶的小鼠肿瘤部位信号增强，然后逐渐开始恢复，说明纳米凝胶可以随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去。同时MRI信号值定量分析结果(见图12)显示，注射前肿瘤部位信噪比SNR为68.9，注射BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶10min后肿瘤部位信噪比SNR为117.4,Δ SNR为48.5。注射对照材料AG/PEI-Fe₃O₄的实验组，小鼠肿瘤部位信号增强不明显，注射后30min，肿瘤部位信噪比SNR从68.9增长到121.6，ΔSNR为52.7，明显大于注射AG/PEI-Mn3₄纳米凝胶组。肿瘤MR成像结果说明实施例7制备BMSC.AG/PEI-Fe₃O₄纳米凝胶可以作为造影剂应用于增强的体内肿瘤MR成像诊断。

传统水凝胶合成方法有温和还原法合成了聚乙烯亚胺(PEI)包覆的Fe3O4纳米颗粒和通过双乳化的方法合成了负载Fe3O4纳米颗粒的γ-PGA纳米水凝胶。制备的纳米水凝胶的尺寸大小为152.3±13.12nm，MR成像测试结果表明纳米水凝胶具有较高的r2弛豫率。本发明用溶剂热法合成柠檬酸稳定的超小四氧化三铁，再用PEI修饰，进而通过双乳化的方法合成了负载超小Fe3O4纳米颗粒的纳米水凝胶，制备的纳米水凝胶的尺寸大小为43.68±3.41nm， MR成像测试结果表明纳米水凝胶具有较高的r1弛豫率。

Claims (10)

1.一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶，其特征在于，所述纳米水凝胶是海藻酸钠和聚乙烯亚胺修饰的超小四氧化三铁，所述纳米水凝胶的分子式为AG-PEI-Fe₃O₄；

所述骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶的制备方法包括：

(1)将三价铁盐溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌，加入无水醋酸钠，持续搅拌，溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒，其中三价铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水醋酸钠的比例为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；

(2)将步骤(1)中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在超纯水中，超声，经过EDC和NHS活化，然后逐滴加入到PEI的超纯水溶液中反应，得到PEI修饰的氧化铁纳米颗粒Fe₃O₄-PEI的水溶液，其中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为160～168：134～144：65～70，柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒与PEI的质量比为9～12：55～60；

(3)将海藻酸钠溶解于溶剂中得到海藻酸钠溶液，经过EDC和NHS活化，加入到磺基琥珀酸二辛酯钠AOT溶液中，搅拌，再加入到聚乙烯醇PVA溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液，其中海藻酸钠、EDC和NHS的摩尔比为1:1:1～1:5:5，海藻酸钠溶液的浓度为1wt％～3wt％，海藻酸钠溶液、AOT溶液和PVA溶液的体积比为1:1:10～1:3:15；

(4)将步骤(2)中Fe₃O₄-PEI的水溶液作为交联剂加入到步骤(3)中W/O/W聚合物乳液中，搅拌反应，分离洗涤，得到负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶，其中Fe₃O₄-PEI与步骤(3)中海藻酸钠的质量比为0.5:1～3:1；

(5)将步骤(4)中负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶与骨髓间充质干细胞共孵育，清洗，加入胰酶消化，离心，用PBS重悬，得到骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶，其中孵育时负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶的浓度为0.0125mM～0.2mM。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠、聚乙烯亚胺和超小四氧化三铁的质量比为4.8～5.2:3.8～4.2:5.8～6.2。

3.一种骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶的制备方法，包括：

(1)将三价铁盐溶于溶剂中，加入柠檬酸钠，搅拌，加入无水醋酸钠，持续搅拌，溶剂热反应，冷却，离心，干燥，得到柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒，其中三价铁盐、溶剂、柠檬酸钠和无水醋酸钠的比例为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；

(2)将步骤(1)中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在超纯水中，超声，经过EDC和NHS活化，然后逐滴加入到PEI的超纯水溶液中反应，得到PEI修饰的氧化铁纳米颗粒Fe₃O₄-PEI的水溶液，其中柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为160～168：134～144：65～70，柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒与PEI的质量比为9～12：55～60；

(3)将海藻酸钠溶解于溶剂中得到海藻酸钠溶液，经过EDC和NHS活化，加入到磺基琥珀酸二辛酯钠AOT溶液中，搅拌，再加入到聚乙烯醇PVA溶液中，继续搅拌，得到W/O/W聚合物乳液，其中海藻酸钠、EDC和NHS的摩尔比为1:1:1～1:5:5，海藻酸钠溶液的浓度为1wt％～3wt％，海藻酸钠溶液、AOT溶液和PVA溶液的体积比为1:1:10～1:3:15；

(4)将步骤(2)中Fe₃O₄-PEI的水溶液作为交联剂加入到步骤(3)中W/O/W聚合物乳液中，搅拌反应，分离洗涤，得到负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶，其中Fe₃O₄-PEI与步骤(3)中海藻酸钠的质量比为0.5:1～3:1；

(5)将步骤(4)中负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶与骨髓间充质干细胞共孵育，清洗，加入胰酶消化，离心，用PBS重悬，得到骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶，其中孵育时负载超小四氧化三铁的杂化海藻酸钠纳米水凝胶的浓度为0.0125mM～0.2mM。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中三价铁盐为氯化铁；溶剂为一缩二乙二醇；搅拌温度为70～90℃，搅拌时间为1～2h；溶剂热反应温度为190～200℃，时间为3～4小时。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中活化时间为2～3h；反应温度为室温，反应时间为48～72h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中溶剂为水；AOT溶液的溶剂为二氯甲烷；AOT溶液的浓度为2.3～2.6wt％；PVA溶液的溶剂为水；PVA溶液的浓度为1.8～2.2wt％。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中活化时间为2～3h；搅拌、继续搅拌的时间均为20～30min。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌反应为：搅拌过夜，继续敞口反应20～30h；分离洗涤为：先使用透析袋对水溶液透析2～3天，然后8500rpm离心水洗3～5次。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中骨髓间充质干细胞采用的细胞代数为第三代到第六代；孵育时间为4h～8h；消化时间为2～3min；离心速率为1000～1200r/min，离心时间为3～6min。

10.一种如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞介导的纳米水凝胶在制备诊断肿瘤和治疗肿瘤药物中的应用。

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