CN101991867A - 用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针及其制备方法。所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，包括载体，所述载体连接荧光基团和磁共振造影基团，并经由桥连基团连接能够与肝纤维化/肝硬化中肝星状细胞表面上的受体相结合的靶向化合物基团。其制备方法为：将能够与肝纤维化/肝硬化中肝星状细胞表面上的受体相结合的靶向化合物基团与桥连基团相连，依次在载体上连接靶向化合物基团、荧光集团以及磁共振造影基团。在利用本发明的靶向探针进行肝纤维化的诊断和评估时，具有较高灵敏度。

Description

用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针及其制备方法，用于用磁共振、光学等多模式无创性显像整合素αvβ3受体来评估肝纤维化。

背景技术

迄今，肝活检仍是评估肝纤维化的唯一“金标准”。然而，肝活检是有创的，可引起致命的并发症，因此不能被患者普遍接受，这造成了很大一部分慢性肝病患者在诊断和治疗上的延误；同时，在无明显症状的患者中，很难重复进行肝活检，这就无法准确地随访慢性肝病患者病情的变化；此外，样本取样误差和病理观察的不一致性都影响了肝活检的准确性。因此，需要一种精确的无创伤性的方法来诊断和评估肝纤维化。目前，肝纤维化无创伤性的评估方法有：1纤维化血清标记物。器官特异性差，易受炎症和机体代谢的干扰，标准化困难，组合指标更多反映炎症，对纤维化分期较困难；2生化指标。需多项组合(如Fibrotest)。由于肝脏极强的储备功能，只在严重肝纤维化时改变明显，并且生化指标影响因素多，解释困难，不同病因、不同时期的肝纤维化评估的准确性不同；3常规影像。目前常规B超、CT、MRI难于反映肝纤维化早期改变，评估多限于肝硬化及并发症；4发展中的影像技术。近年推出超声检测低频弹性波的瞬时弹性记录仪(Fibroscan)和运用MRI弥散加权成像(DWI)、³¹磷波谱成像(³¹MRS)及弹性成像变化等新技术，通过测量肝组织硬度和弹性来评估肝脏纤维化程度，优于其他的无创的方法，具有一定的应用前景。然而，近来的研究发现也存在一定的局限性，如腹壁脂肪的含量在很大程度上影响Fibroscan等对肝纤维化的检测准确性，并且这些方法在对早期肝纤维化的诊断上也存在困难。

目前诊断和评估肝纤维化的方法都未能较好反映慢性肝损伤修复过程中活化细胞表型和数量变化等分子病理改变，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面存在不一致性，尚难达到临床对肝纤维化早期诊断和治疗效果实时动态评估的要求。不能对肝纤维化做出正确评估一直以来是制约基础研究走向临床的“瓶颈”，也是不能开发抗纤维化药物与临床试验的关键环节。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-asparagic acid，RGD)系列是整合素结合配基的最常见识别位点。整合素α_vβ₃能识别ECM中特异构象的RGD配体。人工合成含RGD肽链高通量筛选发现，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)酪氨酸-赖氨酸(RGDyK)、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖氨酸(RGDfK)等五肽分子也能和整合素α_vβ₃受体特异结合，对五肽中赖氨酸侧链上活性氨基进行小分子修饰并不会显著影响受体与配基结合活性。

在本发明的前期的研究中，发现活化HSCs中整合素α_vβ₃表达明显上调，cRGDyK多肽在肝纤维化的诊断中可以做为一种潜在的靶点。这部分结果已经发表SCI文章：Biochemicalcharacterization of the binding of cyclic RGDyK to hepatic stellate cells.Xiao-weiHuang，Ji-Yao Wang，et al.Biochemical Pharmacology.2010，80：136-143.(IF＝4.8，2008)另外，本发明也发现在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)和胆总管结扎(bile ductligation，BDL)诱导的两种大鼠肝纤维化模型中，整合素α_vβ₃和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，SMA)表达在程度和部位上密切相关，它和肝纤维化的发展趋势是一致的。并已经进行了SPECT和超声显像的初步体内研究。

目前，国外已有不少通过以RGD环肽标记的对比剂对整合素α_vβ₃受体表达进行显像的分子影像学研究。主要工作集中在肿瘤新生血管、血管损伤重塑、破骨细胞参与的骨重建等方面。国外靶向于整合素α_vβ₃受体，对肿瘤相关血管新生进行的MRI磁共振分子成像研究也已经有一定基础，相对比较成熟。而在肝纤维化中，目前未见相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米探针及其制备方法，用于肝纤维化的诊断和评估。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，包括载体，所述载体连接荧光基团和磁共振造影基团，并经由桥连基团连接能够与肝纤维化/肝硬化中肝星状细胞表面上的受体相结合的靶向化合物基团。

所述的肝纤维化/肝硬化中肝星状细胞表面上的受体是指至少一种在病理状态下上调的受体，如整合素受体。靶向化合物基团与肝星状细胞多种整合素受体相结合的位点为环肽中的RGD序列。所述靶向化合物基团可为氨基酸序列*GRZXD*，*表示成环位置，Z代表含有活性氨基侧链的一个氨基酸或者足够长度的氨基酸序列并且不影响与靶向受体结合，X代表含有可以用来碘标的至少一个氨基酸或者足够长度的氨基酸序列并且不影响与靶向受体结合。所述靶向化合物基团可优选为环肽序列*GRKXD*，*表示成环位置，X代表含有可以用来碘标的至少一个氨基酸或者足够长度的氨基酸序列并且不影响与靶向受体结合。进一步地，所述靶向化合物基团可优选为环肽序列*GRKyD*，*表示成环位置，y代表右旋酪氨酸。更进一步地，所述靶向化合物基团为c(RGDyK)基团，y代表右旋酪氨酸，其能与肝星状细胞特异性结合，符合作为配体的要求。K含有活性氨基侧链，是主动靶向纳米药物的结合位点。

所述载体可为树枝状大分子Dendrimer(Den)，优选2-8代的聚乙二胺树枝状高分子。

所述的荧光基团为羰花青类近红外荧光染料基团以及非近红外荧光染料基团中的至少一种。所述的羰花青类近红外荧光染料基团为IR783基团或Cy5.5基团。所述的非近红外荧光染料基团为罗丹明基团。所述的荧光基团以酰胺键形式标记到树枝状高分子上。

所述的磁共振造影基团为T1加权磁共振造影基团，优选钆配合物Gd-DOTA基团。

所述的所述桥连基团为聚乙二醇基团，PEG两端分别是N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺。c(RGDyK)环肽与主动靶向纳米药物的连接方法，即活性氨基侧链与N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-马来酰亚胺的N-羟基琥珀酰亚胺酯在有机相中反应生成稳定的酰胺键。然后N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-马来酰亚胺通过马来酰亚胺和树枝状大分子Dendrimer上的伯胺基结合。

本发明还提供了c(RGDyK)的制备方法，具体步骤为：

第一步：将0.4重量份的取代度为0.6mmol/g的树脂-Gly(Fmoc-Gly-2-Cl-Trt)用二氯甲烷冲洗并溶胀，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；

第二步：用20vol％哌啶脱保护，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与1-羟基苯并三唑混合，用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺溶解，其中，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐以及N，N-二异丙基乙胺与树脂-Gly的比例分别为：1.2mmol-1.3mmol∶0.4g，0.15g-0.2g∶0.4g，2.4ml-2.5ml∶0.4g，0.4ml-0.5ml∶0.4g；将所得溶液加入到第一步的树脂中，恒温振荡器上反应45分钟，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，进行茚三酮检测确定是否反应完全；

第三步：将Fmoc-Arg(Pbf)-OH依次替换为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(otBu)-OH，重复进行第二步，得到连接在树脂上的整条被保护线状肽链H-Asp(otBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly(2-Cl-Trt)-OH；用20vol％哌啶脱保护，分别用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷冲洗，用二氯甲烷和三氟乙酸的混合液切割，切割液抽吸入装有吡啶和甲醇的烧瓶中，最后用甲醇冲洗树脂，冲洗液也抽吸入烧瓶中，旋蒸去除二氯甲烷和甲醇，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用蒸馏水沉淀出絮状粗品，用砂芯漏斗过滤得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸馏水，超声分散沉淀，冷冻干燥得到粗品；

第四步：将第三步所得的粗品0.19-0.2重量份溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入二氯甲烷，加入N，N-二异丙基乙胺0.019-0.02重量份以及六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷0.06-0.07重量份进行环化，常温下搅拌3～4小时，旋蒸去除二氯甲烷，加蒸馏水沉淀出多肽，用砂芯漏斗过滤得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸馏水，超声分散沉淀，冷冻干燥；用三氟乙酸和蒸馏水的混合物脱保护，常温下磁力搅拌3～4小时，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗过滤得沉淀，用蒸馏水溶解，制备型HPLC纯化、冷冻干燥得到c(RGDyK)。

本发明还提供了上述用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将靶向化合物溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺，加入溶于N，N-二甲基甲酰胺的马来酰亚胺-桥连基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯，常温搅拌反应得到与桥连基团相连的靶向化合物，加入溶于磷酸盐缓冲液的载体，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器用纯水进行超滤、纯化，去除水溶性的小分子副产物，冷冻干燥得到与靶向基团相连的载体；

第二步：将第一步中所得的与靶向基团相连的载体溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯，边加边搅拌，整个过程中加入氢氧化钠溶液使溶液pH值控制在8.4-8.6，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，去除没有结合的DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯，冷冻干燥后溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入碳酸钆，60℃下搅拌过夜，离心沉淀除去多余的碳酸钆，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，冷冻干燥得到与靶向基团和磁共振造影基团相连的载体；

第三步：将荧光基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，将第二步得到的与靶向基团和磁共振造影基团相连的载体溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，滴加上述荧光基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，得到与荧光基团、磁共振造影基团和靶向基团相连的载体，即为用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针。

本发明中，荧光探针和DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)螯合的Gd(磁共振显像基团)被标记在PAMAM-G5上，c(RGDyK)通过一种双功能的PEG连接在此高分子上，组成一个新型的纳米探针。

本发明的优点如下：

1.近红外荧光(Near-Infrared Fluorescence)探针近年来在生物医学领域广泛被应用。活体组织对波长范围在700～1000nm的近红外光吸收较弱，因此近红外荧光能够穿透较深的组织，从而得到灵敏度更高，且信噪比更好的图像，但空间分辨率较差。

2.MRI是一种无创医学诊断技术，它有着高空间分辨率，无电离辐射，无检测角度限制，易临床转化等特点，但灵敏度较低。MRI在临床上广泛应用于软组织，特别是肿瘤和心血管类疾病的早期诊断和治疗效果评估。它是一种具有将解剖学结构和功能及分子信息结合于一体的影像方法。相对于PET、SPECT等放射性示踪技术，MRI具有更好的安全性，更高的空间分辨率，并且可以进行动态多次扫描。MRI的对比剂可以显著提高MRI的灵敏度。磁共振对比剂包括T1加权对比剂和T2加权对比剂等类型。它们能显著增加软组织间的对比度，并能实现对肿瘤等病变组织的靶向特异性诊断。MRI的分子影像学成像是建立在传统MR成像技术基础上，以MR图像或波谱等形式在活体上对目标分子进行无创的示踪，定量和实时观测。此外，Gd-DOTA配合物还具有良好的热力学稳定性，不易于生理内源性的Zn²⁺，Ca²⁺等离子发生交换并游离出毒性的Gd³⁺离子。因此本工作将以Gd-DOTA配合物作为磁共振成像基团。

3.树枝状大分子聚乙二胺(PAMAM)自从1985年被Tomalia和他的伙伴们介绍后引起了广泛的关注。它们最成功的地方是有一系列的大小尺寸，被称为“代(generation)”，使得根据应用需要精确细调分子大小成为可能。很多广泛的研究也认为它们的很多内在性质适合生物医学的应用。树枝状大分子PAMAM做为一种新的药物平台可以携带多个螯合的钆剂(携带位点的多少取决于PAMAM的代数)，将组成一种具有较高分子驰豫率和较好的影像增强效果的磁共振显像剂。低代数的树枝状高分子为基础的试剂，包括G2(二代，3nm)、G3(三代，5nm)和G4(四代，6nm)钆螯合剂，将很快被排泄，主要通过首次通过肾脏时的排泄。虽然如此，由于减少了外渗，它们依然比Gd-DTPA(螯合上钆的二乙烯三胺五乙酸)能更好地显示血管结构。中等代数的树枝状高分子为基础的试剂，包括G5(五代，7nm)和G6(六代，9nm)钆螯合剂，由于长血池储留而较慢被肾脏排泄，但是这些试剂开始显示出部分肝胆管的排泄。而对于G7(七代，11nm)和G8(八代，13nm)而言，几乎完全是通过肝胆系统排泄，更高代数的则被肝脾等的网状内皮系统所捕获。因此，本发明选择G5做为探针的载体，以延长血循环时间，更多地结合到纤维化的活化肝星状细胞和新生血管上，并尽量减少肝胆管排泄。

4.本发明中，荧光探针和DOTA螯合的Gd(磁共振显像基团)被标记在G5树枝状高分子上，c(RGDyK)通过一种双功能的PEG连接在此高分子上。这种延伸的PEG链接不仅改善了整个探针的水溶性，延长了纳米探针循环时间，同时也尽可能减少了树枝状的聚合物对结合的c(RGDyK)的结合受体能力的立体位阻。另外，纳米探针上也标记了Rhodamine(罗丹明)等荧光基团，这样用荧光显微镜观察离体切片时，用近红外小动物成像仪等，本发明能很容易追踪此纳米探针。

附图说明

图1为本发明的多模式靶向探针的合成路线图；

图2为不带cRGDyK靶头的对照纳米探针的合成路线图；

图3为c(RGDyK)的HPLC图；

图4为c(RGDyK)的ESI-MS图；

图5为化合物1的¹H NMR核磁图；

图6为化合物2的¹H NMR核磁图；

图7为化合物6的¹H NMR核磁图；

图8为化合物7的¹H NMR核磁图；

图9为Den-RGD的流体动力学粒径分布和zeta电位示意图；

图10为Den-PEG的流体动力学粒径分布和zeta电位示意图；

图11为细胞毒性实验曲线图；

图12为T1加权磁共振信号图；

图13为MRI显像图；

图14为模型小鼠肝冰冻切片荧光显微镜观察图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

如图1所示，为本发明的多模式靶向探针的合成路线图，所述多模式靶向探针(Den-RGD)的合成路线图的合成步骤如下：

1、c(RGDyK)的合成：

本发明用Fmoc保护的固相多肽合成方法合成c(RGDyK)(MW＝619.68Da)：

(1)称取0.4g树脂-Gly(Fmoc-Gly-2-Cl-Trt，取代度0.6mmol/g，约0.25mmol)，用二氯甲烷(DCM)冲洗并溶胀20分钟，用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)洗涤数次。

(2)连续用20％哌啶(DMF∶哌啶＝2ml∶0.5ml)脱保护2次，每次10～15分钟。DMF洗涤数次。

(3)称取所需氨基酸1.25mmol，并加入0.18g的HOBt(1-羟基苯并三唑)，用2.45ml的HBTU(苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)和0.44ml的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)溶解，加入树脂中，常温下在振荡器上反应45分钟。

(4)用DMF洗涤。挑取芝麻大小的树脂进行NT(茚三酮)检测确定是否反应完全。NT检测液：A液为8ml苯酚加2ml乙醇，B液为吡啶，C液为1g茚三酮加10ml乙醇。NT检测方法：往挑取的树脂中加入A液10ul，B液20ul，C液10ul，120℃电炉上烤约1分钟。若树脂变蓝则反应不完全，需要重新称取此氨基酸进行反应；若树脂仍为黄色，则反应完全。重复(2)、(3)、(4)，依次反应的氨基酸分别是Fmoc-Arg(Pbf)-OH(有保护基团的精氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(有保护基团的赖氨酸)、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH(有保护基团的酪氨酸)、Fmoc-Asp(otBu)-OH(有保护基团的天冬氨酸)，得到整条被保护线状肽链H-Asp(otBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly(2-Cl-Trt)-OH。

(5)同上，用哌啶脱保护两次，再分别用DMF和DCM冲洗。用50mlDCM(二氯甲烷)和0.5mlTFA(三氟乙酸)的混合液分10次切割，每次搅拌约2分钟，切割液抽吸入装有1ml吡啶和9ml甲醇的烧瓶中，最后用甲醇冲洗树脂，冲洗液也抽吸入烧瓶中。旋蒸去除DCM和甲醇，用2～3mlDMF溶解，再用适量(约50～100ml)蒸馏水沉淀出絮状粗品。用砂芯漏斗过滤得沉淀，适量乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入适量蒸馏水，超声分散沉淀，冻干。得到产物约197.5mg。

(6).将粗品溶解于20mlDMF中，再加入180mlDCM，在19.4mg(0.15mmol，1.5倍)DIEA的催化下，用62.5mg(0.12mmol，1.2倍)PYBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)进行环化，常温下磁力搅拌3～4小时。旋蒸去除DCM，加约500ml蒸馏水沉淀出多肽。用砂芯漏斗过滤得沉淀，适量乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入适量蒸馏水，超声分散沉淀，冻干。得到产物约197mg。

(7).用10mlTFA加0.5ml蒸馏水脱保护，常温下磁力搅拌3～4小时，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗过滤得沉淀，适量蒸馏水溶解，制备型HPLC(高效液相色谱仪)纯化、冻干。产物的纯度通过分析型HPLC证实。ESI-MS(电喷雾质谱)中有一个单一的620.45峰，计算分子量为619.68。

制备型HPLC纯化方法：制备柱：Symmetry Prep^TM C187μm 19×300mm Column；流动相A：0.1％TFA的纯水；流动相B：15％乙腈；洗脱程序：0-60分钟0％B-100％B；流速：10ml/min；柱温：25℃；检测：UV 214nm和280nm。

分析型HPLC方法：色谱柱：YMC HPLC COLUMN 150×4.6mml.D.；流动相A：0.1％TFA的乙腈；流动相B：0.1％TFA的纯水；洗脱程序：0-2分钟100％B冲洗柱子平衡；2-17分钟100％B-80％B；17-18分钟，80％B-10％B；18-23分钟，10％B冲洗柱子；23-24分钟，10％B-100％B；24-30min，100％B平衡柱子。流速0.7ml/min；柱温：25℃；检测：UV 214nm和280nm。如图3所示，为c(RGDyK)的HPLC图。如图4所示，为c(RGDyK)的ESI-MS图。

2、化合物1的合成：

5mg(8.06×10^-6mol，13倍)的c(RGDyK)溶于500ul的DMF中，并加入10ul的TEA(三乙胺)，迅速和溶于500ulDMF的12.4mg(6.2×10^-6mol，10倍，分子量为2kDa)Malemide-PEG^2k-NHS(马来酰亚胺-聚乙二醇(分子量2000Da)-N-羟基琥珀酰亚胺酯)混合，常温下磁力搅拌2h后，形成一边是马来酰亚胺，另一边是c(RGDyK)的PEG衍生物。然后上述混合液再迅速和溶于2ml 1XPBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.4)的17.9mg(6.2×10^-7mol，分子量为28826Da)G5混合(G5的PBS溶液先调整pH至7.4～8.0)，常温下磁力搅拌1小时。用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器用纯水进行超滤、纯化，4000转/分钟，30分钟×3次，以除去水溶性的小分子副产物。冻干产物。如图5所示，为化合物1的¹H NMR核磁图。产物中dendrimer和RGD的比值通过3.3-2.2ppm处的dendrimer质子积分和7.2-6.7ppm处的RGD侧链苯环的质子积分来计算，大约RGD/dendrimer约为5。

3、化合物2的合成：

将化合物1溶于2ml 0.5M HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，pH 8.3)溶液中。79mg(7.94×10^-5mol，128倍.)DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯白色粉末逐渐加入到上述溶液中，边加边搅拌，并用pH计监测溶液的pH值，整个过程中用5.0M NaOH(氢氧化钠)溶液使溶液pH值控制在8.5左右。常温下搅拌3小时后(或者过夜)，混合物用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，以去除没有结合的DOTA螯合剂。冻干产物。如图6所示，为化合物2的¹H NMR核磁图谱。DOTA标记在dendrimer的数量可以通过3.3-2.2ppm处的dendrimer及DOTA的质子积分来定量，约为95个。

4、化合物3的合成：

19.6mg Gd₂(CO₃)₃.(碳酸钆)(3.97×10^-5mol，64倍.)加入到溶于2mL 0.1M HEPES(pH 8.3)溶液的化合物2中。此悬浊液在60℃下搅拌过夜。多余的Gd₂(CO₃)₃离心沉淀(2000rpm，8分钟)，然后上清液用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤纯化，最后获得Den-RGD化合物。

5、化合物4的合成：

0.7mg(1.24×10^-6mol，2.0倍.)的罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯和1.8mg(1.24×10^-6mol，2.0倍)的Cy5.5-NHS(青色素染料5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分别溶解在50μL无水的DMF中，然后缓慢逐滴加入1.0mL的化合物3的0.1M HEPES溶液(pH 8.3)。常温下搅拌1小时，荧光基团标记的化合物4用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，4000转/分钟，30分钟×3次。最后得到罗丹明、Cy5.5和DOTA-Gd螯合剂修饰的树枝状大分子4紫色溶液。每个G5分子上标记了约92个DOTA螯合剂。另外，平均有1.4个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到一个化合物分子上。最后的产率约为92％。

对比例1

如图2所示，为不带cRGDyK靶头的对照纳米探针的合成路线图，所述不带cRGDyK靶头的对照纳米探针(Den-PEG)的具体步骤为：

1、化合物5的合成：

0.7mg(1.24×10^-6mol，2.0倍.)罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于50μL无水DMF中，并缓慢逐滴加入搅拌中的1mL 17.9mg(6.2×10^-7mol)G5的0.1M HEPES溶液中，pH 8.3。常温下搅拌1h后，混合液用纯水稀释后转移到分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，4000转/分钟，30分钟×3次，以除去水溶性的小分子副产物。1.8mg(1.24×10^-6mol，2.0倍.)Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于50μL无水DMF中，同罗丹明-N-羟基琥珀酰亚胺酯一样加入到上述产物的1mL0.1M HEPES溶液中，pH 8.3。常温下搅拌1h后，这个连接有双荧光基团的树枝状大分子被超滤纯化得到化合物5的紫色溶液。平均有1.5个罗丹明和1.1个Cy5.5标记到一个化合物5分子上。产物冻干。

2、化合物6的合成：

化合物5溶解在2.0mL 1X PBS(pH 7.4)中，加入溶于2.0mL PBS中的12.4mg(6.2×10^-6mol，10倍，分子量为2kDa)PEG^2K-N-羟基琥珀酰亚胺酯。常温下搅拌1h。产物用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，4000转/分钟，30分钟×3次，得到的化合物6也为紫色溶液。产物冻干。图7为化合物6的¹H NMR核磁图。产物中dendrimer和PEG的比值通过3.3-2.2ppm处的dendrimer质子积分和3.7ppm处的PEG质子积分来计算，大约PEG/dendrimer约为10。

3、化合物7的合成：

化合物6溶于2mL 0.5M HEPES缓冲液中，pH 8.3。79mg(7.94×10^-5mol，128倍.)白色粉末的DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯逐渐加入以上溶液中。溶液的pH值由pH计监测，并用5.0M NaOH溶液调节在8.5左右。混合液在常温下搅拌3小时或者过夜，混合产物用纯水稀释，通过分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化。DOTA螯合剂连接到G5上的数量大约是95个。产物冻干。如图8所示，为化合物7的¹H NMR核磁图。DOTA标记在dendrimer的数量可以通过3.3-2.2ppm处的dendrimer及DOTA的质子积分来定量，约为95个。

4、化合物8的合成：

19.6mg Gd₂(CO₃)₃.(3.97×10^-5mol，64equiv.)加入到溶于2mL 0.1M HEPES(pH 8.3)溶液的化合物2中。此悬浊液在60℃下搅拌过夜。多余的Gd₂(CO₃)₃离心沉淀(2000rpm，8分钟)，然后上清液用纯水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤纯化，最后获得Den-PEG化合物。最后的产率约为90％。

实施例1的产物与对比例1的产物的各项性能对比如下：

1、纳米探针粒径分布和Zeta电位的测定如下：

纳米探针和未修饰的G5树枝状大分子在水溶液中的粒径通过动态光散射的方法测定。溶于蒸馏水的2.0mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液对设备进行校准。样品用孔径为0.45μm的滤膜纯化后并用1X PBS稀释到100g/mL。纳米探针的粒径和分布通过动态光散射仪加以测定。在测定纳米探针的表面电荷时，纳米探针溶液用0.45μm的滤头过滤并稀释到10mM的NaCl溶液中。

Den-RGD和Den-PEG的平均直径是11.1nm和8.6nm，平均Zeta电位是+10.4和+11.6mV。如图9所示，为Den-RGD的流体动力学粒径分布和zeta电位示意图，如图10所示，为Den-PEG的流体动力学粒径分布和zeta电位示意图。

2、用ICP-AES测定纳米探针中的Gd³⁺含量如下：

纳米探针中的Gd³⁺含量用Hitachi P-4010model ICP-AES(Inductively Coupled PlasmaAtomic Emission Spectroscopy，电感耦合等离子体发射光谱仪)进行测定，射频能量为1100W，喷雾器气流速度为0.9L/min。准备好用3％硝酸溶解的Gd³⁺浓度分别为1，5，10，20，50，100，200ppm的标准溶液，标绘相应的色谱峰来绘制标准曲线以对应Gd³⁺含量。0.1mM的纳米探针母液用3％的硝酸稀释100倍。样品的Gd³⁺含量通过对Gd³⁺标准曲线拟合得到。实验结果显示，Gd³⁺-DOTA配合物在探针Den-RGD和Den-PEG中的含量均平均达95个。

3、体外细胞毒性实验如下：

(1)细胞培养：原代C57小鼠肝星状细胞用最低基础培养基在35mm直径培养皿中单层培养，即用加有10％胎牛血清(FBS)、1％青、链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的高糖DMEM培养基(Gibico，USA)，置于有充分湿气的含5％CO₂的37℃培养箱中培养。当细胞长满80％的面积时可以消化收集，以使细胞保持在指数增长状态。

(2)体外细胞毒性实验：MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)细胞增殖实验用来测定用纳米探针处理后的细胞的活力。处于指数增长期的细胞单层用0.25％胰酶消化收集，得到单细胞悬液。用血细胞计数器和普通光学显微镜(OLYMPUS BH-2)来计数细胞。优化细胞数量以使得在整个MTT实验中，细胞处于指数增长期。因此，用适量细胞培养液重悬细胞，在96孔板的每个孔中加入含有约2×10³个细胞的100μL单细胞悬液。每个浓度准备了8个复孔。细胞贴壁24小时后，用纳米探针来处理这些细胞。样品溶液用

的0.22μm注射器式滤器过滤除菌，并且终浓度的梯度范围在0.05-10μM。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4天后，细胞用PBS冲洗干净，然后用MTT来测定细胞的活力。用纳米探针处理过的细胞的活力用未处理过的细胞的值来进行标准化。如图11所示，为细胞毒性实验曲线图；

4、模型小鼠肝MRI成像实验如下：

每只肝纤维化模型C57小鼠从尾静脉注射0.05mmol/kg[Gd³⁺]，总共0.25mL体积的纳米探针PBS溶液，收集注射前、后肝部动态T1加权像。观察T1加权的磁共振信号在注射后0-120分钟和24小时的增强情况。注射2min后，非特异性的增强使得两种纳米探针的信号增强基本相同，但是随着时间的推移，它们的差异越来越明显。Den-RGD的T1加权磁共振信号的增强很显著，肝/肌肉磁共振信号比的增强在24小时可以达到25±3.9％，而Den-PEG只能达到12.8±6.2％。如图12所示，为T1加权磁共振信号图。并且Den-RGD能在注射后2h清楚地显示弥漫的小血管，而Den-PEG则不能。图13为MRI显像图。

5、模型小鼠肝冰冻切片荧光显微镜观察如下：

体内成像研究后，小鼠被麻醉，用PBS进行心脏灌流，肝被小心地剥离出来，取材，用OCT包埋后迅速放入液氮中装有异戊烷的烧杯中速冻30s～1min。然后切成15μm厚的冰冻切片。切片被封片并用多光谱荧光显微镜观察。发现注射Den-RGD后，在纤维隔板处可以看到明显的星芒状荧光分布。而在注射Den-PEG后的组织切片中则不能观察到这种现象。Den-RGD主要沉积在增生的纤维组织处，这些增生的纤维组织将形成假小叶。如图14所示，为模型小鼠肝冰冻切片荧光显微镜观察图。

Claims (10)

1.一种用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，包括载体，所述载体连接荧光基团和磁共振造影基团，并经由桥连基团连接能够与肝纤维化/肝硬化中肝星状细胞表面上的受体相结合的靶向化合物基团。

2.如权利要求1所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述的载体为2-8代的PAMAM树枝状高分子。

3.如权利要求1所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述的荧光基团为羰花青类近红外荧光染料基团以及非近红外荧光染料基团中的至少一种。

4.如权利要求3所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述的羰花青类近红外荧光染料基团为IR783基团或Cy5.5基团。

5.如权利要求3所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述的非近红外荧光染料基团为罗丹明基团。

6.如权利要求1所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述的磁共振造影基团为钆配合物Gd-DOTA基团。

7.如权利要求1所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述靶向化合物基团为c(RGDyK)基团。

8.如权利要求7所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述c(RGDyK)的制备方法为：

第一步：将0.4重量份的取代度为0.6mmol/g的树脂-Gly用二氯甲烷冲洗并溶胀，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；

第二步：用20vol％哌啶脱保护，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与1-羟基苯并三唑混合，用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺溶解，其中，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐以及N，N-二异丙基乙胺与树脂-Gly的比例分别为：1.2mmol-1.3mmol∶0.4g，0.15g-0.2g∶0.4g，2.4ml-2.5ml∶0.4g，0.4ml-0.5ml∶0.4g；将所得溶液加入到第一步的树脂中，恒温振荡器上反应45分钟，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，进行茚三酮检测确定是否反应完全；

第三步：将Fmoc-Arg(Pbf)-OH依次替换为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(otBu)-OH，重复进行第二步，得到连接在树脂上的整条被保护线状肽链H-Asp(otBu)-D-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly(2-Cl-Trt)-OH；用20vol％哌啶脱保护，分别用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷冲洗，用二氯甲烷和三氟乙酸的混合液切割，切割液抽吸入装有吡啶和甲醇的烧瓶中，最后用甲醇冲洗树脂，冲洗液也抽吸入烧瓶中，旋蒸去除二氯甲烷和甲醇，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用蒸馏水沉淀出絮状粗品，用砂芯漏斗过滤得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸馏水，超声分散沉淀，冷冻干燥得到粗品；

第四步：将第三步所得的粗品0.19-0.2重量份溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入二氯甲烷，加入N，N-二异丙基乙胺0.019-0.02重量份以及六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷0.06-0.07重量份进行环化，常温下搅拌3～4小时，旋蒸去除二氯甲烷，加蒸馏水沉淀出多肽，用砂芯漏斗过滤得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸馏水，超声分散沉淀，冷冻干燥；用三氟乙酸和蒸馏水的混合物脱保护，常温下磁力搅拌3～4小时，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗过滤得沉淀，用蒸馏水溶解，制备型HPLC纯化、冷冻干燥得到c(RGDyK)。

9.如权利要求1所述的用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针，其特征在于，所述桥连基团为聚乙二醇基团。

10.权利要求1所述用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将靶向化合物溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺，加入溶于N，N-二甲基甲酰胺的马来酰亚胺-桥连基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯，常温搅拌反应得到与桥连基团相连的靶向化合物，加入溶于磷酸盐缓冲液的载体，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器用纯水进行超滤、纯化，去除水溶性的小分子副产物，冷冻干燥得到与靶向基团相连的载体；

第二步：将第一步中所得的与靶向基团相连的载体溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯，边加边搅拌，整个过程中加入氢氧化钠溶液使溶液pH值控制在8.4-8.6，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，去除没有结合的DOTA-N-羟基琥珀酰亚胺酯，冷冻干燥后溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，加入碳酸钆，60℃下搅拌过夜，离心沉淀除去多余的碳酸钆，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，冷冻干燥得到与靶向基团和磁共振造影基团相连的载体；

第三步：将荧光基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，将第二步得到的与靶向基团和磁共振造影基团相连的载体溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，滴加上述荧光基团-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，常温搅拌反应，用水稀释，用分子量10000Da截断的离心式过滤器超滤、纯化，得到与荧光基团、磁共振造影基团和靶向基团相连的载体，即为用于早期肝纤维化诊断的多模式靶向探针。

Images