CN100436477C - 含精-甘-天冬氨酸序列环肽及其主动靶向脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明属制药和临床药学领域，涉及一种含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的环肽及其主动靶向脂质体，制备方法和用途。所述环肽结构符合作为配基的要求，由酰胺键成环，空间构象稳定，不易降解，一端含有活性巯基，便于进行修饰，人工合成的功能肽，分子量小，不易引起免疫反应，作为配基与肝星状细胞(HSC)表面整合素受体结合，构建主动靶向脂质体，通过受体介导途径实现对实验性肝纤维化的细胞靶向治疗。本发明将RGD环肽标记的、载有干扰素的脂质体靶向到纤维化肝脏，经动物体内、外证实，具有治疗肝纤维化的用途，疗效良好。

Description

含精-甘-天冬氨酸序列环肽及其主动靶向脂质体
技术领域
本发明属制药和临床药学领域，涉及一种含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的整合素受体配体的多肽序列及其环合形式，以及构建整合素受体介导的、针对肝星状细胞的主动靶向脂质体和医药用途。具体涉及含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的环肽及其主动靶向脂质体，制备方法和治疗肝纤维化的用途。
背景技术
肝纤维化是一切慢性肝病共同病理学基础，是形成肝硬化的早期和必经阶段，据统计，其中25％～40％最终发展为肝硬化。其病理学变化可由不同病因所致，如病毒、乙醇、寄生虫等引起慢性肝损害后，激活肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)，促进以胶原为主的细胞外基质(ECM)合成增多、降解减少或代偿不足，从而使细胞外基质在肝脏内异常沉积引起肝纤维化。研究表明，HSC的增生和激活是肝纤维化发生的细胞学基础，是各种病因肝纤维化形成的共同中心环节(Frieman S.L.Semin Liver Dis.1990，10(1)：20-29)。因此针对HSC的靶向治疗有可能逆转肝纤维化。由于HSC位于肝脏窦周隙内，在整个肝脏细胞群中所占比例少(约5％)，设计靶向到HSC的特异性治疗存在困难。
靶向制剂可利用载体将药物选择性地积集于作用部位而发挥药效，以达到高效而降低毒副作用的目的，尤其是细胞毒性药物。成功的靶向制剂应具备定位蓄积、控制释药以及无毒、可生物降解三个要素。脂质体的靶向依其表面是否带有活性基团分为被动靶向、主动靶向。被动靶向脂质体不带有活性基团，是利用人体各器官的生理特性和差异而使脂质体选择性地富集于某些器官或病灶。而主动靶向是通过在脂质体表面引入活性介导基团(如配体、单克隆抗体等)，依靠其与细胞之间的亲和力，使得脂质体能够靶向到特异性的细胞。相对于被动靶向，主动靶向的选择特异性强，能将脂质体的病灶和器官靶向提高到细胞水平的靶向。理论上可以实现体内控释，是提高药效、降低毒性的最佳药剂学研究方向。
1990年Klibanov等(KlibanovAL，et al.FEBS Lett，1990，268(2)：235；Bume G，Biochim BiophysActa，1990，1029(1)：91)，研制出一种能在循环中存在更长时间的脂质体，其膜中含有棕榈酰葡萄糖苷酸或聚乙二醇(PEG)的类脂衍生物(如PEG-DSPE)，这类脂质体常称之为空间稳定脂质体(sterically stabilized liposome，SSL)或长循环脂质体(long circulating liposome，LCL)。由于它的表面含有的亲水基团高度水合，能有效地阻止血液中许多不同组分(Lasic DD，Martin FJ，Gabizon A，et al.Biochim Biophys Acta，1991，1070(1)：187)，特别是调理素与之结合，从而抑制单核吞噬细胞系统(MPS)对其的吞噬作用。由于SSL能延缓释药并提高对特定靶组织的选择性，使其在许多方面更适于应用。研究表明(LasicDD，et al.Biochim Biophys Acta，1991，1070(1)：187)，SSL优于普通脂质体(CL)之处在于延长了在循环中的滞留时间、可减少被MPS摄取的速度与程度、能增加靶部位如肿瘤组织及感染部位的吸收、在体内具有穿透生物屏障的能力以及具有在动物及人体内的非剂量依赖性，即具有线性药动学特性。
整合素(integrin)是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族，主要介导细胞与细胞外基质(ECM)的粘附，与整合素结合的配体是ECM。整合素有α、β两个亚单位，不同组合以不同的ECM为配基，实现不同的功能。精-甘-天门冬氨酸(RGD)三肽序列为整合素识别的共同结合位点。HSC表面可以表达整合素受体，静止态的HSC仅表达α1，其余亚单位表达较少或不表达；而激活态的HSC可以表达多种整合素受体。
目前尚无关于针对HSC、整合素受体介导的主动靶向脂质体治疗肝纤维化的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的环肽及其主动靶向脂质体，本发明将环肽与脂质体进行连接，并可进一步包裹药物如干扰素，能针对肝星状细胞表面上整合素受体，实现主动靶向治疗肝纤维化。本发明的进一步目的是提供所述环肽及其主动靶向脂质体的制备方法。
本发明所述的RGD环肽为含有八个氨基酸残基的寡肽，氨基酸序列为为*半胱-甘-精-甘-天冬-色-脯-赖氨酸*(C*GRGDSPK*)，其中*为成环位置。其中RGD序列是肝星状细胞表面整合素受体的结合位点。
上述RGD环肽通过半胱氨酸残基与赖氨酸残基以酰胺键(-CO-NH-)成环，使半胱氨酸一端含有游离巯基。
所述的RGD环肽氨基酸序列或为X*GRGDSPZ*，*表示成环位置，X代表半胱氨酸残基，含有一个游离的巯基，Z代表任意一个能与半胱氨酸残基成环的氨基酸。
所述的RGD环肽氨基酸序列或为X*YRGDYZ*，其中，*表示成环位置，X代表半胱氨酸残基，其含有一个游离的巯基，Y代表丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中至少一个氨基酸或者任意长度的氨基酸序列，不影响与靶向受体结合，Z代表任意一个能与半胱氨酸残基成环的氨基酸。
RGD环肽上的游离巯基可以与脂质体膜材料中的马来酰胺-聚乙二醇类脂衍生物(MAL-PEG-DOPE)相连，将RGD环肽连接于脂质体的表面上，反应方程式如下述。所述的MAL-PEG-DOPE属于生物可降解材料，主要通过肾脏排泄。
Figure C20051002465600051
本发明所述的人工合成的含有RGD序列环肽具有以下的优点：1.RGD环肽中含有的精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的是与HSC表面整合素受体特异性的结合位点，符合作为外源性配基的要求，即与HSC的结合具有特异性、时间和浓度的依赖性、饱和性以及竞争性抑制作用。2.RGD环肽中由酰胺键(-CO-NH-)成环，空间构象稳定，不易降解。3.RGD环肽中半胱氨酸的残基含有活性巯基(-SH)，便于进行修饰。4.RGD环肽属于人工合成的功能肽，分子量小，不易引起免疫反应。
本发明所述的脂质体采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压法制备。所述的脂质体包括普通脂质体(CL)、长循环脂质体(SSL)、RGD环肽修饰的CL(RGD-CL)、RGD环肽修饰的SSL(RGD-SSL)以及分别包裹干扰素的CL(CL-IFN)、SSL(SSL-IFN)、RGD环肽修饰的CL(RGD-CL-IFN)、RGD环肽修饰的SSL(RGD-SSL-IFN)。
所述的CL的膜材料由卵磷脂(EPC)、胆固醇(Chol)、马来酰胺-聚乙二醇类脂衍生物(MAL-PEG3340-DOPE)组成，其摩尔比为2∶1∶0.02。
所述的SSL的膜材料由EPC、Chol、单甲氧基聚乙二醇类脂衍生物(mPEG2000-DOPE)、MAL-PEG3340-DOPE组成，其摩尔比为2∶1∶0.1∶0.02。PEG占3.2mol％。
按照MAL-PEG-DOPE与RGD环肽摩尔比为10∶1将RGD环肽加入到制备CL或SSL的膜材料中，通过RGD环肽半胱氨酸的巯基与MAL-PEG-DOPE共价连接，即可将RGD环肽连接到脂质体表面。通过凝胶柱层析法去除未结合的RGD环肽，即可得到RGD-CL或RGD-SSL。
本发明进一步将待包封的干扰素(IFN)溶液分别加入到CL、SSL、RGD-CL或RGD-SSL中，冰浴下旋涡振荡30min，通过凝胶柱层析法除去未包入的IFN。干扰素的包封率为35.6％，载药率为104U IFN/μmol磷脂。
CL、SSL、RGD-CL、RGD-SSL、CL-IFN、SSL-IFN、RGD-CL-IFN和RGD-SSL-IFN通过挤压法粒子均匀一致，粒径范围为50～200nm，优选100nm。
本发明构建的针对肝星状细胞表面上整合素受体的主动靶向脂质体，通过受体介导途径实现了对实验性肝纤维化的靶向治疗作用。即借助HSC表面受体与人工合成的RGD环肽的特异性相互作用，将RGD环肽标记的、载有干扰素的主动靶向脂质体靶向到纤维化肝脏，取得了良好的抗纤维化疗效。
经体外实验，分离大鼠HSC，荧光示踪法证实，所述的主动靶向脂质体能够特异性地与HSC结合。
体内实验，SPET显像显示RGD-SSL主要分布于肝脏，持续达24小时，主要经肾脏和胆道排泄。通过胆总管结扎制备大鼠肝纤维化模型，采用尾静脉注射给药的方法，观察RGD-SSL-IFN对肝纤维化大鼠的治疗作用。结果显示治疗组肝功能指标、血清肝纤维化指标、肝组织羟脯氨酸含量和肝脏病理学改变均较SSL-IFN组有明显改善；肝脏I型胶原mRNA和肝星状细胞的α-激动蛋白表达量明显下降，显示了主动靶向脂质体对大鼠肝纤维化具有良好的治疗作用。
附图说明
图1是各组大鼠肝脏组织学染色，
其中，HE染色(×100)：肝纤维化组(A)；干扰素-脂质体组(C)；RGD环肽-脂质体-干扰素组(E)；Desmin染色(×400)：肝纤维化组(B)；干扰素-脂质体组(D)；RGD环肽-脂质体-干扰素组(F)。
图2是各组大鼠肝功能指标，
其中，1：假手术组；2：肝纤维化组；3：干扰素-脂质体组；4：RGD环肽-脂质体-干扰素组。与假手术组相比，△P＜0.05；与BDL组相比，*P＜0.05；与BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。(ALT：丙氨基氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；ALP：碱性磷酸酶；TBIL：总胆红素；γ-GT：γ谷氨酰转移酶)。
图3是各组大鼠血清肝纤维化指标，
其中，1：假手术组；2：肝纤维化组；3：干扰素-脂质体组；4：RGD环肽-脂质体-干扰素组。与假手术组相比，△P＜0.05；与BDL组相比，*P＜0.05；与BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。(HA：透明质酸；PCIII：III型前胶原；LN：层粘蛋白；C1v：IV型胶原)。
图4是各组大鼠肝组织羟脯氨酸(HYP)含量(mg/g肝组织)，
其中，1：假手术组；2：肝纤维化组；3：干扰素-脂质体组；4：RGD环肽-脂质体-干扰素组。与假手术组相比，△P＜0.05；与BDL组相比，*P＜0.05；与BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。
图5是各组大鼠肝组织I型胶原mRNA表达，
其中，1：假手术组；2：肝纤维化组；3：干扰素-脂质体组；4：RGD环肽-脂质体-干扰素组。A：I型胶原mRNA电泳条带；B：I型胶原mRNA/GAPDHmRNA相对灰度值。与假手术组相比，△P＜0.05；与BDL组相比，*P＜0.05；与BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。
图6是各组大鼠肝组织α肌动蛋白(α-SMA)的表达，
其中，1：空白对照；2：假手术组；3：肝纤维化组；4：干扰素-脂质体组；5：RGD环肽-脂质体-干扰素组。
具体实施方式
实施例1制备RGD多肽
利用文献报道的方法(Schnolzer M，Alewood P，Jones A，Alewood D，KentSB.Int J Pept Protein Res.1992，40(3-4)：180-93)，在蛋白合成仪上固相合成半胱-甘-精-甘-天冬-色-脯-赖硫脂PAM(CysGlyArgGlyAspSerProLys-SCH2CO-Leu-PAM)树脂。与文献不同的是，Boc-氨基酸(2.2mmol)在含缩合剂(HBTU 2.0mmol)与N，N-二异丙基乙胺(DIEA20％，v/v)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中活化3min，然后依次加入到树脂(0.25mmol)中反应10min。N-Boc保护基团用三氟乙酸(TFA)去除；合成的整个过程中，DMF与二氯甲烷(DCM)用来清洗树脂。所用氨基酸的侧链保护基为：Arg(Tosyl)，Asp(OcHxl)，Cys(4MeBzl)，Lys(2ClZ)，Ser(Bzl)。树脂合成完成后，将其在0℃于含5％对甲酚(p-cresol)的无水氟化氢中搅拌1h，冷乙醚沉淀得粗品，高压制备液相纯化。将纯化的样品溶于含6M盐酸呱啶(GuHCl)的0.25M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。然后加入2％(v/v)苯硫酚(thiophenol)。将溶液纯化、冷冻干燥得RGD环肽。将制得的RGD环肽与异硫氰荧光素(FITC)在pH9.0的磷酸盐缓冲液中反应，纯化、冷冻干燥得FITC-RGD环肽。经HPLC鉴定纯度＞95％。
实施例2制备脂质体
采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压法，通过如下步骤制备脂质体。
1.按2∶1∶0.1∶0.02(摩尔比)精密称取蛋磷脂(EPC)、胆固醇(Chol)、单甲氧基聚乙二醇-(mPEG2000-DOPE)、马来酰亚胺-聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MAL-PEG3450-DOPE)，溶于氯仿，40℃水浴旋转蒸发成透明薄膜，蒸干有机溶剂。加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4，22℃)充分水化。用Mini Extruder反复挤压15次过100nm滤膜，得到均一的长循环脂质体(SSL)。PEG占3.2mol％。
按2∶1∶0.02(摩尔比)精密称取EPC、Chol、MAL-PEG3450-DOPE，溶于氯仿，40℃水浴旋转蒸发成透明薄膜，蒸干有机溶剂。加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4，22℃)充分水化。用Mini Extruder反复挤压15次过100nm滤膜，得到均一的普通脂质体(CL)。
将RGD环肽按照与MAL-PEG-DOPE摩尔比10∶1加入CL或SSL的PBS溶液中，室温(25℃)振荡过夜，通过凝胶柱(CL-4B)层析法去除未结合的RGD环肽，即可得到RGD-CL或RGD-SSL。
将待包封的干扰素(IFN-α1b)溶液分别加入到CL、SSL、RGD-CL、RGD-SSL中，冰浴下旋涡振荡30min，通过凝胶柱(CL-4B)层析法除去未包入的IFN，即可制得CL-IFN、SSL-IFN、RGD-CL-IFN或RGD-SSL-IFN。
在制备CL、SSL、RGD-CL或RGD-SSL的过程中，以钙黄绿素(calcein，CF)溶液(50mmol/L)代替PBS作为水化液，其余步骤同前，即可制得CF脂质体。以荧光分光光度计测得CF的包封率为10％(λex＝492nm，λem＝512nm)。
2.形态和粒径研究：取少量SSL和RGD-SSL稀释后，用1％磷钨酸负染，透射电子显微镜进行观察。可见脂质体经RGD环肽修饰以及包裹干扰素后形态未改变，且分布均匀，呈典型的指纹结构。用激光粒度散射仪测定脂质体平均粒径为98.1±23.1nm。
包封率的测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定干扰素包封率为35.6％，载药率为104U IFN/μmol磷脂。采用病毒抑制法测定脂质体包裹干扰素后活性不变。
3.其他特性：选择测定5批RGD-SSL-IFN进行检测。pH计测定的pH值为7.21±0.08。采用醋酸纤维素膜电泳法测定RGD-SSL-IFN带负电荷(测定条件：上下电极液0.01mol/L，pH 7.4磷酸盐缓冲液，电压200V)。按照细管法原理用乌氏粘度计测定相对粘度，为(1.0323×10-3±3.7460×10-5)Pa.s-1。用比重瓶法测定相对密度为1.0025±1.37×10-4。
实施例3采用荧光素和放射性同位素示踪法考察人工合成的含有RGD序列环肽作为整合素受体配基可行性
根据受体-配体结合的特性，即特异性、浓度和时间依赖性、竞争性抑制作用，将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的RGD环肽与HSC共同孵育。结果显示RGD环肽与HSC结合性质符合作为受体配基的基本特征。采用3H标记RGD环肽进行放射性配基Scatchard分析，平衡解离常数(Kd)和每个细胞上的结合位点数(Bmax)分别为7.05×10-9mmol/L和6.79×105。
步骤如下：
1.分离大鼠HSC
2.荧光示踪法考察激活态HSC与环肽的结合
将HSC接种于6孔板上，贴壁后，以0.25％FBS-DMEM培养过夜。实验前用1％BSA-DMEM预封闭。以流式细胞仪检测HSC结合的相对荧光强度。
2.1浓度-效应关系：每孔加入不同浓度的环肽，分别于4℃和37℃培养4h。
2.2时间-效应关系：每孔加入环肽200nmol/L，分别于4℃和37℃分别孵育0～8h。
2.3竞争抑制试验：每孔先加入不同浓度未标记环肽，然后于反应体系中加入200nmol/L FITC标记的环肽，再结合4h。
3.放射性配基结合分析法测定RGD环肽与HSC结合的平衡解离常数(Kd)和每个细胞上的结合位点数(Bmax)
采用氚标记cRGD(3H-cRGD)。将0.5ml细胞悬液分别与不同浓度3H-cRGD0.1ml置于反应管内，补足体积至1ml，4℃孵育3h，冰Hank’s液中止反应，离心弃上清，沉淀与甲酸水浴，测量沉淀放射性计数。各水平样品均设3复管，设有总结合管(Total binding，TB)和非特异性结合管(Non-specific binding，NSB)。按Scatchard模型求出HSC与3H-cRGD结合的解离常数Kd和每个细胞表面最大结合位点(Bmax)。
实施例4采用荧光素示踪法表征表面修饰有RGD环肽脂质体与HSC结合的特性
按照实施例2制备RGD环肽修饰的包裹钙黄绿素的脂质体(RGD-SSL-CF)和包裹钙黄绿素的脂质体(SSL-CF)。将RGD-SSL-CF和SSL-CF分别与HSC共同孵育4h。结果显示HSC摄取RGD-SSL-CF为SSL-CF的5.4倍；RGD-SSL-CF能够特异性的与HSC结合。
步骤如下：
1.分离大鼠的HSC与培养
2.荧光示踪法考察激活态HSC与RGD环肽修饰的包裹钙黄绿素的(RGD-SSL-CF)的结合
将HSC接种于33cm2细胞培养皿上，以0.25％FBS-DMEM培养过夜。实验前用1％BSA-DMEM预封闭。分别加入RGD-SSL-CF和SSL-CF共同孵育4h。刮除细胞，溶解于PBS(1％Triton X-100)。荧光分光光度计法检测细胞结合的荧光强度(Ex＝492nm，Em＝512nm)。以荧光显微镜显示RGD-SSL-CF与HSC结合情况。
实施例5 99m锝(99mTc)标记脂质体
将DTPA-DOPE与磷脂按照1∶10(摩尔比)加入脂质体膜材料中，按照实施2制备脂质体。采用氯化亚锡(SnCl2)还原法进行RGD环肽-脂质体标记99mTc。
可通过如下步骤：将SnCl2溶解于0.15mol/L的盐酸(HCl)溶液中，制备成10ug/ul的SnCl2-HCl溶液。按照0.5ml脂质体加入SnCl2100ug，再加入99mTcO4-洗脱液2mCi，混匀，室温放置15分钟即可备用。
实施例6 99mTc标记RGD环肽修饰的脂质体(99mTc-RGD-SSL)在正常和肝纤维化大鼠体内分布及显像研究
采用尾静脉注射法，考察99mTc-RGD-SSL在正常大鼠和肝纤维化大鼠体内分布行为及SPET显像研究。结果显示RGD-SSL主要在肝脏浓集，持续达24小时，经肾脏和胆道排泄。
通过如下步骤：
通过正常大鼠和肝纤维化大鼠尾静脉分别注射99mTc-RGD-SSL和99mTc-SSL0.5ml(2mCi)，于不同时间点进行SPECT(single photon emission computedtomography)扫描显像，仪器为Philips-IRIX三探头SPECT。探头与大鼠保持2cm的距离，采集大鼠的正位相，采集矩阵为512×512，50秒/帧，绘制出各脏器感兴趣区，测定某脏器总计数/脏器感兴趣区大小(counts/pixel)，即每个脏器每象素的计数。
实施例7RGD环肽修饰的干扰素脂质体对肝纤维化大鼠的治疗作用
采用尾静脉注射给药法，观察RGD环肽-脂质体-干扰素(RGD-SSL-IFN)对肝纤维化大鼠的治疗作用。结果显示治疗组肝功能指标、血清肝纤维化指标、肝组织羟脯氨酸含量和肝脏病理学改变均较干扰素-脂质体(SSL-IFN)组有明显改善；肝脏I型胶原mRNA和肝星状细胞的α-激动蛋白表达量明显下降(图1～6)。
通如下过步骤：
1.动物模型的制备和实验分组大鼠随机分成4组，假手术组、模型(BDL)组、IFN-SSL治疗(BDL+IFN-SSL)组、干扰素-脂质体治疗(BDL+IFN-RGD-SSL)组各10只。除假手术组外，其余各组均行双重结扎并剪断胆总管。假手术组，剖腹后暴露、游离胆总管上段约1cm，随即关腹。于结扎之日起BDL+IFN-SSL组每周尾静脉注射1次0.2ml(相当于5×104U IFN)的IFN-SSL，；BDL+IFN-RGD-SSL组每周尾静脉注射1次0.2ml IFN-RGD-SSL(相当于5×104U IFN)的IFN-RGD-SSL；BDL组和假手术组分别给予等量的生理盐水处理。各组大鼠连续实验4周后，最后1次给药24h后处死动物，留取血清和肝组织。
2.观察指标及检测的内容和方法
2.1观察大鼠一般状态以及黄疸情况。
2.2HE和α-SMA免疫组织化学染色观察各组大鼠肝组织病理改变。
2.3采用自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(AKP)、γ-GT(γ-谷氨酰胺)。
2.4放免法测定血清透明质酸(HA)、III型前胶原(PCIII)、层粘蛋白(LN)、IV型胶原(CIV)含量。
2.5采用比色法测定肝组织匀浆羟脯氨酸(Hyp)，以每g肝组织Hyp含量表示。
2.6RT-PCR法检测肝组织I型胶原mRNA表达。
肝组织总RNA的提取、cDNA的合成、共扩增定量PCR及扩增产物定量分析，扩增产物以凝胶系统分析，胶原mRNA相对含量用I型胶原吸光度×面积与GAPDH吸光度×面积的比值表示。
2.7Western blot检测HSCα-SMA表达。
采用两步胶原酶灌注、密度梯度离心法分离大鼠HSC。提取蛋白，测定蛋白浓度，进行变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转在尼龙膜上，5％脱脂奶粉封闭，用一抗(兔抗鼠抗体)和辣根酶标记的二抗(驴抗兔抗体)孵育，曝光显影。采用Biomad公司图形分析软件对Western blot的特异性条带进行灰度扫描，以积分吸光度A×mm2表示特异性条带信号的强弱，从而对目的蛋白表达水平进行半定量比较。

Claims (3)

1、一种含有精-甘-天冬氨酸序列的环肽，其特征是含有精-甘-天冬氨酸序列，由酰胺键-CO-NH-成环，其半胱氨酸一端含有活性巯基，而且所述的环肽的氨基酸序列为X*GRGDSPZ*，其中，*表示成环位置，X代表半胱氨酸残基，其含有一个游离的巯基，Z代表至少一个氨基酸或足够长的氨基酸序列。
2、按权利要求1所述的含精-甘-天冬氨酸序列的环肽，其特征是所述的环肽的氨基酸序列为X*GRGDSPK*，其中，*表示成环位置，X代表半胱氨酸残基，其含有一个游离的巯基。
3、权利要求1或2所述的含精-甘-天冬氨酸序列的环肽在制备与肝星状细胞表面整合素受体结合的外源性配基中的用途。
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