CN118005738A - 一种含氟自组装多肽探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含氟自组装多肽探针及其制备方法和应用。所述含氟自组装多肽探针包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子和PEG亲水片段；所述肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子依次连接，所述PEG亲水片段偶联于肿瘤特异性靶点识别肽和肿瘤微环境特异性水解肽之间。在主动靶向作用和肿瘤微环境高表达水解酶的作用下，含氟自组装多肽探针的自组装作用使其在肿瘤部位形成纳米纤维，同时具有更长时间的滞留效果，进而产生最优信噪比，为肿瘤诊断以及术中导航切除提供新的方式。

Description

一种含氟自组装多肽探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于技术领域，涉及一种含氟自组装多肽探针及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤的早期灵敏性诊断可以为肿瘤的检测和手术切除提供重要依据，也是目前癌症疾病研究的重点之一。传统的医学影像检查如X射线检查、计算机断层(CT)扫描和磁共振成像(MRI)扫描可作为有效的诊断方式在肿瘤检查和手术切除中使用，但由于其灵敏性和特异性的局限，仍需要进一步开发高效的肿瘤成像技术。
近年来，分子影像技术的快速发展为细胞、分子水平评估癌症的生理病理变化提供了无创、实时的可视化手段，显著提升了当前临床癌症的诊治水平。其中，基于荧光生物成像的检测技术，具有灵敏度高、操作简单及时空分辨率优异等特性，常被用于肿瘤检测，并为辅助医生在术中区分肿瘤与正常组织提供了较为可靠的依据。目前，FDA批准的荧光分子如吲哚菁绿(ICG)和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)已被临床应用在荧光引导肿瘤切除的手术中。然而，此类荧光分子的代谢特征使其在肿瘤部位的滞留时间较短，且在代谢性器官中仍有高信号背景，这大大的限制了其在术中导航的实际应用。
增加肿瘤探针在肿瘤组织的聚集和延长其滞留是提高肿瘤诊断效果的有效途径。为了提高药物在肿瘤部位的滞留时间，许多成像策略已被开发，旨在提高探针的特异性靶向并增强于肿瘤病灶的滞留效果。如CN117430670A公开了一种HER2靶向肽分子及其应用，其具有以下通式：X-peptide、X-L-peptide、peptide-X或peptide-L-X，其中，X表示报告功能单元或治疗功能单元，其中，所述报告功能单元选自荧光标记单元、诊断用放射性核素标记单元和核磁标记单元，所述治疗功能单元选自治疗用放射性核素标记单元和具有生理功能的化学药物；L表示连接基团；peptide表示衍生自多肽Herceptide的单元。能够特异性地识别、靶向HER2受体，在肿瘤部位有效聚集和滞留，可以用于肿瘤靶向诊疗。
综上所述，开发新型的具备特异性和长滞留效果肿瘤探针，丰富检测手段，对于肿瘤的治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种含氟自组装多肽探针及其制备方法和应用，设计具有肿瘤表面受体靶向功能的含氟自组装多肽探针，在主动靶向作用和肿瘤微环境高表达MMP-2的作用下，探针分子的自组装作用使其在肿瘤部位形成纳米纤维，同时具有更长时间的滞留效果，进而产生最优信噪比，为肿瘤诊断以及术中导航切除提供新的方式。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种含氟自组装多肽探针，所述含氟自组装多肽探针包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子和PEG亲水片段；所述肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子依次连接，所述PEG亲水片段偶联于肿瘤特异性靶点识别肽和肿瘤微环境特异性水解肽之间。
本发明中，设计含氟自组装多肽探针，结构示意图如图1所示，利用肿瘤特异性靶点识别肽，可实现分子对肿瘤细胞表面受体的特异性靶向，其目的在于将功能分子特异性的递送到肿瘤部位，解决分子特异性差的问题；设计肿瘤微环境特异性水解片段，实现分子在肿瘤部位特异性响应并发生组装行为，其目的在于促进分子在肿瘤部位特异性的长效滞留，解决代谢性器官肿瘤信噪比低的问题；设计含氟的自组装多肽片段，实现分子在肿瘤部位的高效组装，其目的在于利用氟的强疏水性、碳氟键的高键能等性质提供稳定的组装结构，同时引入非天然氨基酸提高多肽的水解稳定性，解决探针分子在肿瘤部位稳定性差的问题。设计PEG亲水片段，实现分子在肿瘤部位响应前后可发生组装形貌的转变，并延长探针分子在体内的循环时间。因此，本发明提出的含氟自组装多肽探针可实现特异性靶向肿瘤细胞，并在肿瘤部位形成纳米组装体，增加肿瘤部位的荧光信噪比，符合“精准医疗”理念；含氟非天然氨基酸的引入可提高探针分子的血浆半衰期，并在肿瘤部位构建稳定组装结构，实现肿瘤探针的长滞留效果，进一步延长肿瘤成像的时间窗口，可作为肿瘤检测和术中导航切除的新方法。
本发明中，所述肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽和含氟自组装多肽，含氟自组装多肽与探针分子均通过酰胺键连接；多肽骨架与PEG亲水片段通过硫醚键连接。
优选地，所述肿瘤特异性靶点识别肽包括靶向识别肿瘤细胞表面特异性表达的蛋白受体的多肽。
优选地，所述特异性表达的蛋白包括整合素和/或HER-2。
优选地，所述肿瘤特异性靶点识别肽包括RGD或YLFFVFER。
优选地，所述肿瘤微环境特异性水解肽包括肿瘤微环境高表达酶特异性识别序列；
优选地，所述肿瘤微环境特异性水解肽包括PLGVRG或PLGLAG。
优选地，所述含氟自组装多肽包括β-sheet肽段。
优选地，所述β-sheet肽段包括KLVF’F’、PFB-KLVFF、PFB-KLVFF’或PFB-KLVF’F’，PFB为五氟苯基，F为苯丙氨酸，F’为五氟-L-苯基丙氨酸。
优选地，所述探针分子包括荧光基团、核素或金属配体中任意一种。
优选地，所述探针分子包括Cy5、Cy7或FITC。
优选地，所述的PEG亲水片段包括聚乙二醇。
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为400～2000，包括但不限于500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1500、1600、1800或1900。
优选地，所述自组装多肽探针的分子式包括包括以下任意一种：
(1)Cy5-PFB-KLVF’F’-PLGVRG-(PEG)CRGD；
(2)Cy5-PFB-KLVFF-PLGLAG-(PEG)CRGD；
(3)Cy7-KLVF’F’-PLGLAG-(PEG)CYLFFVFER；
(4)FITC-PFB-KLVFF’-PLGVRG-(PEG)CRGD。
优选地，所述自组装多肽探针的结构式如式I所示。
其中，R1、R2各自独立地为H5或F(氟)5；R3为H或式IV；R4为Cy5(式V)、Cy7(式VI)或FITC(式VII)。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的含氟自组装多肽探针的制备方法，所述制备方法包括：
通过多肽固相合成法合成得到依次连接的肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽和含氟自组装多肽，在肿瘤特异性靶点识别肽和肿瘤微环境特异性水解肽之间偶联PEG亲水片段，在含氟自组装多肽上偶联探针分子，得到所述含氟自组装多肽探针。
本发明通过多肽固相合成法以及共价偶联合成法得到包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子和PEG亲水片段的自组装多肽探针。
第三方面，本发明提供第一方面所述的含氟自组装多肽探针在制备用于肿瘤诊断的产品中的应用。
本发明设计含氟自组装多肽探针，通过其含氟多肽序列的自组装作用，探针分子能够在肿瘤部位快速形成纳米纤维并具有长滞留效果，对肿瘤部位进行有效成像。所述含氟自组装多肽探针同时具有生物相容性高、渗透性高、特异性强的优点，在肿瘤精准诊断领域具有广阔的应用前景。
第四方面，本发明提供一种用于肿瘤诊断的产品，所述产品包括第一方面所述的含氟自组装多肽探针。
与现有技术相比，本发具有以下技术效果：
本发明提供的含氟自组装多肽探针包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子以及PEG亲水片段。通过肿瘤靶点识别肽，探针分子可在肿瘤部位发生特异性聚集；通过在肿瘤微环境的酶切作用以及含氟多肽的自组装作用，探针分子可在肿瘤部位快速聚集并实现更长时间的滞留效果，同时可增加肿瘤部位的荧光强度，从而提高肿瘤部位的荧光信噪比，对于肿瘤精准诊断领域有重要意义。此外，自组装多肽探针具有较好的生物相容性，对体内的毒副作用较小。
附图说明
图1为含氟自组装多肽探针结构示意图；
图2为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针的MALDI-TOF-MS结果图；
图3为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针酶切反应前的TEM验证结果图；
图4为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针酶切反应后的TEM验证结果图；
图5为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针酶切反应前后的荧光光谱验证结果图；
图6为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性细胞的细胞毒性水平验证结果图；
图7为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性B16F10细胞的靶向效果验证结果图，比例尺为10μm；
图8为式Ⅱ分子含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性HeLa细胞球的滞留效果验证结果图，比例尺为100μm；
图9为图8的荧光强度变化统计图；
图10为含氟自组装多肽探针PFB-RGD-2对αvβ3integrin阳性HeLa细胞球的滞留效果验证结果图，比例尺为100μm；
图11为图10的荧光强度变化统计图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明具体实施例中，通过多肽固相合成法以及共价偶联合成法得到包括肿瘤靶向识别单元、酶响应单元、含氟自组装单元、探针分子及亲水片段PEG的自组装多肽探针。多肽固相合成法是从多肽链的C端向N端方向合成，采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护N端的氨基酸，通过KaiserTest检测是否有伯氨基的存在。在伯氨基裸露的情况下，1.5mL离心管中含有检测试剂的树脂的颜色为深紫色；在Fmoc保护氨基的存在情况下，则树脂为无色。其中Kaiser Text含有三种试剂分别命名为A、B、C，使用时各取一滴混合。三种试剂的配方为：A:0.5g的茚三酮溶于10mL无水乙醇；B:20g苯酚溶于5mL无水乙醇；C:0.1g抗坏血酸溶于5mL无水乙醇。
实施例1
本实施例进行含氟自组装多肽探针及其酶切后分子的制备。
自组装多肽分子探针Cy5-PFB-KLVF’F’-PLGVRG-(PEG2000)CRGD[五氟苯基(PFB)，五氟-L-苯基丙氨酸(F’)]，其结构式可由式Ⅱ表示，以下简称为PFB-RGD。
合成方法如下所示。
(1)溶胀树脂：称取300mg的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂放入多肽合成管中，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶胀3h。
(2)脱保护：先用二氯甲烷(DCM)和DMF交替反复冲洗3次，后在多肽合成管中加入脱保护剂[无水哌嗪:1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU):DMF＝5:2:93]，在摇床上摇晃15min，脱掉N端的Fmoc基团。
(3)检测：用DCM和DMF交替反复冲洗3次，后取A、B、C试剂各一滴以及少量树脂加入到1.5mL离心管，将离心管在沸水中加热1min。如果树脂颜色变为深紫色，则证明Fmoc保护基脱除。
(4)偶联：称取相对于树脂载量10倍当量的氨基酸和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)于15mL离心管中，然后加入10mL的偶联剂[DMF:N-甲基吗啉(NMM)＝19:1]预反应10min，再倒入多肽合成管反应2h。
(5)检测：用DCM和DMF交替反复冲洗3次，后取A、B、C试剂各一滴以及少量树脂加入到1.5mL离心管，将离心管在沸水中加热1min。如果树脂颜色无变化，则证明氨基酸已偶联完成。
(6)循环偶联：重复步骤(2)、(3)、(4)、(5)，偶联完成多肽序列KLVF’F’-PLGVRG-CRGD，检测至K氨基酸偶联完成后，用脱保护剂将Fmoc保护基团脱去。重复(2)，进行检测。
(7)偶联五氟苯基(PFB)：于多肽合成管中将脱去Fmoc保护基团的KLVF’F’-PLGVRG-CRGD用无水DCM冲洗3次。取8mL无水DCM于10mL离心管中，依次加入100μL的五氟苯甲酰氯，200μL的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，混匀后，倒入多肽合成管反应1h。重复(5)，进行检测。若树脂颜色无变化，证明五氟苯基已偶联完成。
(8)收缩：用甲醇收缩树脂15min，然后将收缩好的树脂转移至10mL的血清瓶，瓶中加入磁子。
(9)裂解：加入3mL的裂解液[超纯水：乙二硫醇：三氟乙酸(TFA)＝2.5:2.5:95]，在冰浴中磁力搅拌3h，后抽滤，用TFA润洗血清瓶，再将TFA用氮气吹干，加入冰乙醚，使多肽在乙醚中析出。将多肽转移至离心管，4℃，8000r·min-1条件下离心，重复三次，再将多肽转移至1.5mL离心管，用封口膜封口，过夜，使乙醚挥发完全，最终得到固体样品。
(10)偶联PEG2000：将多肽固体样品配制为二甲基亚砜(DMSO)溶液，加入1-2μL三(2-羧乙基)膦(TCEP)反应10min，后加入与DMSO溶液等体积的超纯水，超声至体系完全混匀。随后加入等摩尔量的马来酰亚胺-PEG2000-COOH的DMSO溶液，过夜搅拌反应。反应完成后，离心浓缩得到PFB-KLVF’F’PLGVRG-(PEG2000)CRGD。
(11)偶联Cy5：将步骤(10)得到的样品配制为DMSO溶液，加入等摩尔量的Cy5-SE，并在pH＝9的缓冲液体系下过夜反应。反应完成后，透析冻干，最终得到自组装多肽探针分子，置于-20℃保存。
式Ⅱ酶切后的分子为Cy5-PFB-KLVF’F’-PLG，可由式Ⅲ表示，以下简称为PFB-PLG。
式Ⅲ具体制备方法如下所示。
(1)树脂活化
称量300mg的Fmoc-Gly-Wang resin树脂于多肽合成管中，加入DMF溶胀3h，溶胀结束后使用DMF和DCM交替冲洗3次后由真空泵抽干管中液体，再在多肽合成管中加入脱保护剂，反应15min后，使用DMF和DCM交替冲洗3次。取约10颗树脂于1.5mL离心管中，加入3滴Kaiser检测液，将离心管放置在沸水浴中加热1min，如果树脂颜色变为深紫色，则证明Fmoc保护基脱除，后续进行氨基酸的循环偶联。
(2)氨基酸缩合
按KLVF’F’PLG的多肽序列，称取相对于树脂载量10倍当量的氨基酸和HBTU于15mL离心管中，加入10mL偶联剂预反应10min，再倒入多肽合成管反应2h。反应完成后，使用DMF和DCM交替冲洗3次后，取约10颗树脂于1.5mL离心管中，加入3滴Kaiser检测液，将离心管放置在沸水浴中加热1min，如果树脂颜色无变化，证明缩合反应成功。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc脱保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个K氨基酸反应完毕，用脱保护剂将Fmoc保护基团脱去，进行KaiserTest。
(3)偶联五氟苯基(PFB)
于多肽合成管中将脱去Fmoc保护基团的KLVF’F’PLG用无水DCM冲洗3次。取8mL无水DCM于10mL离心管中，依次加入100μL的五氟苯甲酰氯，200μL的DIPEA，混匀后，倒入多肽合成管反应1h。反应完成后进行KaiserTest，若树脂颜色无变化，证明五氟苯基已偶联完成。
(4)多肽切割
用甲醇收缩已完成五氟苯基偶联的树脂15min，然后将收缩好的树脂转移至10mL的血清瓶，瓶中加入磁子。加入3mL的裂解液[超纯水：TFA＝5:95]，在冰浴中磁力搅拌3h，后抽滤，用TFA润洗血清瓶，再将TFA用氮气吹干，加入冰乙醚，使多肽在乙醚中析出。将多肽转移至离心管，4℃，8000r·min-1条件下离心，重复三次，再将多肽转移至1.5mL离心管，用封口膜封口，过夜，使乙醚挥发完全，最终得到固体样品。
(5)偶联Cy5
将步骤(4)得到的固体样品配制为DMSO溶液，加入等摩尔量的Cy5-SE，并在pH＝9的缓冲液体系下过夜反应。反应完成后，透析冻干，最终得到式Ⅲ分子，置于-20℃保存。
实施例2
本实施例进行含氟自组装多肽探针的制备。
自组装多肽分子探针Cy5-PFB-KLVFF-PLGLAG-(PEG1000)CRGD[五氟苯基(PFB)]，简称为PFB-RGD-2。
制备流程参照实施例1即可。
实施例3
本实施例进行含氟自组装多肽探针的制备。
自组装多肽分子探针Cy7-KLVF’F’-PLGLAG-(PEG1000)CYLFFVFER[五氟-L-苯基丙氨酸(F’)]。
制备流程参照实施例1即可。
实施例4
本实施例进行含氟自组装多肽探针的制备。
自组装多肽分子探针FITC-PFB-KLVFF’-PLGVRG-(PEG400)CRGD[五氟苯基(PFB)，五氟-L-苯基丙氨酸(F’)]。
制备流程参照实施例1即可。
实施例5
本实施例进行不含氟自组装多肽探针的制备。
自组装多肽分子探针Cy5-KLVFF-PLGVRG-(PEG2000)CRGD和Cy5-KLVFF-PLGLAG-(PEG1000)CRGD，分别简称为RGD和RGD-2，用于后续对照实验验证。
制备流程参照实施例1即可。
实施例6
本实施例进行含氟自组装多肽探针分子的MALDI-TOF-MS验证。
对实施例1制备的含氟自组装多肽探针分子的分子量验证。
具体操作方法：将式Ⅱ分子配制为10mg/mL的四氢呋喃溶液，取1.5μL溶液进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定，如图1所示，结果表明在质荷比为4294-4863范围内出现质谱信号，与式Ⅱ分子分子量相符，可判断为式Ⅱ分子信号峰，实施例2-4制备探针结果与之类似。
实施例7
本实施例进行含氟自组装多肽探针酶切反应前后的TEM验证。
具体制样过程为：取30μL样品溶液，滴在2枚230目的碳膜铜网上，等待25min使样品沉降在铜网上，吸去样品。用100μL去离子水将铜网洗涤1次，后吸干液体，用醋酸双氧铀溶液染色2min，随后用滤纸吸干铜网，静置，干燥。用透射电子显微镜(TEM)实时CCD成像。
对实施例1制备的含氟自组装多肽探针的酶切反应前后形貌验证。式Ⅱ分子在PBS缓冲液中组装3h的形貌(如图2)以及37℃条件下，式Ⅱ分子在150ng·mL-1的MMP-2溶液中孵育6h的形貌(如图3)。
由图2和图3可知，本发明中含氟自组装多肽探针在溶液中分散良好，并在MMP-2酶切反应后形貌转变为纳米纤维，实施例2-4制备探针结果与之类似。
实施例8
本实施例进行含氟自组装多肽探针酶切反应前后的荧光光谱验证。
对实施例1制备的含氟自组装多肽探针的酶切反应前后荧光光谱验证。
配置50μM式Ⅱ分子的PBS溶液以及37℃条件下50μM式Ⅱ分子在150ng/mL的MMP-2溶液中孵育6h的溶液。分别取400μL上述两种制备条件的样品溶液于石英比色皿，用荧光分光光度计测定荧光光谱，激发波长650nm，测定发射波长范围655-700nm。
如图4所示，含氟自组装多肽探针在酶切反应及发生自组装行为后，探针分子Cy5的荧光信号与酶切反应前相比几乎无变化，实施例2-4制备探针结果与之类似。
实施例9
本实施例进行含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性细胞毒性水平的验证。
本实施例对实施例1得到的含氟自组装多肽探针，进行体外αvβ3integrin阳性细胞毒性水平的鉴定。
采用CCK-8法检测含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性细胞毒性水平的测定。将HeLa细胞(αvβ3integrin阳性)和B16F10细胞(αvβ3integrin阳性)以每孔5×103的密度接种在96孔板中，在完全培养基中培养24h。之后将完全培养基更换为含有不同梯度浓度的含自组装多肽探针的培养基继续培养24h。然后除去含有药物的培养基，更换为含10％CCK-8的新鲜培养基继续培养2h。最后使用酶标仪在450nm的测试波长下测定样品孔吸收值(A样品)，CCK-8溶液对照孔吸收值(A空白)和细胞对照孔吸收值(A对照)。细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％。
如图5所示，含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞无毒性，实施例2-4制备探针结果与之类似。
实施例10
本实施例进行含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞靶向效果的验证。
本实施例对实施例1得到的式Ⅱ含氟自组装多肽探针和式Ⅲ酶切后分子，进行对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞靶向效果的鉴定。
分别将B16F10细胞置于三个共聚焦显微镜培养皿中培养24h，密度约为1×104个。分别将10μM含氟自组装多肽探针PFB-RGD(式Ⅱ)，c(RGDfk)(αvβ3integrin抑制剂)与10μM含氟自组装多肽探针PFB-RGD(式Ⅱ)，10μM式Ⅲ酶切后分子PFB-PLG与细胞孵育3h，后用Hoechst 33342荧光探针与细胞孵育30min。最后，用PBS清洗细胞3次。用多光束激光共聚焦成像系统(UltraVIEW VoX)和油性60倍物镜成像。
由图6可知，含氟自组装多肽探针可靶向αvβ3integrin阳性的B16F10细胞；当存在αvβ3integrin抑制剂时，含氟自组装多肽探针无靶向αvβ3integrin阳性的B16F10细胞情况；当含氟自组装多肽探针无肿瘤特异性靶点识别单元时，多肽探针无法靶向αvβ3integrin阳性的B16F10细胞，实施例2-4制备探针结果与之类似。
实施例11
本实施例进行含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞球滞留效果的验证。
本实施例对实施例1得到的式Ⅱ含氟自组装多肽探针PFB-RGD和实施例5得到的不含氟自组装多肽探针RGD，进行对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞球滞留效果的鉴定。
使用3D细胞培养包被试剂盒培养HeLa细胞球。在已形成完整细胞球的96孔培养板中加入终浓度为20μM的PRB-RGD和RGD，孵育3h，并加入明胶酶溶液使其终浓度为150ng/mL，以模拟肿瘤微环境高表达的MMP-2。然后，用PBS洗涤3次，使用200μL枪头将细胞球小心转移至激光共聚焦培养皿中，使用CLSM(UltraVIEWVoX,Perkin Elmer)在10倍物镜下进行细胞成像。此时间点记为0d(天)，随后将细胞球转移回培养板中在完全培养基下继续培养，并在1d，2d和3d在相同成像条件下分别进行细胞球观察。
由图8和图9可知，含氟自组装多肽探针PFB-RGD相比不含氟自组装多肽探针RGD可在αvβ3integrin阳性的HeLa细胞球中滞留更长时间。
实施例12
本实施例进行含氟自组装多肽探针对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞球滞留效果的验证。
本实施例对实施例2得到的含氟自组装多肽探针PFB-RGD-2和实施例5得到的不含氟自组装多肽探针RGD-2，进行对αvβ3integrin阳性肿瘤细胞球滞留效果的鉴定。
制备流程参照实施例11即可。
由图10和图11可知，含氟自组装多肽探针PFB-RGD-2相比不含氟自组装多肽探针RGD-2可在αvβ3integrin阳性的肿瘤细胞球中滞留更长时间。
综上所述，本发明提供的含氟自组装多肽探针包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子以及PEG亲水片段。通过肿瘤靶点识别肽，探针分子可在肿瘤部位发生特异性聚集；通过在肿瘤微环境的酶切作用以及含氟多肽的自组装作用，探针分子可在肿瘤部位快速聚集并实现更长时间的滞留效果，同时可增加肿瘤部位的荧光强度，从而提高肿瘤部位的荧光信噪比，对于肿瘤精准诊断领域有重要意义。此外，自组装多肽探针具有较好的生物相容性，对体内的毒副作用较小。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述含氟自组装多肽探针包括肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子和PEG亲水片段；
所述肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽、含氟自组装多肽、探针分子依次连接，所述PEG亲水片段偶联于肿瘤特异性靶点识别肽和肿瘤微环境特异性水解肽之间。
2.根据权利要求1所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述肿瘤特异性靶点识别肽包括靶向识别肿瘤细胞表面特异性表达的蛋白受体的多肽；
优选地，所述特异性表达的蛋白包括整合素和/或HER-2；
优选地，所述肿瘤特异性靶点识别肽包括RGD或YLFFVFER。
3.根据权利要求1或2所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述肿瘤微环境特异性水解肽包括肿瘤微环境高表达酶特异性识别序列；
优选地，所述肿瘤微环境特异性水解肽包括PLGVRG或PLGLAG。
4.根据权利要求1-3任一项所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述含氟自组装多肽包括β-sheet肽段；
优选地，所述β-sheet肽段包括KLVF’F’、PFB-KLVFF、PFB-KLVFF’或PFB-KLVF’F’，PFB为五氟苯基，F为苯丙氨酸，F’为五氟-L-苯基丙氨酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述探针分子包括荧光基团、核素或金属配体中任意一种；
优选地，所述探针分子包括Cy5、Cy7或FITC。
6.根据权利要求1-5任一项所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述的PEG亲水片段包括聚乙二醇；
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为400～2000。
7.根据权利要求1-6任一项所述的含氟自组装多肽探针，其特征在于，所述自组装多肽探针的分子式包括包括以下任意一种：
(1)Cy5-PFB-KLVF’F’-PLGVRG-(PEG)CRGD；
(2)Cy5-PFB-KLVFF-PLGLAG-(PEG)CRGD；
(3)Cy7-KLVF’F’-PLGLAG-(PEG)CYLFFVFER；
(4)FITC-PFB-KLVFF’-PLGVRG-(PEG)CRGD。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的含氟自组装多肽探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
通过多肽固相合成法合成得到依次连接的肿瘤特异性靶点识别肽、肿瘤微环境特异性水解肽和含氟自组装多肽，在肿瘤特异性靶点识别肽和肿瘤微环境特异性水解肽之间偶联PEG亲水片段，在含氟自组装多肽上偶联探针分子，得到所述含氟自组装多肽探针。
9.权利要求1-7任一项所述的含氟自组装多肽探针在制备用于肿瘤诊断的产品中的应用。
10.一种用于肿瘤诊断的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-7任一项所述的含氟自组装多肽探针。
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