CN110642905A - 一种近红外葡萄糖荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种近红外葡萄糖荧光探针，结构式如下[Glu‑1‑O‑DSCN(左)、Glu‑3‑O‑DSCN(中)和Glu‑2‑N‑DSCN(右)]：
Figure DDA0002188969190000011
本发明采用具有电子给体‑受体结构(D‑A)共轭基团DCSN作为荧光基团，通过醚键实现DCSN‑葡萄糖探针的结构设计；葡萄糖基团在探针中起到特异性识别的作用，还可以增加探针分子的水溶性和生物相容性。本发明的原料价廉易得，合成路线简单，得到具有穿透性强、光化学稳定、生物相容性好及信噪比高的葡萄糖探针；可用于活细胞染色、线粒体定位、葡萄糖示踪、脑组织成像、肿瘤组织标记和识别。

Description

一种近红外葡萄糖荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于葡萄糖荧光探针领域，尤其涉及一种近红外葡萄糖荧光探针及其制备方法。
背景技术
当前，恶性肿瘤已经成为人类的头号杀手。世界卫生组织2017年公布的数据表明每年大概有880万人死于各种癌症。现代临床研究表明，虽然中期及晚期的癌症治疗还未能找到根治的方法，但早期的肿瘤不扩散，如果在早期进行有效诊断和切除，患者的生存几率将大大提高，因此，癌症肿瘤的早期诊断得到了越来越多的关注。生物探针相关的成像技术是肿瘤组织早期诊断的最有效方法。相对于3H、18F和14C放射性同位素标记，荧光探针具有生物毒性低、仪器简单和成像分辨率高等优点，特别是发展具有高信噪比和穿透性的探针一直是该领域的核心任务，处于该领域的研究前沿。由于近红外光(600-900nm)可以避开体内水、有氧及无氧血红蛋白等的吸收，使得近红外光具有穿透渗透大(可达到十几厘米)，对生物体造成的光损伤小，较高的时空分辨率等优势，在生物医学研究领域有着极大的应用。
目前生物探针主要由识别基团和发光基团两部分组成。
识别基团：目前用于生物识别的识别基团有多肽、离子和糖类。由于多肽的特异性设计和合成均存在较大困难，离子类识别基团的特异性较差，糖类识别基团受到越来越广泛的重视。葡萄糖是哺乳动物最主要的能量载体，葡萄糖的摄取和代谢与包括癌症在内的多种疾病息息相关，因此，葡萄糖是用于细胞染色、细胞器定位、肿瘤组织诊断的理想识别基团。目前，基于葡萄探针的合成多利用葡萄糖2位、6位羟基作为连接点，引入荧光基团，但是2位和6位羟基被取代后，会对葡萄糖单元的摄取和代谢存在较大的影响，如6位取代的葡萄糖探针的摄取速率较慢，2位取代的葡萄糖探针往往需要在细胞饥饿的条件下使用。
发光基团：目前染料分子荧光发射行为和其化学结构的定量关系仍难以定量化，所以很难针对性合成近红外探针。因此现有的近红外荧光探针种类很少，大部分是菁染料，含四吡咯基团的近红外染料、噻嗪类近红外荧光染料等。在应用过程中，现有探针分子存在较大不足，a)Stoke位移普遍较小(<50nm)，因为激发光谱和发射光谱存在较大重叠，所以部分发射光会被自身吸收而导致荧光强度降低，从而导致该发光基团容易发生自猝灭，并且由于激发光谱和发射光谱较接近，容易对荧光检测狭缝引起光散射干扰，导致较大测量误差；b)光稳定性较差，目前近红外探针分子多包含长共轭双键结构，该结构在光照过程中易发生氧化等化学反应，导致其光稳定性较差，现有探针材料中的荧光基团易发生光漂白现象，难以完成长时间的成像，并造成发光强度与其浓度之间定量关系的偏差。为了解决现有发光基团的Stokes位移较小和抗光漂白性较差引起的测定误差较大和信噪比较低的不足，需要在仪器设计过程中采用高精度滤光片提高其成像效率。
虽然目前识别基团和发光基团的设计已经取得较大的进展，但具有高识别性能、大Stokes位移和高度光稳定性的探针分子还很少，应用过程受到较大的限制，因此开发更高效的红光和近红外荧光发射、生物相容性好、Stokes位移大和抗光漂白性能的探针分子一直是该领域的核心和前沿，相关工作对细胞成像、葡萄糖示踪、肿瘤早期诊断和手术导航均有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种近红外葡萄糖荧光探针及其制备方法，通过合适的合成路线，实现将荧光基团引入到1位羟基上，采用具有电子给体-受体结构(D-A)共轭基团DCSN作为荧光基团；以克服目前识别基团通过2位和6位取代制备的葡萄糖探针的不足、发光基团的Stokes位移较小和抗光漂白性较差引起的测定误差较大和信噪比较低的不足。
一种近红外葡萄糖荧光探针，Glu-1-O-DCSN、DG-2-N-DSCN、Glu-3-O-DSCN结构式分别如下：
Figure BDA0002188969170000031
本发明引入葡萄糖基团，提高了近红外荧光探针的水溶性，使其生物相容性有了很大的提高，可作为具有较好生物体内代谢性质的示踪材料，并作为肿瘤检测的成像剂。在葡萄糖1位羟基上引入具有近红外荧光发射(穿透性强)、光稳定性好、荧光效率高和Stokes位移大(高信噪比)的荧光基团DCSN。DCSN具有近红外发射(在水中发射波长为680nm)，具有良好的穿透性和光稳定性。
上述近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)通过丙二腈与3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮合成中间体1；
(2)通过溴代葡萄糖酯与4-(二乙氨基)水杨醛的脱溴反应合成中间体2；
(3)将中间体1和中间体2按照摩尔比为1:1偶联反应制备中间体3；
(4)将中间体3经过水解反应得到所述近红外葡萄糖荧光探针。
优选的，步骤(1)所述通过丙二腈与3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮合成中间体1主要包括：将丙二腈溶解在乙醇中，加入3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮，室温下搅拌5-10分钟，然后加入哌啶，在75-85℃下加热搅拌、回流10-20小时；反应结束后冷却到室温，加去离子水，得到合成中间体1。
优选的，步骤(2)所述通过溴代葡萄糖酯与4-(二乙氨基)水杨醛的脱溴反应合成中间体2主要包括：溴代葡萄糖苷溶解在的二氯甲烷、再加4-(二乙氨基)水杨醛，室温下搅拌2-5分钟后，加入四丁基溴化铵、5％氢氧化钠水溶液，室温下反应2-3小时，反应结束后用氯仿萃取，收集有机层，用饱和氯化钠溶液清洗有机层后，用硫酸钠干燥有机层，经硅胶柱层析纯化得到中间体2。
优选的，步骤(3)所述将中间体1和中间体2偶联反应制备中间体3主要包括：将中间体1和中间体2溶解在无水乙醇，加热至75-85℃，再加醋酸铵，持续加热至反应混合物变为紫红色液体，再加热10-15小时，反应结束后，经硅胶柱层析纯化得到中间体3。
优选的，步骤(4)所述将中间体3经过水解反应得到所述近红外葡萄糖荧光探针主要包括：将步骤(3)中的中间体3溶解在甲醇，室温下搅拌，再加入氢氧化钾，持续搅拌2-3小时，反应结束后用醋酸中和，旋转蒸发除去甲醇后，往混合反应物加入去离子水，最后过滤并干燥。
通过开发相匹配的生物成像技术和条件，本发明的探针分子Glu-1-O-DCSN可用于HeLa、KYSE150和NE1等细胞的成像、线粒体定位和人或者动物体内的葡萄糖示踪、肿瘤标记和早期诊断。本发明的探针分子表现出了良好的生物相容性、强穿透性和高信噪比，实现了细胞染色、线粒体精确识别和定位、肿瘤组织长时间靶向标记，并且通过尾静脉注射对肿瘤组织进行了有效识别。
上近红外葡萄糖荧光探针Glu-3-O-DSCN的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)制备化合物(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯；
(2)将步骤(1)所得化合物进一步反应得到(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸；
(3)制备化合物二丙酮-D-葡萄糖；
(4)往装有DCM的容器中加入二环己基碳二亚胺、二甲基氨基吡啶、步骤(3)所得二丙酮-D-葡萄糖，室温下搅拌，再逐滴加入溶有步骤(2)所得(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的二氯甲烷溶液，继续在室温下搅拌，反应结束后；旋干反应混合物并以比例为石油醚:乙酸乙酯＝1:1的洗脱剂过柱，得到化合物1；
(5)将化合物1溶解在装有纯乙醇的容器中，并且加入2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入醋酸铵，在80℃下回流；反应完成之后，旋干反应混合物，使用石油醚:乙酸乙酯＝4:1的洗脱剂过柱得到化合物2；
(6)将化合物2溶解于10％的醋酸和90％的乙腈混合溶液中，80℃下搅拌过夜；反应完成之后，减压旋干溶剂得到粗产品，之后用二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂来过柱。
上述近红外葡萄糖荧光探针DG-2-N-DSCN的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)制备化合物(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯；
(2)将步骤(1)所得化合物进一步反应得到(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸；
(3)将步骤(2)所得(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸与N-羟基琥珀酰亚胺混入二氯甲烷中，冰浴下搅拌加入二环己基碳二亚胺；再恢复到室温继续搅拌；蒸出溶剂，残留物用石油醚:乙酸乙酯＝1:1过柱得到化合物4；
(4)在室温和氩气氛围下，加入溶有化合物4的N,N-二甲基甲酰胺溶液并搅拌，再加入溶有D-葡萄糖氨的二甲基亚砜溶液；室温下搅拌，减压旋干溶剂得到粗产品，并用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝9:1过柱得到化合物5；
(5)将化合物5溶解于纯乙醇中，然后加入2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入醋酸铵，加热到80℃回流；反应完成之后，将反应混合物旋干，使用比例为二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂过柱得到产品。
一种包含上近红外葡萄糖荧光探针的肿瘤检测的成像剂。
与现有技术相比，本发明采用具有电子给体-受体结构(D-A)共轭基团DCSN作为荧光基团，通过醚键实现DCSN-葡萄糖探针的结构设计；通过合适的合成路线，实现将荧光基团引入到1位羟基上。葡萄糖基团在探针中不仅起到特异性识别的作用，而且可以增加探针分子的水溶性和生物相容性。本发明的原料价廉易得，合成路线简单，得到一种具有穿透性强、光化学稳定、生物相容性好及信噪比高的葡萄糖探针；可用于活细胞染色、线粒体定位、葡萄糖示踪、脑组织成像、肿瘤组织标记和识别。
附图说明
图1是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN、Glu-3-O-DSCN、DG-2-N-DSCN的结构示意图；
图2是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN合成路线示意图；
图3是本发明的中间体1的傅里叶变换红外光谱图；
图4是本发明的中间体1的核磁图谱；
图5是本发明的中间体2的核磁图谱；
图6是本发明的中间体3的核磁图谱；
图7是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN的核磁图谱；
图8是本发明的近红外探针Glu-1-O-DCSN用于活细胞HeLa(左)、KYSE50(中)和NE1(右)的成像图；
图9是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN的毒性检测实验中1μM、0.1μM和0.01μM的HeLa细胞、KYSE150细胞、NE1细胞的存活率对比图；
图10是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN在不同激发波长下的荧光光谱及最强发射波长与激发波长的关系；
图11是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN与线粒体探针Mito TackerGreen在HeLa细胞、KYSE150细胞、NE1细胞中的共定位分析；
图12是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN与细胞核探针Hoechst33342进行共定位分析对比图；
图13是HeLa、KYSE150和NE1细胞分别在有葡萄糖(5.6mM D-Glu)和无葡萄糖(0mMD-Glu)条件下对本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN的摄取速率；
图14是HeLa、KYSE150和NE1细胞分别在有葡萄糖(5.6mM D-Glu)和无葡萄糖(0mMD-Glu)条件下对本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN摄取速率的统计结果；
图15是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN经瘤体内注射后在在移植瘤小鼠体内的荧光成像图；
图16是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN经尾静脉注射后在移植瘤小鼠体内的荧光成像图；
图17是本发明的近红外葡萄糖荧光探针Glu-3-O-DSCN合成路线示意图；
图18是本发明的近红外葡萄糖荧光探针DG-2-N-DSCN合成路线示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明中的荧光探针作进一步地详细描述。
实施例1
近红外葡萄糖荧光探针探针Glu-1-O-DCSN的合成
Glu-1-O-DCSN的合成路线如图2所示，主要包括以下步骤：
(1)将3.96g丙二腈溶解在70mL的乙醇，加入7.49mL3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮，室温下搅拌5分钟，然后加入10mg哌啶，在80℃下加热搅拌、回流12小时。反应结束后冷却到室温，加100mL去离子水，得到固体产物，随后将其固体产物溶解在去离子水和乙醇的混合溶液中(150mL,60:90)，重结晶得到中间体1的晶体，产率为75％，中间体1相关的图谱如图3、图4所示，数据如下：
Figure BDA0002188969170000071
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝6.55(q,J＝1.5Hz,1H),2.44(s,2H),2.10(t,J＝1.3Hz,2H),1.96(t,J＝1.1Hz,3H),0.94(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝170.33,159.69,120.59,113.16,112.38,99.98,45.69,42.64,32.36,27.81,25.29。
(2)将3.92g溴代葡萄糖苷溶解在60mL的二氯甲烷、再加1.44g 4-(二乙氨基)水杨醛，室温下搅拌2分钟后，加入2.60g的四丁基溴化铵、40mL 5％氢氧化钠水溶液，室温下反应2小时，反应结束后用90mL氯仿萃取，收集有机层，用饱和氯化钠溶液(80mL)清洗有机层后，用硫酸钠干燥有机层，经硅胶柱层析纯化得到中间体2，产率为25％，中间体2核磁图谱如图5所示，数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d):δ＝7.76(dd,J＝8.9,1.6Hz,1H),6.47(d,3JH,H＝9.1Hz,1H),6.38(s,1H),5.42-5.29(m,2H),5.30-5.15(m,2H),4.31(dd,3JH,H＝12.4,4.5Hz,1H),4.22(dd,3JH,H＝12.4,2.4Hz,1H),3.93-3.85(m,1H),3.45(qd,3JH,H＝7.3,2.7Hz,4H),2.07(dd,3JH,H＝6.8,1.7Hz,12H),1.25(t,3JH,H＝7.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝186.66,170.51,170.21,169.29,169.18,161.34,145.96,131.77,130.05,108.82,107.22,99.51,72.53,72.18,70.94,68.19,61.91,45.20,20.65,20.58,12.46。
(3)将中间体1(0.12g)和中间体2(0.35g)溶解在10mL无水乙醇，加热至80℃，再加10mg醋酸铵，持续加热至反应混合物变为紫红色液体，再加热12小时，反应结束后，经硅胶柱层析纯化得到中间体3，产率为43％，中间体3核磁图谱如图6所示，数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ＝7.51(d,3JH,H＝7.3Hz,1H),7.33(d,3JH,H＝16.0Hz,1H),6.76(d,3JH,H＝16.0Hz,2H),6.45(s,1H),6.3-6.07(m,1H),5.47-5.31(m,2H),5.26-5.10(m,2H),4.32(q,1H),3.88-3.57(m,1H),3.41(q,3JH,H＝7.1,4H),2.54(m,3H),2.21-1.87(m,12H),1.85(m,1H),1.22(t,3JH,H＝7.1Hz,7H),1.09(m,5H)。
(4)将中间体3(100mg)溶解在5mL的甲醇，室温下搅拌，再加入4mg氢氧化钾，持续搅拌2小时，反应结束后用醋酸中和，旋转蒸发除去甲醇后，往混合反应物加入去15mL离子水，最后过滤并干燥最终产物Glu-1-O-DCSN，产率为55％，其最终产物核磁图谱如图7所示，数据如下：1H NMR(400MHz,Methanol-d4):δ＝7.73(d,3JH,H＝16.0Hz,1H),7.57(d,3JH,H＝9.0Hz,1H),6.91(d,3JH,H＝16.0Hz,1H),6.69(s,1H),6.58(d,3JH,H＝2.5Hz,1H),6.47(dd,3JH,H＝9.0,2.5Hz,1H),4.85(d,3JH,H＝7.7Hz,1H),4.56(s,2H),3.88(dd,3JH,H＝11.9,1.8Hz,1H),3.79-3.66(m,2H),3.55(t,J＝8.2Hz,1H),3.49-3.46(m,1H),3.42(m,9H),3.20(q,3JH,H＝7.3Hz,2H),2.61-2.54(m,2H),1.31(t,3JH,H＝7.3Hz,2H),1.19(t,3JH,H＝7.0Hz,6H),1.07(d,3JH,H＝4.5Hz,6H)。
实施例2
探针Glu-1-O-DCSN对肿瘤细胞和正常食管上皮永生化细胞的毒性检测
(1)细胞培养
人宫颈癌细胞系HeLa细胞，人食管癌细胞系KYSE150细胞，人正常食管上皮永生化细胞系NE1细胞，分别在含10％胎牛血清的改良型RPMI-1640培养基，含10％新生牛血清的DMEM培养基和成分确定的角质形成细胞无血清培养中，于5％CO2，湿度80％的37℃培养箱中培养。
(2)细胞消化
当细胞生长至汇合度约90％时，弃尽旧培养液，用磷酸盐缓冲液漂洗一次，加入适量0.25％胰酶消化，期间注意观察，待细胞成片脱落时，立即加入1-2mL新鲜培养基终止消化，将细胞悬液转移至15mL离心管中，室温700转/分钟，离心5分钟，弃去上清液。用1mL相应培养液重悬细胞。
(3)细胞计数
取10μL的细胞重悬液至0.50mL离心管中，加入10μL台盼蓝溶液，轻轻吸打混匀后，取10μL加入1个细胞计数板孔中，将计数板插入细胞计数仪中进行细胞计数，并记录细胞浓度和细胞活力。
(4)细胞接种
按照96孔板，10000个细胞/100μL/孔，根据所接孔数和所需细胞培养液的总体积，计算上述细胞悬液的稀释比例，并用相应培养液配成最终细胞悬液，接种时保证每孔细胞浓度一致。实验组为探针处理组，探针做三个浓度梯度；空白对照组只加细胞培养液；对照组只加入探针稀释溶剂乙醇，整个实验中每种处理至少做三个复孔。接种好的细胞在37℃，5％CO2，80％湿度培养箱中培养24小时，至融合度为90％时，开始处理。将探针母液(浓度为0.1mg/mL，约为191μM)，根据每种处理所需体积数稀释成1μM、0.1μM和0.01μM备用，对照组乙醇处理也做同样浓度稀释，处理24小时后，每孔100μL培养基加20μL CellTiter
Figure BDA0002188969170000091
AQueous One Solution Reagent，在37℃，5％CO2的环境下孵育2小时。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，490nm读取吸光度值，记录结果。近红外探针Glu-1-O-DCSN用于活细胞HeLa(左)、KYSE50(中)和NE1(右)的成像如图8所示。在细胞毒性实验中，加入了不同浓度近红外探针Glu-1-O-DCSN的活细胞HeLa、KYSE50和NE1的细胞存活率如图9所示。
实施例3
探针Glu-1-O-DCSN在活细胞内的荧光成像
(1)细胞培养板的准备
在超净工作台中，取200μL纤粘蛋白液(浓度为10μg/mL)铺在活细胞观察专用的24孔玻璃底培养板孔中，使纤粘蛋白完全覆盖住底部的玻璃片，放入37℃恒温箱孵育2小时后弃去，用磷酸盐缓冲液润洗2次，将培养皿放于4℃冰箱备用。
(2)细胞接种
细胞消化计数后，按照24孔板，6000个细胞/200μL/孔，根据所接孔数和所需细胞培养液的总体积，计算细胞悬液的稀释比例，并用相应培养液配成最终细胞悬液，将最终细胞悬液加入预先处理好的玻璃底培养板孔中，接种时保证每孔细胞浓度一致。于37℃，5％二氧化碳，80％湿度培养箱中培养1小时后，加入2mL新鲜培养基，继续培养12小时后，进行探针荧光成像观察。
(3)探针Glu-1-O-DCSN在活细胞中的成像
弃去原培养液，用活细胞成像溶液润洗细胞两次，加入2mL活细胞成像溶液，于ZEISS LSM880倒置激光共聚焦显微镜下用透射光观察，找到合适视野，将探针加入成像液(浓度为0.1μM)注意不要调动选好的观察视野，立即于488nm激发波长，645nm发射波长下进行适时观察荧光。如图8所示，经Glu-1-O-DCSN染色后，细胞发出红色荧光，该近红外荧光探针活细胞染色成像效果极好，其结果表明该探针特异性强，灵敏度高。
(4)探针Glu-1-O-DCSN与线粒体探针的共定位分析
所购买的商品化线粒体绿色探针MitoTracker Green，激发波长为490nm，发射波长为516nm。由于该线粒体探针的激发波长与探针Glu-1-O-DCSN激发波长在同一范围内，通过调整检测波长范围来避免串色。近红外葡萄糖荧光探针Glu-1-O-DCSN在不同激发波长下的荧光光谱及最强发射波长与激发波长的关系如图10所示。多次探索后，最终线粒体绿色探针的激发波长选择488nm，检测波长499-517nm，探针Glu-1-O-DCSN选择514nm激发，检测波长613nm-662nm，且在上述波长范围内二者无相互串色。细胞经0.10μM的Glu-1-O-DCSN和0.10μM的Mito Tracker Green染色30分钟后，利用ZEISS LSM880倒置激光共聚焦显微镜(加载活细胞工作站)按照上述波长范围分别对Glu-1-O-DCSN探针和线粒体绿色探针MitoTracker Green成像，成像图用image J软件分析，做出二者细胞定位的相关系数R，R值越接近1，说明共定位程度越高。在生物细胞实验中，近红外荧光探针活细胞染色成像效果极好，其结果表明该探针特异性强，灵敏度高；如图11所示，三种细胞中Glu-1-ODCSN与MitoTracker Green的相关系数在0.73-0.93，结果表明，该近红外荧光探针和线粒体探针定位重叠率高，其示踪效果极好。
作为对比，利用Glu-1-O-DCSN探针与细胞核探针Hoechst33342进行共定位分析，如图12所示。结果表明，两者在次细胞器的定位存在较大差异，两者细胞定位的相关系为仅为0.39-0.45，从而从侧面进一步证实Glu-1-O-DCSN探针与线粒体探针共定位结果的真实性，即Glu-1-O-DCSN探针可以高选择性地定位在线粒体上。
通过活细胞荧光成像实验证明，在100nM浓度下，与细胞共孵育20-30分钟后，该葡萄糖荧光探针能够被活细胞摄取，并定位到细胞内的线粒体上，与目前其他已报道的探针浓度相比起其所需浓度低，灵敏性高，且连续拍摄4小时后荧光没有淬灭。
(5)D-葡萄糖竞争性抑制细胞对探针Glu-1-O-DCSN的摄取
如前所述，细胞消化接种后，在加入探针Glu-1-O-DCSN的同时加入D-葡萄糖(5.6mM)作为实验组，另做未加入D-葡萄糖的对照组，活细胞适时荧光观察，通过检测探针发出荧光的时间，统计荧光亮度随时间的变化，分析D-葡萄糖对探针进入细胞的影响。如图13和图14所示，与未处理的对照组相比，加入D-葡萄糖后的实验组，该探针进入细胞所需时间增加，且所达到的最大荧光值减小，结果表明，D-葡萄糖的加入竞争性抑制了细胞对探针的摄取，证明该探针与D-葡萄糖以同一种方式被细胞摄取，因此该葡萄糖探针可以用来实时检测活细胞对葡萄糖的摄取情况。从图13还可以看出在三个细胞系中，探针经过连续照射4个小时后，仍有强烈的荧光发射，表明该探针具有优异的抗光漂白性。
实施例4
探针Glu-1-O-DCSN在移植瘤小鼠体内的荧光成像：
(1)构建裸鼠成瘤模型
从北京维通利华公司够买25只实验动物nu/nu无胸腺裸小鼠(athymic nu/numice)，雄性，鼠龄4-5周，体重18g左右。在SPF(specific pathogen-free)级动物实验室中饲养，每日提供充足的饮水与饮食。本动物实验方案已获得汕头大学医学院实验动物伦理委员会的批准与认可。收集处于对数生长期的食管癌KYSE150细胞，消化细胞并配置成密度为1×107/mL的无血清细胞悬液。裸鼠分成两组，5只为对照组正常饲养，另外20只皮下注射KYSE150细胞，观察细胞生长情况(成瘤性)；每三天用游标卡尺测量瘤块的长(L)与宽(W)与厚(H)。瘤块体积＝L×W×H/2，当瘤块体积达到100mm3-500mm3时(约需饲养4-6周)，分两成组，每组10只，分别瘤体内或经尾静脉注射荧光探针，进行活体成像。
(2)肿瘤探针注射小鼠活体成像
利用Caliper小动物活体成像系统进行小鼠荧光成像。如图15所示，肿瘤注射探针后，小鼠放麻醉箱麻醉，每隔一定时间间隔进行荧光成像；成像完成后，处死小鼠，取脏器、瘤体再次进行荧光成像，荧光成像条件是激发波长535nm，发射波长655nm。小动物活体成像实验中，小鼠实验结果表明该近红外荧光探针可以在高代谢组织(如肿瘤细胞)聚集发光，能起到很好的示踪效果，有望用于活体示踪肿瘤。
(3)尾静脉探针注射小鼠活体成像
利用Caliper小动物活体成像系统进行小鼠荧光成像。经尾静脉注射后，小鼠放麻醉箱麻醉，每隔一定时间间隔进行荧光成像；成像完成后，处死小鼠，取脏器、瘤体再次进行荧光成像，荧光成像条件是激发波长535nm，发射波长655nm，荧光探针在各器官中的分布如图16所示。结果表明，荧光探针在肿瘤部位发生了明显的聚集，从而有望用于肿瘤的手术导航和早期识别。
通过对该葡萄糖探针在成瘤小鼠体内的荧光成像，表明无论是瘤体内注射该探针或者是经尾静脉注射，探针都在葡萄糖需求旺盛的器官富集，例如肿瘤组织内，因此该探针在肿瘤的诊断和肿瘤手术导航中和早期诊断中具有潜在应用价值。
总之本发明的近红外荧光探针是用短波长去激发后，发射长波长的近红外光。在生物细胞实验中，近红外荧光探针活细胞染色成像效果极好，其结果表明该探针特异性强，灵敏度高；亚细胞定位结果表明该近红外荧光探针和线粒体探针定位重叠率高，其示踪效果极好。在小动物活体成像实验中，小鼠实验结果表明该近红外荧光探针可以在高代谢组织(如肿瘤细胞)聚集发光，能起到很好的示踪效果，有望用于活体示踪肿瘤。
实施例5
探针Glu-3-O-DSCN的合成
探针Glu-3-O-DSCN的合成路线如图17所示，主要包括以下过程：
(1)(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯的合成
在搅拌状态下将3.70g(19.0mmol)4-(二乙氨基)水杨醛与5.29g(26.66mmol)碳酸钾加入到65mL乙腈中，并在室温下逐滴加入(时间要在15分钟以上)3.45mL(23.0mmol)氯丁酸乙酯，之后加热约12小时，用石油醚:乙酸乙酯＝4:1点板监控到反应结束。反应混合物自然冷却到室温，然后将其与不溶的碳酸钾和氯化钾分离。将有机层使用旋转蒸发仪旋干可以得到棕色粘稠状液体。然后以石油醚:乙酸乙酯＝4:1的比例为洗脱剂过柱，得到0.82g所需要的产品(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯，产品是黄褐色的油状液体，产率为26％。(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯的特征光谱数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ；10.16(s,1H),7.71(d,J＝8.9Hz,1H),6.28(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H),6.03(d,J＝2.2Hz,1H),4.15(q,J＝7.2Hz,2H),4.10(t,J＝6.0Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,4H),2.55(t,J＝7.1Hz,2H),2.17(p,J＝6.7Hz,2H),1.26(t,J＝7.2Hz,4H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ；12.60,14.21,24.46,30.59,44.77,60.51,66.80,76.71,77.03,77.23,77.35,93.17,104.43,114.27,130.30,153.84,163.50,173.12,186.92。
(2)(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的合成
搅拌状态下往5mL甲醇中加入0.7g(2.28mmol)(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯，并逐滴加入(时间要在20分钟以上)0.30g(5.42mmol)2当量的氢氧化钾溶液，回流两个小时。使用旋蒸将溶剂除去之后加入3mL 3当量的盐酸溶液，过滤得到(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸，使用3x25 mL的去离子水冲洗，然后减压干燥3小时。
(3)二丙酮-D-葡萄糖的合成：
将120mL丙酮加入到冰浴中的250mL圆底烧瓶中，再加入4g(17.7mmol)溴化锌，之后逐滴加入4毫升98％的硫酸(73.6mmol)。然后加入15g(83.33mmol)D-glucose并在室温下搅拌8小时，使用6当量的氢氧化钠调节反应混合物的pH到7。使用二氯甲烷萃取产品并旋去有机层，然后在石油醚中重结晶得到产率为40％的白色固体。
(4)化合物1的合成：
往装有60mL二氯甲烷的100mL圆底烧瓶中加入1.82g(7.0mmol)二丙酮-D-葡萄糖，3.60g(17.5mmol)二环己基碳二亚胺和0.21g(1.75mmol)二甲基氨基吡啶，室温下搅拌半小时，之后在15分钟内逐滴加入溶有1.00g(3.5mmol)(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的二氯甲烷(15mL)溶液，继续在室温下搅拌20小时，直到薄层层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)监控到反应结束。旋干反应混合物并以比例为石油醚:乙酸乙酯＝1:1的洗脱剂过柱，得到微黄色油状的产品，产率为25％。
(5)化合物2的合成：
将1.05g(2mmol)的化合物1溶解在装有20mL纯乙醇的100mL圆底烧瓶中，并且加入0.36g(2mmol)2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入0.15g(2mmol)醋酸铵，在80℃下回流12小时，通过薄层层析(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)来监控反应进程。反应完成之后，旋干反应混合物得到暗紫色的残留物，使用石油醚:乙酸乙酯＝4:1的洗脱剂过柱得到产率为31％的化合物2。
(6)探针Glu-3-O-DSCN的合成：
将0.25g(0.41mmol)化合物2溶解于10％的醋酸和90％的乙腈混合溶液中，80℃下搅拌过夜，通过薄层层析(二氯甲烷:甲醇＝9:1)来监控反应进程。反应完成之后，减压旋干溶剂得到粗产品，之后用二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂来过柱得到产率为65％的浅蓝色固体探针3-Glu-O-DSCN。
实施例6
探针DG-2-N-DSCN的合成
探针DG-2-N-DSCN的合成路线如图18所示，采用多步方法来实现的，主要包括以下步骤：
(1)(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的合成
与实施例5中(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的合成方法相同。
(2)化合物4的合成
将0.60g(1.95mmol)的(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸与0.45g(3.91mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺混入20mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌加入0.8g(3.8mmol)二环己基碳二亚胺。反应混合物可以恢复到室温并整夜搅拌。蒸出溶剂，残留物用石油醚:乙酸乙酯＝1:1过柱得到0.7g为黄色固体的化合物4，产率为89％。
(3)化合物5的合成
在室温和氩气氛围下，往100mL圆底烧瓶中加入溶有0.25g(0.66mmol)化合物4的5.0mL N,N-二甲基甲酰胺溶液并搅拌，再加入溶有0.24g(1.32mmol)D-氨基葡萄糖的5mL二甲基亚砜溶液。室温下搅拌24小时，减压旋干溶剂得到粗产品，并用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝9:1过柱得到产率为63％的化合物5。
(4)探针DG-2-N-DSCN的合成
将0.20g(0.45mmol)的化合物5溶解于10mL纯乙醇中，然后加入0.084g(0.45mmol)2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入0.035g(0.45mmol)醋酸铵，加热到80℃回流12小时，通过薄层层析(二氯甲烷:甲醇＝9:1)来监控反应进程。反应完成之后，将反应混合物旋干得到暗紫色残留物，使用比例为二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂过柱得到产品，产率为34％。

Claims (10)

1.一种近红外葡萄糖荧光探针，其特征在于，结构式如下：
Figure FDA0002188969160000011
2.根据权利要求1所述近红外葡萄糖荧光探针的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)通过丙二腈与3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮合成中间体1；
(2)通过溴代葡萄糖酯与4-(二乙氨基)水杨醛的脱溴反应合成中间体2；
(3)将中间体1和中间体2按照摩尔比为1:1偶联反应制备中间体3；
(4)将中间体3经过水解反应得到所述近红外葡萄糖荧光探针。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述通过丙二腈与3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮合成中间体1主要包括：将丙二腈溶解在乙醇中，加入3,5,5-三甲基-2-环已烯-1-酮，室温下搅拌5-10分钟，然后加入哌啶，在75-85℃下加热搅拌、回流10-20小时；反应结束后冷却到室温，加去离子水，得到合成中间体1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述通过溴代葡萄糖酯与4-(二乙氨基)水杨醛的脱溴反应合成中间体2主要包括：溴代葡萄糖苷溶解在的二氯甲烷、再加4-(二乙氨基)水杨醛，室温下搅拌2-5分钟后，加入四丁基溴化铵、5％氢氧化钠水溶液，室温下反应2-3小时，反应结束后用氯仿萃取，收集有机层，用饱和氯化钠溶液清洗有机层后，用硫酸钠干燥有机层，经硅胶柱层析纯化得到中间体2。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(3)所述将中间体1和中间体2偶联反应制备中间体3主要包括：将中间体1和中间体2溶解在无水乙醇，加热至75-85℃，再加醋酸铵，持续加热至反应混合物变为紫红色液体，再加热10-15小时，反应结束后，经硅胶柱层析纯化得到中间体3。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(4)所述将中间体3经过水解反应得到所述近红外葡萄糖荧光探针主要包括：将步骤(3)中的中间体3溶解在甲醇，室温下搅拌，再加入氢氧化钾，持续搅拌2-3小时，反应结束后用醋酸中和，旋转蒸发除去甲醇后，往混合反应物加入去离子水，最后过滤并干燥。
7.根据权利要求1所述近红外葡萄糖荧光探针的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)制备化合物(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯；
(2)将步骤(1)所得化合物进一步反应得到(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸；
(3)制备丙酮保护的D-葡萄糖(双丙酮-D-葡萄糖)；
(4)往装有二氯甲烷的容器中加入二环己基碳二亚胺、二甲基氨基吡啶、步骤(3)所得双丙酮-D-葡萄糖，室温下搅拌，再逐滴加入溶有步骤(2)所得(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸的二氯甲烷溶液，继续在室温下搅拌；旋干反应混合物并以比例为石油醚:乙酸乙酯＝1:1的洗脱剂过柱，得到化合物1；
(5)将化合物1溶解在装有纯乙醇的容器中，并且加入2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入醋酸铵，加热至80℃回流；反应完成之后，旋干反应混合物，使用石油醚:乙酸乙酯＝4:1的洗脱剂过柱得到化合物2；
(6)将化合物2溶解于10％的醋酸和90％的乙腈混合溶液中，80℃下搅拌过夜；反应完成之后，减压旋干溶剂得到粗产品，之后用二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂来过柱。
8.根据权利要求1所述近红外葡萄糖荧光探针的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)制备化合物(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸乙酯；
(2)将步骤(1)所得化合物进一步反应得到(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸；
(3)将步骤(2)所得(5-二乙基氨基-2-甲酰基-苯氧基)丁酸与N-羟基琥珀酰亚胺混入二氯甲烷中，冰浴下搅拌加入二环己基碳二亚胺；再恢复到室温继续搅拌；蒸出溶剂，残留物用石油醚:乙酸乙酯＝1:1过柱得到化合物4；
(4)在室温和氩气氛围下，加入溶有化合物4的N,N-二甲基甲酰胺溶液并搅拌，再加入溶有D-氨基葡萄糖的二甲基亚砜溶液；室温下搅拌，减压旋干溶剂得到粗产品，并用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝9:1过柱得到化合物5；
(5)将化合物5溶解于纯乙醇中，然后加入2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，再加入醋酸铵，加热到80℃回流；反应完成之后，将反应混合物旋干，使用比例为二氯甲烷:甲醇＝9:1的洗脱剂过柱得到产品。
9.根据权利要求1所述近红外葡萄糖荧光探针的应用，其特征在于，可用于活细胞染色、线粒体定位和人或者动物体内的葡萄糖示踪。
10.一种包含权利要求1所述近红外葡萄糖荧光探针的肿瘤检测的成像剂。
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CN115925664B (zh) * 2023-01-06 2023-05-09 山东省华泰营养健康产业技术研究院有限公司 一种具有大斯托克斯位移的近红外荧光探针及其制备方法、应用

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