CN113912762A - 水溶性的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

水溶性的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光材料技术领域，具体为一种水溶性的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法和应用。本发明采用新的策略构建水溶性的近红外二区大分子荧光探针，包括：筛选具有优异光稳定性以及化学稳定性的氮杂氟硼荧类小分子染料作为发光内核；通过引入不同供电子能力的取代基，合成具有不同发射波长的氮杂氟硼荧的原子转移自由基聚合引发剂；通过可控自由基聚合水溶性单体，得到完全水溶的大分子荧光探针；通过对聚合度的优化设计，得到在水中完全溶解的粒径在3‑5nm的单链荧光探针。本发明的FBP探针在水中具有很好的光稳定性和化学稳定性，易于化学修饰，表现出优异的近红外二区拖尾发射，可用于血管、淋巴或肿瘤成像等。

Description

水溶性的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光材料技术领域，具体涉及一类水溶性的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
近红外二区(NIR-II,1000-1700nm)荧光成像可以有效的避免组织的自发荧光和散射等背景干扰，具有更深的组织穿透深度、更高的分辨率和信噪比(SBR)。目前近红外二区荧光探针主要分为无机纳米材料、有机小分子和共轭聚合物。近红外二区无机纳米材料主要包括稀土掺杂纳米颗粒、半导体量子点、单壁碳纳米管(SWCNs)等，然而无机纳米颗粒的长期毒性限制了其进一步的临床转化。相比而言，有机小分子荧光染料具有可调的物理和光学性能，具有较好的生物相容性，目前近红外二区有机小分子染料主要包括以供体-受体-供体(D-A-D)和多甲川(D-π-A)作为核心结构的有机小分子荧光团。然而，这些近红外二区荧光染料普遍存在疏水性强、光稳定性差、水中荧光亮度低以及难功能化等问题。目前普遍采用的制备方法是将疏水染料负载在胶束中进行生物成像，但这种方法制备的胶束通常粒径较大，在体内很容易被网状内皮系统所捕获而富集在肝脏中。此外，物理负载稳定性较差，染料分子易于从载体中泄露，从而导致药代动力学不理想。虽然目前也有文献报道通过在染料上修饰聚乙二醇(PEG)或者引入磺酸，两性离子等基团以提高染料的水溶性，然而染料分子与溶剂分子之间的C-H/O-H振动会显著淬灭近红外二区染料在水中的荧光，这种现象在菁类染料中特别明显。另外，也有文献报道通过形成近红外二区染料与血浆蛋白的复合物以提高染料在水中的亮度，但是染料与血浆蛋白结合后会显著影响荧光染料的药代动力学特性和对组织的生物利用度。因此开发具有高荧光亮度，光稳定性好且具有很好生物相容性的完全水溶性的近红外二区荧光探针一直是一个挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在水中具有较高亮度且光稳定优异的完全水溶的近红外二区大分子荧光探针及其制备方法，并进一步提供该近红外二区荧光探针的应用。
本发明提出了一种全新的策略去构建水溶性的近红外二区大分子荧光探针。具体来讲：
首先，优化筛选出具有优异光稳定性以及化学稳定性的氮杂氟硼荧(aza-BODIPY)类小分子染料作为发光内核；
然后，通过引入不同供电子能力的取代基，合成一系列具有不同发射波长的氮杂氟硼荧的原子转移自由基聚合引发剂；
再后，通过可控自由基聚合水溶性单体，得到完全水溶的大分子荧光探针；将其命名为FBP(FudanBodipy Polymer)系列探针；
最后，通过对聚合度的优化设计，得到在水中完全溶解的粒径在3-5nm的单链荧光探针。
本发明得到的该系列探针在水中具有很好的光稳定性和化学稳定性，易于化学修饰，表现出非常优异的近红外二区拖尾发射，在近红外二区的荧光亮度优于目前文献中报道的水溶性近红外二区荧光探针。据此，本发明实现了该类荧光探针在脑血管、淋巴结中的高信噪比荧光成像，以及肾脏缺血再灌注损伤的早期成像检测。
本发明提供的水溶性的近红外二区大分子荧光探针，以氮杂氟硼荧类染料作为发光内核，其结构通式如下：
Figure BDA0003276405810000021
其中：
R1，R2，R3，R4各自独立选自R7；
R7含有亲水性单体R6形成的亲水性聚合物链以及靶向基元R6’形成的聚合物链部分，亲水性单体以及靶向基团的单体通过无规共聚或者嵌段共聚的方式进行可控自由基聚合，x,y分别表示聚合度，其中x为1-500；y为1-10；
R6为亲水性的单体，选自甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯(OEGMA)，丙烯酸(AA)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)；
R6’用于后续靶向基团的连接，选自(CH2)pN3，(CH2)pSH，(CH2)pCOOH，(CH2)pOH，(CH2)pNH2，(CH2)pCCH，(CH2)pMI，(CH2)pNHS(其中MI表示马来酰亚胺，NHS表示N-羟基丁二酰亚胺的活性酯)；
R5选自R10，R11，R12；
X＝O或者N；当X＝N时，R8为H，CH3，CH3CH2；
R9为连接基元，选自酯键，酰胺键，叠氮与炔基形成的三氮唑结构，巯基与马来酰亚胺的加成产物；
m,p为0-18之间的整数。
优选地，所述水溶性的近红外二区大分子荧光探针，其中R1，R2，R3，R4独立选自R7。
优选地，所述水溶性的近红外二区大分子荧光探针，其中R5独立选自R10，R11和R12。
本发明还提供所述水溶性的近红外二区大分子荧光探针在血管、淋巴、肿瘤成像中的应用。
本发明还提供所述水溶性的近红外二区大分子荧光探针的制备方法，具体步骤如下：
(1)首先，合成基于氮杂氟硼荧的原子转移自由基聚合的引发剂(BDP引发剂)，该荧光染料的引发剂具有如下通式结构：
Figure BDA0003276405810000031
该氮杂氟硼荧引发剂中具有不同供电子能力的取代基，其中：
R1，R2，R3，R4各自独立选自R7；
R5独立选自R10，R11，R12；
Y独立选自Cl，Br，I；
X＝O或者N；当X＝N时，R8为H，CH3，CH3CH2；
R9为连接基元，选自酯键，酰胺键，叠氮与炔基形成的三氮唑结构，巯基与马来酰亚胺的加成产物；
m,p为0-18之间的整数。
(2)然后，将所述引发剂引发亲水单体聚合，得到完全水溶性的近红外二区荧光探针，其中亲水单体可以是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯，N-异丙基丙烯酰胺，丙烯酸，N，N-二甲胺基丙烯酰胺等。
(3)最后，通过对聚合度的优化设计，得到在水中完全溶解的粒径在3-5nm的单链荧光探针。
本发明中，优选典型的引发剂为OBDP-Br，CBDP-Br，NBDP-Br和JBDP-Br，其结构分别为：
Figure BDA0003276405810000041
使用引发剂OBDP-Br、CBDP-Br、NBDP-Br或JBDP-Br引发亲水的寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯聚合，得到水溶性的近红外二区大分子荧光探针，分别记为：FBP 725，FBP 790，FBP912以及FBP 1025，对应的结构式如下：
Figure BDA0003276405810000042
其中，n为聚合度，独立选自1-500。
优化筛选出具有合适亲水链段的聚合物，使其在水中能够完全溶解而不发生聚集。
本发明还提供所述水溶性的近红外二区大分子荧光探针在血管、淋巴、肿瘤成像中的应用，实现对癌变部位的特异性荧光成像。例如，可用于脑血管、淋巴结中的高信噪比荧光成像，以及肾脏缺血再灌注损伤的早期成像检测等。
附图说明
图1为引发剂OBDP-Br的核磁氢谱。
图2为引发剂OBDP-Br的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图3为引发剂CBDP-Br的核磁氢谱。
图4为引发剂CBDP-Br的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图5为引发剂NBDP-Br的核磁氢谱。
图6为引发剂NBDP-Br的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图7为引发剂JBDP-Br的核磁氢谱。
图8为引发剂JBDP-Br的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图9为FBP 725的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图10为FBP 790的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图11为FBP 912的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图12为FBP 1025的基质辅助解吸电离飞行时间质谱。
图13为FBP 912在PBS中的粒径分布和光稳定性比较。
图14为FBP 725,FBP 790,FBP 912和FBP 1025在PBS中的归一化的吸收和发射光谱。
图15为FBP 725，FBP 790在660nm激光以及FBP 912，FBP 1025在808nm激光激发时分别在1100nm，1200nm以及1300nm长通滤光片时荧光亮度比较。
图16为健康的Balb/c雌性小鼠(6-8周)尾静脉注射FBP 912(20mg/mL,200μL)后使用1000nm(2ms曝光时间)，1100nm(5ms曝光时间)，1200nm(20ms),1300nm(100ms曝光时间)，1400nm(300ms曝光时间)以及1500nm(800ms曝光时间)的长通滤光片时的腹部血管成像，使用808nm的激光激发。
图17为健康的Balb/c雌性小鼠尾静脉注射FBP 912(20mg/mL,200μL)后使用不同的长通滤光片(1100-1400nm)时的脑部血管成像以及对应的信噪比和半峰宽分析。
图18为FBP 912在健康的雌性Balb/c小鼠(6-8周)中的肾脏清除速率以及血液中染料浓度随时间的变化(三组平行实验)。
具体实施方式
以下通过具体实施例是对本发明作进一步阐述。其在于更好的理解本发明，而不是限制本发明。
实施例1：
制备如下基于染料的原子转移自由基聚合引发剂：NBDP-Br，OBDP-Br，CBDP-Br和JBDP-Br，其结构式分别为：
Figure BDA0003276405810000061
以上只是列举四类引发剂，不排除利用其他反应得到类似的染料引发剂。
制备方法：
以NBDP-Br为例进行阐述，其合成路线如下：
Figure BDA0003276405810000062
具体过程如下：
(1)A1的合成：将醛基化合物和酮羰基化合物按照摩尔比为1:1溶解在无水乙醇中，然后加入4当量的KOH，超声溶解后，室温反应过夜，抽滤并用冷的乙醇清洗两次后得到黄色固体产物A1，产率50-70％；
(2)A2的合成：将A1和硝基甲烷按照摩尔比为1:10的当量溶解在乙醇中，加入4倍当量的KOH，70℃下反应24h后，旋干乙醇，加入二氯甲烷，用饱和食盐水萃取两次后，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩旋干后用石油醚与二氯甲烷为1:1的比例进行柱层析，最终得到浅黄色的固体粉末，产率为40-70％；
(3)Alkyne-NBDP的合成：将A2溶解中正丁醇中，加入4倍当量的乙酸铵，在氮气气氛下110℃下反应3-7h后恢复至室温，旋干溶剂，加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取两次后，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩旋干后直接进行下一步。将得到的产物溶解在无水二氯甲烷中，在-20℃，N2气氛时，向其中加入三倍当量的N,N-二异丙基乙胺，10min后，再缓慢加入5倍当量的三氟化硼乙醚后，恢复至室温并搅拌2-5h后，缓慢加入饱和食盐水，并用二氯甲烷萃取两次后，有机相用无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩旋干后使用二氯甲烷与石油醚1:1的比例进行柱层析，最终得到褐色的固体产物，产率为15-25％。
(4)NBDP-Br的合成：将alkyne-NBDP与2-叠氮乙基-2-溴异丁酸酯按照1:1.05的当量比溶解在二氯甲烷中，加入一倍当量的溴化亚铜，一倍当量的N,N-二异丙基乙胺以及一倍当量的乙酸，室温反应12后，加入饱和食盐水，并用二氯甲烷萃取两次后，有机相浓缩旋后使用二氯甲烷与甲醇99:1的比例进行柱层析，最终得到固体产物，产率80％-95％。
使用类似的合成步骤，可合成引发剂OBDP-Br，CBDP-Br，JBDP-Br，并通过氢谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对其进行表征，结果显示与图1-8。
实施例2：
使用上述所制备的基于染料的原子转移自由基聚合引发剂引发亲水单体寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯从而得到大分子荧光探针：FBP 725，FBP 790，FBP 912以及FBP 1025，以FBP 912合成为例，其合成步骤如下所示：
Figure BDA0003276405810000071
具体地，以染料作为原子转移自由基聚合引发剂，通过引发聚合亲水单体得到水溶性的近红外二区大分子荧光探针，其亲水链段的长度可以通过改变聚合条件进行优化，具体为1-500之间。
接下来以FBP 912的合成为例进行具体阐述：
FBP 912探针的具体制备方法如下：将5mg的NBDP-Br，210mg的寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯，0.48mg的三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)加入到含有磁力搅拌子的封管中，向其中加入500mg的二氧六环中，在液氮冻住情况下向其中加入0.3mg的溴化亚铜，充分脱气后封管，在70℃下封管聚合2-8h后，将其沉淀到过量乙醚中，沉淀三次后，放入真空干燥箱进行干燥，最后得到蓝褐色的油状产物。
使用类似的合成步骤，还合成了大分子荧光探针FBP 725，FBP 790，以及FBP1025。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对聚合物的分子量进行表征，其结果如图9-12所示。
实施例3：
该系列大分子荧光探针都具有很好的水溶性以及光稳定性。以FBP 912为例，相对应的大分子荧光探针的粒径以及光稳定性如图13所示。FBP 720，FBP 790以及FBP 1025有相似的效果，在这里不一一列举。
实施例4：
验证得到的大分子荧光探针的近红外二区成像效果。首先测试FBP系列染料(包括FBP 725，FBP 790，FBP 912，FBP 1025)在水中的吸收和发射光谱，如图14。然后将FBP 725，FBP 790，FBP 912以及FBP 1025溶解在PBS中，在同等浓度下分别使用665nm的激光去激发FBP 725和FBP 790，以及808nm的激光去激发FBP 912和FBP 1025，分别使用1100nm，1200nm以及1300nm的长通滤光片进行收集，发现FBP系列染料即使在1300nm的长通滤光片时仍有非常强的亮度，说明FBP系列染料有非常强的近红外二区荧光拖尾发射，结果如图15所示。
实施例5：
该系列大分子荧光探针亮度高，水溶性好，具有很好的血管成像效果，下面以FBP912为例，说明该大分子荧光探针的血管成像效果(其它大分子荧光探针的血管成像效果类似，不一一列举)。健康雌性Balb/c鼠(约25g，6-8周)购自上海斯莱克公司。动物实验遵从《实验动物护理和使用指南》规定，并获得复旦大学动物护理和使用委员会批准。通过尾静脉注射200μL的60mg/mL的FBP 912到约六周龄的Balb/c雌性小鼠中，分别使用1100-1500nm的长通滤光片对老鼠的腹部血管进行成像，发现在使用1500nm的滤光片时，其信噪比可以达到4-5，同时使用该探针也实现了对老鼠头部血管的无损高分辨成像，如图16-17所示。
实施例6：
考察大分子荧光探针在活体内的代谢与分布，以FBP 912为例进行阐述。
将200μL的20mg/mL的FBP 912尾静脉注射健康的雌性Balb/c小鼠中，在不同的时间点收集老鼠的尿液，使用808nm的激光器进行激发，1200nm的长通滤光片收集不同时间点时尿液的荧光强度，然后以不同浓度的FBP 912在PBS中的荧光亮度绘制标准曲线，从而计算出探针从从体内代谢的程度。利用类似的方式，测定小鼠体内的荧光染料浓度随时间的变化，以计算其药代动力学。具体操作如下：在实验设定的时间点时，从小鼠尾静脉取血约50μL，转移到含有肝素钠的试管中，在采集完所有点后，处死实验鼠。将已知不同浓度的FBP912在血液中的亮度作为标准曲线，得到不同时间点FBP 912在血液中的浓度，然后根据已知的药代动力学一阶衰减拟合方法得到血液循环半衰期(t1/2)，每个实验条件下平行采集三只老鼠数据并计算标准偏差。实验结果如图18所示，可以看出FBP 912的消除半衰期为6.1h，在12h时有约65％的FBP 912都从尿液进行代谢出去。
其它大分子荧光探针，如FBP 725，FBP 790，FBP 1025等，其结果类似；由此可见本发明设计的近红外二区大分子荧光探针表现出非常好的生物安全性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种水溶性的近红外二区大分子荧光探针，其特征在于，以氮杂氟硼荧类染料作为发光内核，其结构通式如下：
Figure FDA0003276405800000011
其中：
R1，R2，R3，R4各自独立选自R7；
R7含有亲水性单体R6形成的亲水性聚合物链以及靶向基元R6’形成的聚合物链部分，亲水性单体以及靶向基团的单体通过无规共聚或者嵌段共聚的方式进行可控自由基聚合，x,y分别表示聚合度，其中x为1-500；y为1-10；
R6为亲水性的单体，选自甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯，丙烯酸，N-异丙基丙烯酰胺，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱；
R6’用于后续靶向基团的连接，选自(CH2)pN3，(CH2)pSH，(CH2)pCOOH，(CH2)pOH，(CH2)pNH2，(CH2)pCCH，(CH2)pMI，(CH2)pNHS；其中MI表示马来酰亚胺，NHS表示N-羟基丁二酰亚胺的活性酯；
R5选自R10，R11，R12；
X＝O或者N；当X＝N时，R8为H，CH3，CH3CH2；
R9为连接基元，选自酯键，酰胺键，叠氮与炔基形成的三氮唑结构，巯基与马来酰亚胺的加成产物；
m,p为0-18之间的整数。
2.根据权利要求1所述的水溶性的近红外二区大分子荧光探针，其特征在于，典型的有：FBP 725，FBP 790，FBP 912以及FBP 1025，对应的结构式如下：
Figure FDA0003276405800000021
其中，n为聚合度，独立选自1-500的整数。
3.一种如权利要求1所述的水溶性的近红外二区大分子荧光探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)首先，合成基于氮杂氟硼荧的原子转移自由基聚合的引发剂(BDP引发剂)，该荧光染料的引发剂具有如下通式结构：
Figure FDA0003276405800000022
该氮杂氟硼荧引发剂中具有不同供电子能力的取代基，其中：
R1，R2，R3，R4各自独立选自R7；
R5独立选自R10，R11，R12；
Y独立选自Cl，Br，I；
X＝O或者N；当X＝N时，R8为H，CH3，CH3CH2；
R9为连接基元，选自酯键，酰胺键，叠氮与炔基形成的三氮唑结构，巯基与马来酰亚胺的加成产物；
m,p为0-18之间的整数；
(2)然后，将所述引发剂引发聚合亲水单体，得到完全水溶性的近红外二区荧光探针，其中，亲水单体选自寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯，N-异丙基丙烯酰胺，丙烯酸，N，N-二甲胺基丙烯酰胺；
(3)最后，通过对聚合度的优化设计，得到在水中完全溶解的粒径在3-5nm的单链荧光探针。
4.如权利要求1或2所述的水溶性的近红外二区大分子荧光探针在血管、淋巴或肿瘤成像中的应用。
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