CN113736456A - 一种基于叶酸偶联碳量子点的肿瘤靶向纳米探针及其制备方法 - Google Patents

一种基于叶酸偶联碳量子点的肿瘤靶向纳米探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种碳量子点，它由如下原料制成：柠檬酸、尿素、含磷化合物、N,N‑二甲基甲酰胺；所述柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～3):(0.5～1.5):(1.6～5)，所述柠檬酸、N,N‑二甲基甲酰胺的质量体积比为：(1～3):(5～15)g/mL；本发明还提供了一种肿瘤靶向纳米探针，它由叶酸和前述碳量子点共价连接而成。本发明碳量子点发射波长长、活体成像表现佳、量子产率高、穿透性强、安全性高、细胞摄取量大、稳定性高且制备方法便捷易行的碳点XLLCDs，能够成功与叶酸实现偶联，偶联后在肿瘤细胞中具有更强的特异性摄取，能够在体内靶向肿瘤成像，是一种优异的肿瘤探针材料，在生物成像领域具有极高的应用价值。

Description

一种基于叶酸偶联碳量子点的肿瘤靶向纳米探针及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物成像材料领域，具体涉及肿瘤靶向纳米探针及其制备方法。
背景技术
目前，癌症仍然是全球性的公共卫生问题，随着正常细胞通过复杂的转化过程癌变，肿瘤生物标志物在早期癌症诊断方面发挥了强大作用，表现出可靠的分析，诊断和预测价值。当前的方法，例如用于检测癌症生物标志物的免疫测定等方法无法完全满足临床需求。
在此同时，生物医学领域进步的光学成像的研究已经将癌症诊断研究推向了新的领域，光学成像具有出色的灵敏度和分辨率。尤其是荧光成像使其过程可以可视化。因此，生物标志物越来越多地被采用用于癌症的荧光靶向和成像。叶酸受体(FR)是重要的癌症生物标志物之一，分子量为38kDa，在许多恶性上皮细胞(包括卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌等癌细胞)中异常高表达，而在正常细胞中分布极少。
不同程度的FR表达使得可以通过检测FR的表达来检测癌症。叶酸(FA)由于其高的特异性亲和力、稳定性和相容性是FR的理想配体。叶酸(FA)是一种易于连接的代谢性维生素，FA及其结合物可以通过受体介导的内吞作用被内化进细胞，具有非免疫原性。因此FA与荧光纳米材料相偶联制成荧光探针材料的策略有望用于探测FR，从而识别癌细胞。
荧光探针材料通常具有以下特征：(1)高荧光量子产率，可以大大提高灵敏度；(2)长吸收和发射波长，可以克服生物系统中自发荧光引起的干扰并提高了荧光检测的信噪比；(3)斯托克斯位移大，可减少荧光检测由荧光自猝灭和瑞利引起的误差散射；(4)优异的溶解性和稳定性，可抑制荧光物质的聚集，同时良好的抗光漂白能力和光稳定性都有利于荧光材料在分析和检测中的应用；(5)优异的生物相容性，这对于体内生物成像十分重要。
已有研究将具有良好光学性能的传统量子点(QD)与FA连接以标记癌细胞。但是大多数量子点包含对细胞有毒的重金属元素，影响其在生物医学利用。所以选择更良性的荧光纳米材料替换QD十分必要。碳量子点(CD)，简称碳点，是纳米碳的新兴成员，已被证明是生物成像剂的有效候选者。其具有诸多的优势，包含荧光可调、耐光漂白、稳定性好、亲水性强、自发光性、具有良好的生物相容性和易于的表面装饰等优点，正好满足荧光探针材料的需求，优于传统的QD。Song等首先制备了FA偶联的荧光CD，用于区分HeLa癌细胞(J.Mater.Chem.22(2012)12568–12573.)。Lei等报道了用FA对CD进行氢键修饰，以增强光学性能。细胞成像的空间分辨率(Biosens.Bioelectron.64(2015)119–125)。Lei等进一步制备了通过静电相互作用打开荧光探针(FA-PEI-CD)在FA和PEI-CD之间实现快速，专一地渗透到HeLa中和HepG2癌细胞(Sens.Actuators B:Chem.230(2016)714–720)。其他一些文献也报道了将荧光CD与FA结合作为追踪癌细胞的识别标签。
然而，随着荧光探针技术的不断发展，对碳点的波长、稳定性、生物相容性等提出来更多、更高的要求。而碳点作为一类相对独立的纳米材料，碳源的微小变化，便可能产生出一种新的碳点，造成性能的迥异，与FA的偶联同样可能对碳点的性能造成无法预料的影响。因此，对具有更优异性质的碳点进行不断探索，研发一种发射波长长，稳定性、生物相容性好，且量子产率高的新碳点，并与叶酸成功偶联实现对肿瘤的靶向荧光成像，将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发射波长长，稳定性、生物相容性好，且量子产率高的新碳点以及该碳点偶联叶酸形成的能够有效实现肿瘤荧光成像的探针。
本发明提供了一种碳量子点，它由如下原料制成：柠檬酸、尿素、含磷化合物、N,N-二甲基甲酰胺；
所述柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～3):(0.5～1.5):(1.6～5)，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为：(1～3):(5～15)。
优选地，所述柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～2):(1～1.5):(1.6～2)。
进一步地，上述含磷化合物为磷酸、磷酸盐、五氧化二磷、磷酸氢二铵、焦磷酸钠中的至少一种。
更进一步地，上述含磷化合物为磷酸；优选地，所述磷酸为85％的分析级磷酸。
更进一步地，上述柠檬酸、尿素、含磷化合物的质量比为2:1:1.685，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为2:10。
更进一步地，上述碳量子点按照如下方法制备而成：按比例称取各原料，混合溶解均匀，150～200℃下反应8～12h，冷却，离心取溶液，除去有机溶剂，即得；优选为180℃下反应10h。
本发明还提供了一种肿瘤靶向纳米探针，它由叶酸和上述的碳量子点共价连接而成。
进一步地，上述叶酸和碳量子点的质量比为1:(1～4)；优选为1:1。
本发明还提供了上述肿瘤靶向纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备碳量子点：取柠檬酸、尿素、含磷化合物、N,N-二甲基甲酰胺混合溶解均匀，在150～200℃下反应8～12h，冷却，离心取溶液，除去N,N-二甲基甲酰胺，得到碳量子点；
(2)制备叶酸活性酯：将叶酸、EDC、NHS混匀，20～30℃反应8～15h，得到叶酸活性酯；
(3)肿瘤靶向纳米探针的制备：取步骤(1)制得的碳量子点溶于溶剂中，滴加到步骤(2)制得的叶酸活性酯中，20～30℃反应20～30h。
进一步地，上述步骤(1)所述柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～3):(0.5～1.5):(1.6～5)，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为：(1～3):(5～15)；优选的，柠檬酸、尿素、含磷化合物的质量比为2:1:1.685，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为0.2g/mL；所述反应为：在180℃下反应10h；
步骤(2)所述的叶酸、EDC、NHS的摩尔比为1:(2～5):(1～4)，优选为1:3:2；
步骤(3)所述溶剂为PBS缓冲液；所述叶酸活性酯和碳量子点的质量比为1:(1～4)，优选为1:1；所述的反应为：在20～30℃下反应24h。
本发明还提供了上述碳量子点或肿瘤靶向纳米探针在肿瘤荧光成像试剂中的用途。
本发明的碳点具有如下有益效果：发射波长长、活体成像表现佳、量子产率高、穿透性强、安全性高、细胞摄取量大、稳定性高且制备方法便捷易行，能够成功与叶酸实现偶联，偶联后在肿瘤细胞中具有更强的特异性摄取，是一种优异的肿瘤探针材料，在生物成像领域具有极高的应用价值。
本发明权利要求所述的“柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比”指的是柠檬酸的质量和N,N-二甲基甲酰胺的体积的比例，比例的单位为μg/μL、g/mL或kg/L等，以此类推。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为XLLCDs的红外谱图。
图2为XLLCDs的TEM电镜照片。
图3为XLLCDs的紫外光谱图。
图4为XLLCDs的荧光光谱图。
图5为ACUCDs的荧光光谱图。
图6为GACDs的荧光光谱图。
图7为OTCDs的荧光光谱图。
图8为UCPG-Fe的荧光光谱图。
图9为N-CDs的荧光光谱图。
图10为XLLCDs的叶酸、碳点不同质量比下的荧光光谱图。
图11为XLLCDs的叶酸：碳点不同质量比下的紫外光谱图。
图12为FA-XLLCDs荧光强度受盐离子浓度的影响。
图13为FA-XLLCDs荧光强度受酸碱度的影响。
图14为FA-XLLCDs荧光强度受室温存放时间的影响。
图15为FA-XLLCDs的共聚焦成像试验结果。
图16为Hela细胞、B16细胞摄取FA-XLLCDs的流式图。
图17为正常裸鼠内注射裸碳点ACUCDs、XLLCDs、UCPG-Fe进行活体成像的时间变化图。
图18为正常裸鼠内注射裸碳点ACUCDs、XLLCDs、UCPG-Fe进行组织成像的时间变化图
图19为肿瘤建模裸鼠内注射XLLCDs(上)和FA-XLLCDs(下)进行活体成像的时间变化图。
具体实施方式
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明碳点(XLLCDs)的制备
水热法制备：分别称取柠檬酸2.0g，尿素1.0g置于烧杯中，再加入2mL磷酸，10mLDMF，持续搅拌超声直至溶解。将混合物转移至50mL反应釜中，在180℃的条件下反应10h，自然冷却至室温。将碳点原液以13000r/min转速离心10min，将溶液以油泵旋蒸除去DMF，得到碳点固体。
实施例2、本发明肿瘤靶向纳米探针的制备
叶酸活性酯的制备：
精密称定88.28mg叶酸、115.02mgEDC、46.04mgNHS于圆底烧瓶中，加入4mLPBS(pH7.4)，充分震荡，使其溶解完全，在磁力搅拌器上持续搅拌过夜，以达到活化FA的目的。
本发明肿瘤靶向纳米探针的制备：
精密称定88.28mg实施例1制备的XLLCDs于微量离心管中，加入2mLPBS(pH7.4)溶解，缓慢滴加至搅拌的2mL叶酸活性酯中，后在磁力搅拌器上持续搅拌24h后取出反应液，将其倒入透析袋(MWCO＝500Da)内，先在PBS缓冲液连续透析，再换超纯水中连续透析24h，袋内溶液即为纯化后的FA-XLLCDs溶液，将其进行冷冻干燥处理，可得FA-XLLCDs固体粉末。整个反应过程遮光进行，以避免FA见光失活。
对比例1、其它碳点的制备
(1)对比例1-1：ACUCDs(柠檬酸铵-尿素碳点)
制备方法：称取1g柠檬酸铵，1g尿素于研钵中，充分研磨至混匀，后将混合物转移至坩埚中，加盖后于电阻炉中150℃条件下加热10h，反应结束后，冷却至室温，加入40mL超纯水使用超声波清洗机进行超声帮助提取，将提取液进行过滤，将滤液用透析袋(MWCO＝500Da)透析24小时、冻干，得到碳点固体备用。
(2)对比例1-2：GACDs(葡萄糖-天冬氨酸碳点)
通过热裂解法制备：分别称取1.26g葡萄糖和0.34g天冬氨酸于研钵中，研磨均匀后转移至坩埚中，加入1M NaOH适量调pH为7。再将混合物加热至125℃，并保持30分钟。再加热至200℃，并保持20分钟。之后，将粗产物自然冷却至室温。再将产物溶于20mL水中，超声溶解后并进行抽滤，将滤液用透析袋(MWCO＝500Da)透析24小时、冻干，得到碳点固体，备用。
(3)对比例1-3：OTCDs(邻苯二胺-色氨酸碳点)
制备方法：首先称取0.108g的邻苯二胺和0.051g色氨酸于50mL烧杯中,然后加入10ml去离子水和200μl浓盐酸，用玻棒将上述反应物充分搅拌均匀至完全溶解，以减少反应误差，再移入反应釜内，在200℃条件下加热反应12h后防止冷却。将反应物进行过滤，将滤液用透析袋(MWCO＝500Da)透析、冻干，得到碳点固体，备用。
(4)对比例1-4：UCPG-Fe(柠檬酸-尿素-PEG-Fe碳点)
制备方法：分别称取1.0g柠檬酸、2.0g尿素置于研钵中，先后加入5ml水、15mlPEG400进行研磨，待分散均匀后加入0.5g六水合三氯化铁继续研磨至均匀。将样品转移至反应釜中，于240℃反应3h，经丙酮二次萃取、过滤、烘干即得碳点固体。
(5)对比例1-5：N-CDs(对苯二胺-乙二胺碳点)
通过微波法制备：称取0.2g对苯二胺于烧杯中，然后量取5mL乙二胺加入烧杯中，用玻棒持续搅拌直到对苯二胺完全溶解。再将混合物放入微波炉中，在500W的功率下持续加热20分钟，然后将烧杯冷却至室温。之后，将盐酸(5M)滴加至溶液中产生气泡，然后不断加入盐酸直至气泡消失为终止，调pH为7。后进行抽滤，再用透析袋(MWCO＝500)透析24小时除去残留的未反应的小分子，即得N-CDs溶液，烘干即得。
对比例2、其它叶酸偶联碳点的制备
(1)对比例2-1：叶酸偶联ACUCDs碳点
称取88.28mg叶酸、115.02mgEDC、46.04mgNHS于圆底烧瓶中，加入4mLPBS(pH7.4)，充分震荡，使其溶解完全，在磁力搅拌器上持续搅拌过夜，以达到活化FA的目的。
称取88.28mg ACUCDs(对比例1-1)于微量离心管中，加入2mLPBS(pH＝7.3)溶解，混合均匀后缓慢滴加至搅拌中的2mL叶酸活性酯中，再滴加适量乙二胺调pH为9，后在磁力搅拌器上持续搅拌24h后取出反应液，将其倒入透析袋(MWCO＝500Da)内，先在PBS缓冲液连续透析，再换超纯水中连续透析，并每隔一定时间取袋内溶液监测其280nm处紫外-可见吸收至不再改变，袋内溶液即为纯化后的FA-ACUCDs溶液，将其进行冷冻干燥处理，可得FA-ACUCDs棕色固体粉末。整个反应过程遮光进行，以避免FA见光失活。
(2)对比例2-2：叶酸偶联UCPG-Fe碳点
精密称定88.28mg叶酸、115.02mgEDC、46.04mgNHS于圆底烧瓶中，加入4mLPBS(pH7.4)，充分震荡，使其溶解完全，在磁力搅拌器上持续搅拌过夜，以达到活化FA的目的。
精密称定88.28mg UCPG-Fe(对比例1-4)于微量离心管中，加入2mLPBS(7.4)溶解，缓慢滴加至搅拌的2mL叶酸活性酯中，再滴加乙二胺调pH为9，后在磁力搅拌器上持续搅拌24h后取出反应液，将其倒入透析袋(MWCO＝500Da)内，先在PBS缓冲液连续透析，再换超纯水中连续透析24h，袋内溶液即为纯化后的FA-CDs溶液，将其进行冷冻干燥处理，可得FA-UCPG-Fe固体粉末。整个反应过程遮光进行，以避免FA见光失活。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、碳点荧光性能的表征
1、实验方法
取一定浓度的XLLCDs溶液滴于铜网上，待至其自然晾干后，在透射电镜下(TEM)观察该碳点的形貌、粒径；取冻干后的XLLCDs与溴化钾粉末，按照一定合适的比例混合均匀后压制成透明薄片，利用红外光谱仪测定XLLCDs的红外吸收光谱图。取一定浓度XLLCDs溶液，置于石英比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定XLLCDs的紫外吸收光谱；取一定合适浓度XLLCDs溶液，置于四通荧光比色皿中，在荧光分光光度计上测定其不同激发波长下的荧光光谱。
2、实验结果
图1为XLLCDs的红外光谱图。如图2所示，制备所得XLLCDs在透射电镜下呈现明显单分散的类球形颗粒，粒径均一在5nm左右。由图2的红外吸收光谱图可知，以3430.02cm-1为中心的吸收峰归属于O-H和N-H的伸缩振动的特征吸收带，1101.21cm-1的峰可能是体现C-N的伸缩振动，1452.21cm-1为C-O的弯曲振动，以上结果证实XLLCDs碳点的成功合成，碳点的粒径分布均匀。
图3是XLLCDs的紫外-可见吸收光谱，在图上可以观察到XLLCDs有两个吸收峰，分别为230nm、340nm处。检测到的340nm的吸收可能是n～π*跃迁产生的吸收所致。本发明荧光光谱如图4所示，从内嵌图4-i和4-ii可知，在日光下碳点溶液目测观察为深红色透明澄清溶液，在365nm紫外灯下观察到发出明显的红色荧光。XLLCDs在激发波长从520nm增至570nm过程中，其荧光强度逐渐增大，发射峰的位置略微红移(625～635nm)，在激发波长从570nm～600nm移动，荧光强度逐渐降低，并且发射峰的位置略微红移(635～655nm)。在570nm激发波长下于635nm处发射出最大强度荧光。
上述结果说明XLLCDs表现出良好的荧光性能。
同样对对比例1-1～1-5的碳点进行荧光光谱检测，ACUCDs(对比例1-1)的荧光光谱如图5所示，在激发波长从460nm增至500nm过程中，ACUCDs的荧光强度先增强后减弱，发射区随着激发波长的改变有略微移动(550nm～575nm)，在490nm的波长激发下可产生570nm的最大发射。由图5-i和5-ii可知，在可见光下ACUCDs显示为棕黄色澄清溶液，在365nm紫外灯下则发射出十分强的绿色荧光。
GACDs(对比例1-2)的荧光光谱如图6所示，在激发波长从380nm增至450nm的过程之中，GACDs的荧光强度先增强后减弱，发射区随着激发波长的增加有比较明显红移(485nm～540nm)，在440nm的波长激发下可产生535nm的最大发射。由图6-i和6-ii可知，在可见光下ACUCDs目测为淡棕色澄清溶液，在365nm紫外灯下发射出较强的绿色荧光。
OTCDs(对比例1-3)的荧光光谱如图7所示，在激发波长从380nm增至450nm过程中，在450nm的波长激发下可产生535nm的最大发射。由图7-i和7-ii可知，ACUCDs在可见光下为淡棕色澄清溶液，在365nm紫外灯下发射较强的红色荧光。
UCPG-Fe(对比例1-4)的荧光光谱如图8所示，在激发波长从400nm增至520nm过程中，UCPG-Fe的荧光强度先增强后减弱，发射区随着激发波长的改变有较明显红移(500nm～575nm)，在480nm的波长激发下可产生555nm的最大发射。由图8-i和8-ii可知，UCPG-Fe在可见光下为橙红色澄清溶液，在365nm紫外灯下发射较强的黄色荧光。
N-CDs(对比例1-5)的荧光光谱如图9所示，在激发波长从380nm变化至430nm过程中，GACDs的荧光强度先增强后减弱，发射区随着激发波长的改变变化较小(520nm～535nm)，在420nm的波长激发下可产生530nm的最大发射。由图9-i和9-ii可知，在可见光下N-CDs目测为深棕色溶液，在365nm紫外灯下发射较强的绿色荧光。
上述结果可以看出，GACDs和N-CDs最大发射波长较短，穿透性差，不适宜进行体内外实验。OTCDS虽然荧光性能佳，由于原料中含有邻苯二胺，在目前的纯化条件下难以纯化干净，毒性较大，同样不适于进行体内体外实验。而ACUCDs、XLLCDs、UCPG-Fe三种碳点，荧光性能较佳，但本发明XLLCDs碳点的荧光性(λem＝620nm)能最佳。
选用ACUCDs、XLLCDs、UCPG-Fe三种碳点偶联FA进一步进行研究。
实验例2、碳点的量子产率
1、实验方法
使用参比法来测定ACUCDs的荧光量子产率，标准物选用激发和发射波长较为接近的罗丹明6G。分别测出一定浓度的罗丹明6G乙醇溶液和一定浓度的ACUCDs溶液在490nm处的吸光度值(小于0.05)以及荧光光谱图，计算用发射光谱的面积积分对相应的吸光度值作图所得曲线的斜率，并根据公式1计算碳点的量子产率。
用参比法对XLLCDs的荧光量子产率进行测定，选定罗丹明B(0.1MH2SO4)作为标准物。分别测出一定浓度的罗丹明B乙醇溶液和一定浓度的XLLCDs溶液在540nm处的吸光度值(小于0.05)以及荧光光谱图，计算得到发射光谱的面积积分，然后再对相应的吸光度值作图，得到曲线的斜率，并根据公式(1)计算碳点的量子产率。
通过参比法对UCPG-Fe的荧光量子产率进行测定，选定罗丹明B作为标准物。分别测出一定浓度的罗丹明B乙醇溶液和一定浓度的碳点溶液在540nm处的吸光度值(小于0.05)以及荧光光谱图，并根据公式(1)计算碳点的量子产率。
Figure BDA0003257136210000081
公式中
Figure BDA0003257136210000082
表示荧光量子产率，“K”表示发射光谱的面积积分对吸光度值作图所得曲线的斜率，“η”表示溶剂的折射率，“x”和“st”分别表示待测液和标准液。
2、实验结果
ACUCDs碳点的量子产率为23.15％，UCPG-Fe的量子产率为13.76％，本发明XLLCDs的量子产率高达25.07％。
通过对XLLCDs的原料柠檬酸、尿素、含磷化合物的用量配比、制备条件筛选，如下表所示。可见，柠檬酸、尿素、含磷化合物投料比为2:1:1.685，180℃下反应10h为优选所得最佳反应条件(实施例1)，碳点荧光量子产率最高，达到25.07％。
柠檬酸:尿素:磷酸(质量比) 反应时间(h) 反应温度(℃) 量子产率(％)
2：1：1.685 8 180 10.68
2：1：1.685 12 180 24.86
2：1：1.685 10 150 11.95
2：1：1.685 10 200 21.71
1：1.5：1.685 10 180 13.14
1.5：1.5：1.685 10 180 17.65
2：1.5：1.685 10 180 22.07
2：1：1.685 10 180 25.07
2：1.：2 10 180 23.58
实验例3、本发明裸碳点XLLCDs和叶酸偶联碳点FA-XLLCDs的体外表征
1、偶联工艺考察
影响偶联的因素主要是叶酸和碳点的质量比，因此为了确定最佳的偶联条件，进行了多种叶酸和XLLCDs碳点质量比的筛选，选择了4：1、2：1、1：1、1：2、1：4这五种叶酸碳点质量比，在其余条件相同的情况下通过比较荧光光谱、紫外光谱、偶联量、量子产率来确定最终的偶联条件。
从图10中可以看出，5种叶酸碳点质量比的情况下，FA-XLLCDs偶联物的荧光光谱的最佳发射波长有一定变化(550nm-575nm)，最大激发波长差距也较小(450nm-470nm)，以上说明改变叶酸碳点质量比一定程度上还是会对偶联物的荧光性能造成一定影响，在叶酸投料量不变的前提下，提高碳点的投料量，有助于最佳发射波长红移。
通过紫外图谱图11发现，叶酸碳点质量比越大，叶酸280nm处的吸收峰越明显，在偶联物的图谱上体现得更加明显。
收集5种质量比制得的FA-XLLCDs偶联物的24h透析袋外液，利用HPLC法进行测定，用标准曲线法进行含量计算，按公式计算：
偶联率(％)＝((mFA总-mFA透)/mFA总)*100％
mFA总-总FA投料量(mg)；
mFA透-透析袋外FA总量(mg)；
偶联率如表1所示：
表1不同FA-ACUCDS叶酸碳点质量比情况下的偶联率
Figure BDA0003257136210000091
可见，随着质量比减小，偶联率增加。说明随着碳点XLLCDs投料量增大，偶联上的叶酸量也增多，但到一定程度后，叶酸偶联量基本维持不变。质量比到达1：1后变化幅度减小。
通过参比法测定不同FA-XLLCDs叶酸碳点质量比情况下的偶联物的荧光量子产率，选定罗丹明B作为标准物。分别测出罗丹明6G乙醇溶液和碳点溶液在540nm处的吸光度值(小于0.05)以及荧光光谱图，并根据公式(1)计算碳点的量子产率，结果如表2所示。
表2不同FA-XLLCDs叶酸碳点质量比情况下的量子产率
Figure BDA0003257136210000092
结果表明，随着质量比减小，碳点投料量增大，量子产率总体呈现变大的趋势。量子产率在叶酸碳点质量比在1：1的情况下基本上不再随着碳点投料量增加而增加。
综上所述，结合荧光光谱、紫外光谱、偶联率、荧光量子产率、产率等因素，选择1：1作为最佳叶酸碳点质量比，在保证较高的量子产率的同时，大量叶酸被成功偶联，满足体内体外实验使用需求。
2、FA-XLLCDs的稳定性
(1)盐浓度对FA-XLLCDs的影响
取1mL FA-XLLCDs溶液于10mL容量瓶中，加入不同浓度的NaCl溶液，定容，分别测定各自的荧光强度。结果如图12所示，在0～1.3mg/L浓度范围NaCl溶液中，随着NaCl溶液浓度的增大，FA-XLLCDs荧光强度稳定，说明FA-XLLCDs荧光强度受盐溶液影响小，稳定性良好。
(2)pH值对FA-XLLCDs的影响
取1mL FA-XLLCDs至10mL容量瓶中，加入不同pH值的缓冲盐溶液，定容，分别测定各自的荧光强度。如图13所示，在pH＝2～11的BR缓冲液中，FA-XLLCDs在酸性至中性的环境下随着pH增加荧光强度缓慢增加，中性至碱性条件(pH＝9)下荧光强度剧增，在强碱性环境下较稳定，在细胞环境(pH＝7.3)附近有较强的荧光强度。
(3)存放时间对FA-XLLCDs的影响
将FA-XLLCDs溶液于室温下储存放置一段时间后取出，测定其荧光强度，以考察存放时间对其荧光强度的影响，如图14所示，FA-XLLCDs在室温放置8h后，测定荧光强度仅有略微的下降，说明该碳点能在室温下稳定储存。
上述结果说明，本发明FA-XLLCDs偶联物在盐溶液环境、以及细胞外环境pH下稳定性好，荧光强度受影响小，有利于在体内环境中应用；并且，还能够长时间稳定储存。
3、细胞毒性实验
采用CCK8测试法检测XLLCDs和FA-XLLCDs的细胞毒性，所用的XLLCDs和FA-XLLCDs的浓度分别为：(250μg/m L、500μg/m L，1000μg/mL、1500μg/mL、2000μg/mL。
检测发现XLLCDs和FA-XLLCDs在上述所有浓度情况下细胞活力都高于80％，说明XLLCDs和FA-XLLCDs具有良好的生物相容性，即便在较高浓度2000μg/mL的情况下。表明XLLCDs和FA-XLLCDs均适合进行下一步的体内体外实验，安全性较高，几乎无毒。
4、FA-XLLCDs的体外成像实验
细胞成像时，将细胞转移至已放入灭菌的爬片的12孔板中，在培养箱中培养24h后，吸出培养基，分别向不同的孔中加入含1000μg/mL XLLCDs和FA-XLLCDs的新鲜培养基，将三种细胞和FA-XLLCDs共同孵育12h后，吸出含荧光材料的培养基，再用PBS溶液(0.01M，pH＝7.3)清洗3次，以充分除去游离死细胞以及游离材料，再每孔加入0.4mL4％多聚甲醛溶液固定细胞15min，然后用PBS溶液(0.01M，p H＝7.3)清洗1次，再每孔加入1mL 1mg/mLDAPI溶液孵育10min对细胞核进行染色，然后再用PBS溶液(0.01M，p H＝7.3)清洗2次，除去多余DAPI染料；；于载玻片中间加入一滴防荧光猝灭剂，用镊子取出孔板中的爬片，待水分减少一定程度后，将有细胞一面向下扣于滴了防荧光猝灭剂的载玻片中央，封片后于激光共聚焦显微镜下观察，选取500nm激发通道，以避免生物背景和叶酸的干扰，拍照记录。在对照实验中，除加入不含FA-XLLCDs的新鲜培养基，其余的操作步骤与上述过程一致。
结果如图15所示，在激光共聚焦显微镜通道500nm下，如对照试验结果所示，HELA细胞与B16细胞以及A549细胞本身均没有荧光，排除了细胞背景的干扰。在加入FA-XLLCDs的情况，可以观察到Hela细胞与B16细胞以及A549细胞在FR表达程度上存在很大的差距，理论上讲，由于FA 与FR之间可产生很强的亲和力，FA-XLLCDs偶联物可通过FR受体介导的内吞作用自发地进入Hela细胞，使得Hela细胞中荧光强度更强。如图所示，将FA-ACUCDs偶联物分别与Hela细胞、B16细胞以及A549细胞共孵育12h后，B16细胞以及A549细胞中呈现较弱的荧光，而Hela细胞呈现出明亮的红色荧光。与预期所想一致，FA-XLLCDs偶联物可以通过FR受体的介导更有倾向性地被摄取进FR高表达的细胞。
而在加入XLLCDs的情况下，Hela细胞、B16细胞以及A549细胞的摄取结果没有明显区别，呈现接近的红色荧光，并且荧光强度均不如FA-XLLCDs组的Hela细胞，进一步证明，没有用叶酸修饰的XLLCDs不具有选择性，可以无特异性地被不同细胞摄取，证明可以很容易地进入多种肿瘤细胞，而被叶酸修饰的FA-XLLCDs具有选择性，更容易被叶酸受体高表达的HeLa细胞摄取。此外，在成像图中细胞几乎没有出现形态损伤的迹象，这进一步验证了FA-XLLCDs偶联物的低毒性和高生物相容性。
5、FA-XLLCDs的摄取定量实验
(1)酶标仪测定
首先将HeLa细胞和B16细胞在37℃恒温培养箱中进行培养。用于摄取实验时，在无菌台内将细胞液消化离心转移至无菌96孔板中，在培养箱中培养24h后，吸出培养基，加入含1000μg/mL FA-XLLCDs的新鲜培养基100μL，将三种细胞和FA-XLLCDs共同孵育12h后，再用PBS无菌溶液(0.01M，p H＝7.4)清洗3次，以充分除去游离死细胞以及游离材料，再向每孔中加入100μLDMSO溶液，在酶标仪下测定激发波长470nm，发射波长550nm下的荧光值。
参照上述测定方法，同样对FA-ACUCDs(对比例2-1)进行检测，在酶标仪下测定激发波长400nm和发射波长530nm下的荧光值；对FA-UCPG-Fe(对比例2-2)进行检测，在酶标仪下测定激发波长470nm和发射波长550nm下的荧光值，，结果如表3所示，可以观察到Hela细胞检测到的荧光值均比A549细胞检测到的值大，平均增加98％，和细胞成像实验结果也吻合，进一步证明偶联了叶酸的碳点对FR受体高表达的肿瘤细胞具有选择性。而且，本发明的FA-XLLCDs的细胞摄取量显著高于对比例2-1和对比例2-2，说明本发明的FA-XLLCDs更易被细胞摄取，更适于进行体内成像。
表3酶标仪摄取定量实验结果
Figure BDA0003257136210000111
(2)流式细胞仪测定
首先将Hela细胞和B16细胞在37℃恒温培养箱中进行培养。用于流式实验时，在无菌台内将细胞液消化离心转移至无菌12孔板中，在培养箱中培养24h后，吸出培养基，加入含1000μg/mL FA-XLLCDs的新鲜培养基1mL，将三种细胞和FA-XLLCDs共同孵育12h后，再用PBS无菌溶液(0.01M，p H＝7.4)清洗3次，以充分除去游离死细胞以及游离材料，再加入适量不含EDTA的胰酶消化3分钟，加入不含双抗和血清的DMEM培养基停止消化，吹打收集细胞于细胞流式管中，用低速离心机1200r/min离心3min，弃去上清液，加入500μLpbs(pH＝7.3)吹打均匀，使用细胞流式仪进行检测，通道选择BV605，结果如图16所示，结果表明Hela细胞内摄取FA-ACUCDs量明显大于B16细胞的摄取量，约为B16细胞摄取量的1.55倍，与细胞成像实验和酶标仪定量实验的结果基本吻合。表明被叶酸修饰的FA-XLLCDs具有选择性，更容易被叶酸受体高表达的肿瘤细胞摄取。
实验例4、本发明碳点XLLCDs的体内成像研究
对于体内生物分布成像研究，向裸鼠(≈20g)体内腹腔注射0.1mL10mg/mL的XLLCDs碳点溶液，利用活体成像技术记录一段时间内体内荧光变化过程，选择通道激发波长＝550nm，发射波长＝620nm，每5分钟依次拍照记录。同样的方法，选择通道激发波长＝420nm，发射波长＝520nm对ACUCDs(对比例2-1)进行拍照记录；选择通道激发波长＝470nm，发射波长＝560nm对UCPG-Fe(对比例2-2)进行拍照记录。此外，为了进一步探索裸碳点在体内主要组织的分布规律，器官成像用于探索XLLCDs的生物分布和排泄途径。为了同时获得器官成像，将XLLCDs溶液在不同时间点分别注入昆明小鼠(≈20g)(在处死小鼠之前70、60、50、40、30和20分钟)，设置两组平行组。取心、肺、脾、肝、肾这五个主要器官成像，选择相应的激发波长和发射波长拍照记录。
结果如图17、图18所示。没有动物表现任何实验过程中出现急性毒理反应的迹象，说明三种碳点的生物相容性良好。本发明XLLCDs的红色荧光以及ACUCDs的绿色荧光均可以有效地穿透老鼠的皮肤和组织，具有很好的渗透性，但UCPG-Fe的黄色荧光可能不能有效地穿透老鼠的皮肤和组织，不适宜进行活体体内成像。ACUCDs和XLLCDs在心、肺和脾几乎观察不到荧光，肝和肾的荧光信号明显强于其他三个器官，并且荧光信号强度随时间推移逐渐降低，这与全身活体成像的结果基本一致。ACUCDs 50min后体内荧光基本上全部褪去，基本无蓄积；XLLCDs由于自身量子产率高，并且是长波长发射的碳点，因此荧光褪去的时间明显比绿色碳点慢，更适于长时间显像观测。
实验例5、FA-XLLCDs的体内靶向性
采取细胞接种，将培养的处于对数生长期的Hela细胞收集重悬于不含血清和双抗的DMEM培养液或PBS(0.01M，pH＝7.3)中，将浓度调整为1×107，放于冰盒中携至动物房，用1mL的注射器取适量细胞悬液向裸鼠背部皮下部位接种部位注射0.1mL，一般接种部位刚开始两天会有一个明显突起，而后消失，大约接种一周后出现肿瘤，待长至0.5cm3后进行体内成像实验。
取5mg/mLFA-XLLCDs溶液于肿瘤处进行瘤内多点注射，注射体积为100μL，利用活体成像技术记录一段时间内体内荧光变化过程，选择通道激发波长＝470nm，发射波长＝560nm，每5分钟拍照记录一次，结果如图所示。
几天后待同一只裸鼠体内碳点XLLCDs已完全消除后，取5mg/mLXLLCDs溶液于肿瘤处进行瘤内多点注射，注射体积为100μL，利用活体成像技术记录一段时间内体内荧光变化过程，选择通道激发波长＝550nm，发射波长＝620nm，每5分钟拍照记录一次，结果如图19所示。
结果表示，偶联物及裸碳点在瘤内总体趋势一致，注射15min达到峰值，有强烈荧光信号被观察到，但是荧光信号消退速度却有一定区别，注射裸碳点的实验结果显示大约40min时，荧光信号已经很微弱，而注射偶联物的组内40min时仍可以观察到很强烈的荧光，大约60min时的荧光信号强度才接近于裸碳点组40min的荧光强度。上述结果再次证明偶联了叶酸的碳点对FR受体高表达的肿瘤细胞具有选择性，本发明FA-XLLCDs碳点可以实现体内肿瘤靶向成像。
综上，本发明提供了一种发射波长长、活体成像表现佳、量子产率高、穿透性强、安全性高、细胞摄取量大、稳定性高且制备方法便捷易行的碳点XLLCDs，能够成功与叶酸实现偶联，偶联后在肿瘤细胞中具有更强的特异性摄取，能够在体内靶向肿瘤成像，是一种优异的肿瘤探针材料，在生物成像领域具有极高的应用价值。

Claims (10)

1.一种碳量子点，其特征在于，它由如下原料制成：柠檬酸、尿素、含磷化合物、N,N-二甲基甲酰胺；
所述柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～3):(0.5～1.5):(1.6～5)，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为：(1～3):(5～15)。
2.如权利1所述的碳量子点，其特征在于，所述含磷化合物为磷酸、磷酸盐、五氧化二磷、磷酸氢二铵、焦磷酸钠中的至少一种。
3.如权利要求2所述的碳量子点，其特征在于，所述含磷化合物为磷酸。
4.如权利要求1或2所述的碳量子点，其特征在于，所述柠檬酸、尿素、含磷化合物的质量比为2:1:1.685，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为2:10。
5.如权利要4所述的碳量子点，其特征在于，它按照如下方法制备而成：按比例称取各原料，混合溶解均匀，150～200℃下反应8～12h，冷却，离心取溶液，除去有机溶剂，即得。
6.一种肿瘤靶向纳米探针，其特征在于，它由叶酸和权利要求1～5任一项所述的碳量子点共价连接而成。
7.如权利要求6所述的肿瘤靶向纳米探针，其特征在于，所述叶酸和碳量子点的质量比为1:(1～4)；优选为1:1。
8.权利要求6或7所述的肿瘤靶向纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备碳量子点：取柠檬酸、尿素、含磷化合物、N,N-二甲基甲酰胺混合溶解均匀，在150～200℃下反应8～12h，冷却，离心取溶液，除去N,N-二甲基甲酰胺，得到碳量子点；
(2)制备叶酸活性酯：将叶酸、EDC、NHS混匀，20～30℃反应8～15h，得到叶酸活性酯；
(3)肿瘤靶向纳米探针的制备：取步骤(1)制得的碳量子点溶于溶剂中，滴加到步骤(2)制得的叶酸活性酯中，20～30℃反应20～30h。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)柠檬酸、尿素、含磷化合物质量比为：(1～3):(0.5～1.5):(1.6～5)，所述柠檬酸、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为：(1～3):(5～15)；所述反应为：在180℃下反应10h；
步骤(2)所述的叶酸、EDC、NHS的摩尔比为1:(2～5):(1～4)；
步骤(3)所述溶剂为PBS缓冲液；所述叶酸活性酯和碳量子点的质量比为1:(1～4)，优选为1:1；所述的反应为：在20～30℃下反应24h。
10.权利要求1～5任一项所述的碳量子点或权利要求6或7所述的肿瘤靶向纳米探针在肿瘤荧光成像试剂中的用途。
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