CN103626846A - 与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统。本发明涉及的与MDSCs特异性结合的配体多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的药物输送系统包括所述配体多肽、载药系统、至少一种活性或显像物质。所述载药系统具体为脂质体;所述至少一种活性物质为任何需要被输送到体内特定位置的物质。本发明的配体多肽具有很好的MDSCs靶向作用,该多肽与脂质体结合可以作为靶向药物载体,发展为针对肿瘤的靶向药物输送系统。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质多肽技术领域,尤其涉及一种与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统。
背景技术
肿瘤是影响人类健康的主要原因之一。从理论上说,肿瘤作为机体的非我,免疫系统能够识别,从而抑制肿瘤的发生发展,但事实上肿瘤宿主通常免疫力低下,无法产生有效的抗肿瘤免疫。近年来,有关肿瘤发生发展与机体免疫系统相互作用的肿瘤免疫编辑假说引起了人们的关注。该假说认为肿瘤细胞通过降低自身的免疫原性、下调细胞表面协同刺激分子的表达、释放大量免疫抑制因子、召集多种免疫抑制细胞,形成稳定的肿瘤免疫耐受格局,保护肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视并促进肿瘤的发生发展。也正是这种由肿瘤诱导的免疫耐受导致肿瘤治疗的效果不佳。因此研究肿瘤免疫耐受的产生机制及如何打破肿瘤免疫耐受成为肿瘤学界关注的重点。
髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)于20多年前就已在癌症患者中被描述,但其对免疫系统的重要作用近年来才被重视。现已证实,MDSCs由髓样祖细胞、不成熟巨噬细胞、不成熟粒细胞以及不成熟树突状细胞(dendritic cells,DCs)等不同细胞亚群共同组成,对T细胞反应具有很强的抑制功能。在小鼠,MDSCs表达Gr-1和CD11b两种特异性标志物,故被称作Gr1+/CD11b+髓样细胞。正常小鼠的骨髓和脾脏中分别含有20-30%和2-4%的Gr-1+/CD11b+细胞,但淋巴结中缺乏这类细胞。在正常情况下,这些不成熟的髓样细胞会从骨髓迁移到外周器官并分化成为巨噬细胞、DCs或粒细胞;但急/慢性炎症、创伤、败血症以及肿瘤微环境会促使该群细胞大量扩增和聚集,阻止其分化并诱导其活化,从而发挥其免疫抑制功能。
MDSCs细胞参与调节多种疾病的免疫应答。尽管对MDSCs在免疫应答中发挥作用的最初观察以及现有的大多数资料都来自肿瘤研究,但越来越多的证据显示,MDSCs也可在细菌和寄生虫感染、急/慢性炎症、创伤性应激、败血症或移植中调节免疫应答。
MDSCs最初是在荷瘤小鼠及癌症患者中发现的。当对小鼠移植肿瘤或当转基因小鼠自发肿瘤时,会观察到该群细胞大量扩增。在不同类型癌症患者血液中的MDSCs数量会增加10倍。在荷瘤小鼠脾脏的有核细胞中,Gr-1+/CD11b+细胞的比例可高达20-40%。此外,MDSCs可浸润于癌症患者和荷瘤动物的肿瘤组织及淋巴结,调节宿主对癌细胞的适应性免疫应答。目前认为,该群细胞的聚集是肿瘤免疫逃逸的一个主要机制,多个研究组均证实Gr-1+/CD11b+细胞的聚集与T功能障碍有关,其数量的减少伴随着CD8+T细胞和活化NK细胞抗肿瘤活性的升高。通过对荷瘤小鼠的研究证实,Gr-1+/CD11b+细胞可导致T细胞受体ζ链(CD3ζ,TCR复合体的重要组分)缺失或显著减少;通过生成活性氧或活性氮中间产物抑制CD3/CD28诱导的T细胞激活/增殖;抑制CD8+T细胞生成IFN-γ,以消除对MHC I分子所呈递特异性肽的反应;并阻止细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)的体外发育。此外,Huang等报道称Gr-1+/CD11b+细胞可介导荷瘤小鼠体内的Treg细胞发育,这可能是该群细胞抑制抗肿瘤应答的另一机制。研究表明,共刺激分子CD80与MDSCs的免疫抑制作用有关。卵巢上皮细胞癌小鼠体内Gr-1+/CD11b+细胞表达CD80。阻断CD80后,该群细胞对抗原特异性免疫应答的抑制作用减弱,导致肿瘤生长延缓。进一步研究证实,Gr-1+/CD11b+细胞通过CD80发挥的免疫抑制作用是由CD4+CD25+Treg细胞介导的,并需要细胞毒性淋巴细胞抗原-4(cytotoxic lymphocyteantigen-4,CTLA-4或CD152)的存在。2003年Curiel等报道称,在卵巢癌患者的髓样树突状细胞上发现有共刺激分子PD-L1表达,用单抗阻断PD-L1会增强该群细胞激活T细胞的能力。新近有研究发现,Gr-1+/CD11b+细胞亦可通过表达PD-L1对小鼠卵巢癌产生免疫抑制作用,这为宿主抗肿瘤免疫逃逸提供了新的作用途径。
除肿瘤外,MDSCs还参与了其他疾病的免疫调控。急性克氏锥虫感染可导致T细胞激活、IFN-γ生成增加以及Gr-1+/CD11b+细胞扩增,后者可通过IFN-γ依赖性NO分泌而产生免疫抑制作用。除此之外,急性弓形体病、多种微生物所致败血症、单核细胞增多性李司忒氏菌急性感染,以及蠕虫、绦虫、念珠菌和甲基丝裂霉素性牙龈感染也可导致Gr-1+/CD11b+细胞显著增多。
MDSCs细胞发挥免疫抑制作用的有多种途径。研究表明,MDSCs的免疫抑制作用需要细胞间的直接或间接接触得以发挥,提示该群细胞可能通过细胞表面受体和/或释放可溶性介质来发挥作用。Gr-1+/CD11b+细胞抑制T细胞功能的机制和/或作用途径详述如下:
(1)精氨酸酶1和诱导型一氧化氮合酶。有证据显示,Gr-1+/CD11b+细胞的免疫抑制功能与L-精氨酸有关。L-精氨酸是两种酶的作用底物:一氧化氮合酶和精氨酸酶,前者催化产生NO和瓜氨酸;后者将精氨酸转变为尿素和L-鸟氨酸。MDSCs可表达高水平的精氨酸酶和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS),而这两种酶对T细胞功能的直接抑制作用早已明确。Gr-1+/CD11b+细胞可通过释放上述酶对外源性或自分泌生成的IFN-γ做出反应。新近研究提示,L-精氨酸与T细胞增殖的关系密切。MDSCs中精氨酸酶1的活性升高会导致L-精氨酸的分解代谢增强,而这种非必需氨基酸的缺乏会通过多种不同机制抑制T细胞的增殖,包括降低CD3ζ链以及抑制细胞周期调节因子cyclin D3和周期素依赖性蛋白激酶4的表达。此外,NOS催化L-精氨酸产生的NO可通过抑制T细胞中JAK3和STAT5功能、抑制MHC II类分子表达和诱导T细胞凋亡等途径来抑制T细胞的功能。
(2)活性氧族。导致MDSCs发挥其抑制作用的另一个重要因子是活性氧族(reactiveoxygen species,ROS)。荷瘤小鼠和癌症患者MDSCs共有的一个主要特征是ROS生成显著增多,体外抑制ROS生成会完全消除该群细胞的抑制作用。与抗原特异性T细胞相互作用后,Gr-1+/CD11b+细胞中的ROS显著增多,阻断CD11b、CD18和CD29等整联蛋白可消除ROS的生成以及该群细胞对CD8+T细胞反应的抑制。此外,某些肿瘤源性因子,如TGF-β、IL-13、IL-6、IL-10、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)和GM-CSF也能诱导MDSCs产生ROS。ROS和NO参与MDSCs的免疫抑制作用并不局限于肿瘤这一病症,炎症和微生物感染疾病中增多的Gr-1+/CD11b+细胞在与活化T细胞相互作用后也会产生ROS和NO;相同的现象在急性弓形虫病动物模型中也被观察到。此外在急性克氏锥虫感染实验模型中,Gr-1+/CD11b+细胞可通过IFN-γ依赖性NO生成来发挥其抑制功能。
(3)过氧化亚硝酸盐。研究表明,过氧化亚硝酸盐(ONOO-)是MDSCs抑制T细胞作用过程中的一个重要介质。过氧化亚硝酸盐是NO与超氧负离子(O2-)之间化学反应的产物,是机体产生的一种强氧化剂,可诱导半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸发生硝基和亚硝基化。高水平过氧化亚硝酸盐出现在MDSCs和炎症细胞聚集的部位,与多种类型肿瘤的进展有关,可使T细胞对肿瘤产生无应答。Bronte等研究发现,在人前列腺腺癌中浸润有终末分化的CD8+T细胞,但却处于无应答状态。在这些细胞中发现高水平的硝基酪氨酸,提示在肿瘤微环境中有过氧化亚硝酸盐的生成。抑制恶性前列腺组织中精氨酸酶1和iNOS的表达可导致酪氨酸的硝基化减少,T细胞对肿瘤抗原的免疫应答得以恢复。此外有研究显示,Gr-1+/CD11b+细胞在与T细胞接触过程中生成的过氧化亚硝酸盐可导致TCR和CD8分子发生硝基化,从而改变这些T细胞与特异性肽的结合能力并减弱其对抗原特异性刺激的无应答,但仍能保持对非特异性刺激的应答。这一现象在荷瘤小鼠体内也可观察到。
(4)调节性T细胞。最近有报道称,MDSCs具有促进体内Foxp3+Treg细胞再次发育的能力。MDSCs对Treg细胞发育的诱导需要肿瘤抗原特异性T细胞的激活以及IFN-γ和IL-10的存在,但与NO生成无关。在卵巢癌小鼠中,Gr-1+/CD11b+细胞需表达CTLA-4(CD152)才能实现其对Treg细胞的诱导。在淋巴瘤小鼠模型中,MDSCs可通过与精氨酸酶相关的机制诱导Treg细胞扩增,MDSCs可捕获、加工和呈递肿瘤相关抗原,该过程不需TGF-β的参与。与之相反,Movahedi等研究发现在肿瘤生长过程中Treg细胞比例始终维持在高水平,且与MDSCs数量变化无关,提示MDSCs并未参与诱导Treg细胞。此外,在用抗CD28特异性抗体诱导大鼠对同种异体肾移植物产生耐受后发现,该模型中同时表达CD80和CD86的MDSCs对Treg细胞扩增的作用有限。尽管目前的研究结果之间还存在矛盾,但MDSCs通过分泌细胞因子或细胞间直接作用来参与Treg细胞分化似乎是有可能的。
近年来随着对MDSCs研究的深入,已研制出多种用于逆转MDSCs免疫抑制功能的方法,包括:(1)、抑制MDSCs聚集,如抑制干细胞因子表达、金属蛋白酶9的活性及前列腺素E2的生成;(2)、清除MDSCs,如使用Gr-l抗体;(3)、抑制MDSCs的功能,如使用ARG1和iNOS阻断剂。但遗憾的是由于MDSCs本身的异质性及其所在免疫调节网络的复杂性,上述手段并未获得满意的治疗效果,所以深入了解MDSCs的发生发展对于彻底逆转MDSCs的免疫抑制活性是非常必要的。目前有研究者提出既然MDSCs是一群具有较强可塑能力的细胞群体,即MDSCs既可以向具有正向免疫功能的DC分化,也可以继续维持MDSCs的负性免疫功能或向其他具有免疫抑制活性的细胞如肿瘤相关巨噬细胞分化,那是否意味着MDSCS内存在一个或多个参与调节其发生发展方向的调控靶点。故围绕着MDSCs的调控靶点展开研究可能是今后肿瘤免疫研究的一个方向。
脂质体是和生物膜双层磷脂分子结构类似的的人工膜结构,内部形成封闭的囊泡结构,可以包裹水溶性的的药物,同时在脂质双分子层中也可以载入脂溶性药物。除了可以载药之外,脂质体还具有良好的生物相容性。可以将靶向分子,如多肽,单抗等连接到脂质体上,制成具有主动靶向性的脂质体系统,能够识别靶细胞并且与细胞膜表面的受体分子结合,有利于脂质体内化,以促进药物在细胞内释放,从而提高药效。
由此,针对MDSCs筛选靶向多肽,该靶向多肽与脂质体载药结合,实现促进MDSCs分化或者杀伤MDSCs的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统。将该配体多肽与棕榈酸连接,制成靶向合成材料,然后使用靶向合成材料进一步制备靶向脂质体,测定靶向合成材料和靶向脂质体对体外细胞的影响。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
第一方面,本发明涉及一种与MDSCs特异性结合的配体多肽,包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
优选地,所述配体多肽包括SEQ ID NO.1所示序列,以及在其C末端和/或N末端添加连接基团或连接用氨基酸序列。
第二方面,本发明涉及一种上述的与MDSCs特异性结合的配体多肽形成的游离型多肽、融合型多肽、嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物。
第三方面,本发明涉及一种上述的与MDSCs特异性结合的配体多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
优选地,所述与MDSCs特异性结合的配体多肽用于靶向小分子药物、药物载体、高分子、蛋白、寡核苷酸或基因作用于MDSCs,杀伤MDSCs,减少肿瘤部位MDSCs聚集,减少MDSCs的肿瘤免疫抑制作用。
第四方面,本发明涉及一种靶向药物输送系统,该系统包括:如权利要求1所述的与MDSCs特异性结合的配体多肽、载药结构和至少一种活性或显像物质。
优选地,所述配体多肽被连接于药物输送系统的表面,并与MDSC细胞结合。
优选地,所述载药结构为无机纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体纳米粒、胶束、碳纳米管、细胞器或脂蛋白。
优选地,所述活性物质为抗肿瘤药物,抗代谢药物,细胞毒性药物,光敏剂,激酶抑制剂,抗生素,抗菌素,抗炎药物,免疫抑制剂,抗感染药物,抗病毒药物,目的基因、自杀基因、细胞因子基因、或上述基因的组合,或含有上述基因的真核表达载体DNA;所述显像物质为用于超声造影、放射造影、核医学造影的试剂。
优选地,所述药物输送系统可以包载寡核苷酸分子。如siRNA、microRNA。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明的与MDSCs特异性结合的配体多肽修饰过棕榈算连接为合成材料,制备成的荧光脂质体在体外与MDSC表现出很好的结合效果。
(2)该配体多肽修饰过棕榈酸为合成材料,制备成的全反式维甲酸脂质体在体外促进MDSCs的分化,减少肿瘤部位MDSCs的数量,降低MDSCs的免疫抑制作用。
(3)该配体多肽修饰过棕榈酸为合成材料,制备成的包载siRNA的脂质体在体外与MDSCs表现出良好的结合效果,并起到良好的基因沉默效果,为后续基因给药提供基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为噬菌体库筛选滴度测试图;
图2为FITC-F7(荧光素标记的F7)荧光多肽质谱分析图;
图3为FITC-F7(荧光素标记的F7)荧光多肽与不同细胞结合的荧光强度示意图,其中a为MDSCs,b为Jurkat,c为H1299,d为4T1;
图4为pF7(棕榈酸修饰的F7)多肽修饰脂质的结构示意图;
图5为不同比例多肽脂质的荧光脂质体(HSPC氢化大豆磷脂)与MDSCs、单核细胞(Monocyte)结合荧光强度示意图;
图6为不同比例多肽脂质的荧光脂质体(EPC卵磷脂)与MDSCs、单核细胞(Monocyte)结合荧光强度示意图;
图7为MDSCs靶向多肽修饰胶束与MDSCs、单核细胞(Monocyte)结合荧光强度示意图;
图8为MDSCs靶向多肽修饰金纳米粒子与MDSCs、单核细胞(Monocyte)结合荧光强度示意图;
图9为不同比例多肽脂质修饰全反式维甲酸脂质体的对体外MDSCs细胞影响考察情况示意图;
图10为不同比例多肽脂质修饰阿霉素脂质体的对MDSCs细胞毒性情况示意图;
图11为不同比例多肽脂质修饰的载siRNA不同阳离子脂质体与MDSCs、Monocyte结合荧光强度示意图;
图12为不同比例多肽脂质修饰全反式维甲酸脂质体的对荷瘤小鼠肿瘤部位MDSCs细胞影响考察情况示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按章制造厂商所建议的条件。
本发明涉及一种与MDSCs特异性结合的配体多肽,同时考察了该多肽修饰的脂质体与MDSCs的结合能力进行体外鉴定,确证该多肽与MDSCs特异性结合的能力。
实施例1、体内噬菌体筛选技术筛选MDSCs靶向配体候选多肽
运用体内噬菌体筛选技术进行三轮筛选得到MDSCs靶向性多肽DPPWLSW(简称F7,如SEQ ID NO.1所示),具体方法如下:
(一)体内噬菌体技术筛选
第一轮筛选:
1、取荷瘤小鼠1只,尾静脉注射100μl Ph.D.-7TM噬菌体7肽库(4*1011pfu)。1h后,4%μl水合氯醛200μl麻醉,40mlPBS心肌灌注,然后取肿瘤组织。
2、裂解MDSCs细胞:将分选得到的MDSCs细胞加入1%NP-40细胞裂解液100μl,混匀,冰上裂解5min。
3、ER2738单菌落接种至LB-Tet(LB-四环素)培养基中过夜培养,取培养物1∶100分别稀释至1个25ml、1个10mlLB培养基的锥形瓶中。37℃,260rpm摇床上2-4h使OD600=0.4。
4、拯救噬菌体:将裂解物全部转移至1mlER2738培养物中,混匀,室温30min孵育。
上述混合物全部转移至25ml菌液锥形瓶中,37℃,260rpm摇床上5-6h。
5、将培养物全部转入一离心管中(50ml),4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中(50ml),再离心。
6、将上清的上部80%分别转入一新鲜管中,加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜。
7、4℃10,000rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液,再短暂离心,吸去残留上清液。
8、沉淀物重悬于1ml TBS中,悬液转入微量离心管中,4℃离心5min使残余细胞沉淀。
9、上清转入另一新鲜微量离心管,用1/6体积(约340μl)的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4℃离心10min,弃上清,再短暂离心,用微量移液器吸去残余上清。
10、沉淀物重悬于200μlTBS中。离心1min,沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
11、根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。
第二轮筛选
12、根据第一轮筛选所得滴度计算应取尾静脉注射的体积,取125μl扩增后的洗脱物尾静脉注射入荷瘤小鼠,1h后,4%μl水合氯醛200μl麻醉,40mlPBS心肌灌注,然后取肿瘤)。
13、重复步骤2-12。
第三轮筛选
重复上述步骤12-13,进行第三轮筛选。
(二)单克隆噬菌体收获,扩增,提取DNA测序
1.第三轮筛选过后,测定洗脱产物噬菌体滴度。
2.利用无菌枪头挑取平板中的蓝色噬菌斑,接种至1ml对数生长中期的E2738菌液中(15ml离心管),37℃剧烈摇动培养4.5小时。
3.4℃下10,000rpm离心5分钟,取上清至1.5ml离心管,再次4℃下10,000rpm离心5分钟,小心取500μl上清至新的1.5ml离心管。
4.加入200μl PEG/NaCl溶液,混和均匀,室温静置10分钟。
5.室温10,000rpm离心10分钟,彻底弃去上清。
6.加入100μl碘化物缓冲液重悬沉淀,加入250μl无水乙醇,室温孵育10分
钟,10,000rpm离心10分钟,弃去上清,70%乙醇洗涤沉淀,弃去,干燥,将沉淀重悬于30μl灭菌去离子水中。
7.生工,利用-96gIII测序引物(5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’),SEQ ID NO.2,进行测序。
此多肽以及为了后续实验方便化学连接而设计的含有棕榈酸末端的DPPWLSW-pal(简称pF7)、DPPWLSWDPPWLSW-FITC以及荧光FITC-F7多肽均由成都凯捷生物医药发展有限公司合成,均经过HPLC纯化和质谱鉴定,纯度大于95%,分子量与理论值相符。
效果验证:
(1)图1为噬菌体筛选滴度测试结果,蓝斑为特异性结合的噬菌体克隆。
(2)表1为噬菌体筛选得到的多肽序列(取9个克隆进行测序)
表1
名称 | 序列 | 频率 |
序列1 | DPPWLSW | 8 |
序列2 | QPPKFLY | 1 |
(3)图2为FITC-F7(荧光素标记的F7)荧光多肽质谱分析图,进质谱分析可知所得DPPWLSW-FITC的分子量与理论值相近,为分子量1401.57g/mol。
实施例2、具有MDSCs靶向性的合成材料
本实施例涉及一种具有MDSCs靶向性的合成材料,该合成材料由MDSC分子特异性靶向多肽的衍生多肽与Mal-PEG2000-DSPE连接而得。所述MDSCs分子特异性靶向多肽的序列合成时在C端加上GGGC,进而得到衍生多肽,其序列为DPPWLSWGGGC(如SEQ ID NO.3所示);该衍生多肽的半胱氨酸上游离的巯基就与马来酰亚胺基团反应而连接在DSPE-2000-Maleimide(二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000马来酰亚胺,其中的聚乙二醇也可选择PEG5000)上,得到具有MDSCs靶向性的合成材料;进一步地,所述MDSCs特异性靶向多肽也可直接与DSPE-2000-Maleimide连接;得到另一种具有MDSCs靶向性的合成材料。
所述具有MDSCs靶向性的合成材料(其中多肽为MDSCs特异性靶向多肽)的制备包括如下步骤:
1)、称量DSPE-PEG2000-Maleimide脂质,加入氯仿至10mg/ml,于茄形瓶中溶解,氮气吹干,形成脂质薄膜;
2)、将1.5倍(摩尔比例)于脂质的多肽粉末在氮气保护下溶解于HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲盐溶液)中,加入有脂质薄膜的茄形瓶中;
3)、恒温反应器中,氮气保护下10摄氏度反应过夜;
4)、反应体系转移到WMCO1000的透析袋中,使用去离子水透析过夜三次,得到具有MDSCs靶向性的合成材料,即多肽-PEG-DSPE。
实施例3、MDSCs靶向性多肽的衍生多肽
1、MDSCs、Jurkat与多肽DPPWLSW-FITC的结合实验(悬浮细胞)
1)MDSCs、Jurkat细胞计数,1640培养液(10%胎牛血清)调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,每孔加入不同浓度的多肽DPPWLSW-FITC溶液20μl,浓度分别取1mM,500μM,50μM,5μM,0.5μM。混匀后,37℃、5%CO2条件下避光孵育1h。
3)孵育结束后,弃去含有荧光多肽的细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次,彻底清洗去游离或非特异性结合的荧光多肽。
4)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
2、4T1、H1299与多肽DPPWLSW-FITC的结合实验(贴壁细胞)
1)4T1、H1299细胞计数,分别种24孔板(2×105/孔),每孔1640+10%FBS200μl,至孔板长满。
2)避光条件下,每孔加入不同浓度的多肽DPPWLSW-FITC溶液20μl,浓度分别取1mM,500μM,50μM,5μM,0.5μM。混匀后,37℃、5%CO2条件下避光孵育1h。
3)弃去含荧光多肽的细胞培养液,加入不含血清的1640培养液200μl洗涤,弃去上清。加入0.25%胰酶消化,加入含血清的1640培养液停止消化。离心去上清,每孔PBS+2%FBS400μl,300g,10min,离心洗涤3次。
4)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
效果验证:
图3为FITC-F7荧光多肽与不同细胞结合的荧光强度示意图,由图3可知,不同浓度荧光多肽与MDSCs有较强结合,且结合随荧光多肽浓度升高而上升,在一定范围内程浓度依赖性。而对照细胞Jurkat,4T1,H1299细胞,结合强度较差,且无明显浓度依赖性。
实施例4、MDSCs靶向性多肽的衍生复和多肽
1、MDSCs、Monocyte与多肽DPPWLSWDPPWLSW-FITC的结合实验
1)MDSCs、Monocyte细胞计数,1640培养液(10%胎牛血清)调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,每孔加入不同浓度的多肽DPPWLSWDPPWLSW-FITC溶液20μl,浓度分别取1mM,500μM,50μM,5μM,0.5μM。混匀后,37℃、5%CO2条件下避光孵育1h。
3)孵育结束后,弃去含有荧光多肽的细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次,彻底清洗去游离或非特异性结合的荧光多肽。
4)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
效果验证:
不同浓度荧光复合多肽与MDSCs有较强结合,且结合随荧光多肽浓度升高而上升,在一定范围内程浓度依赖性。而对照细胞Monocyte细胞,结合强度较差,且无明显浓度依赖性。
实施例5、MDSC靶向多肽修饰荧光脂质体
本实施例涉及两种荧光脂质体,该荧光脂质体均为MDSCs靶向多肽修饰荧光脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1、不同比例多肽脂质的荧光脂质体(HSPC)脂质体的制备
1).取出HSPC(氢化大豆磷脂):CHOL(胆固醇),DSPE-PEG2000(二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000),FITC-DHPE(荧光素标记的1,2-棕榈酰磷脂酰乙醇胺),棕榈酸修饰的多肽储备液,室温下平衡半小时。
2).分别按相应摩尔比制备PEG含量0、2%、4%的多肽含量为7%的荧光素脂质体及不含多肽的对照脂质体。如:按照HSPC∶CHOL∶DSPE-PEG2000∶FITC-DHPE=55∶45∶2∶1.2(摩尔比,PEG2%)混合于茄型瓶中,加入适量氯仿,充分溶解混匀。另取pal-多肽溶于甲醇中,pal-多肽与膜材料的摩尔比为7%,氯仿和甲醇的体积比为1∶1。
3).65℃水浴下,真空旋转蒸发,使氯仿挥干,形成脂质薄膜。旋转蒸发过程中对茄型瓶避光。
4).加入PBS至2mg/ml总脂质浓度,震荡至脂质膜充分水合。
5).超声至脂质体溶液透明,利用挤出仪及100nm聚碳酸酯膜,减小粒径。
6).4℃避光保存备用。
7).激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子激光(λ0=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
2、不同比例多肽脂质的荧光脂质体(EPC)脂质体的制备
1).取出EPC(卵磷脂)∶CHOL(胆固醇),DSPE-PEG2000(二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000),FITC-DHPE(荧光素标记的1,2-棕榈酰磷脂酰乙醇胺),棕榈酸修饰的多肽储备液,室温下平衡半小时。
2).分别按相应摩尔比制备PEG含量0、2%、4%的多肽含量为7%的荧光素脂质体及不含多肽的对照脂质体。如:按照EPC∶CHOL∶DSPE-PEG2000∶FITC-DHPE=59∶39∶4∶1.2(摩尔比,PEG2%)混合于茄型瓶中,加入适量氯仿,充分溶解混匀。另取pal-多肽溶于甲醇中,pal-多肽与膜材料的摩尔比为7%,氯仿和甲醇的体积比为1∶1。
3).常温下,真空旋转蒸发,使氯仿挥干,形成脂质薄膜。旋转蒸发过程中对茄型瓶避光。
4).加入PBS至2mg/ml总脂质浓度,震荡至脂质膜充分水合。
5).超声至脂质体溶液透明,利用挤出仪及100nm聚碳酸酯膜,减小粒径。
6).4℃避光保存备用。
7).激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子激光(λ0=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
效果验证:
荧光脂质体的结构如图4所示,不同比例多肽脂质的荧光脂质体(HSPC)脂质体的表征如下表2所示:
表2
F7+PEG | 粒径Diameter(nm) | 多分散系数(PDI) |
0+0 | 187.83±4.33 | 0.15±0.06 |
0+4 | 176.63±7.44 | 0.11±0.02 |
4+0 | 172.77±5.06 | 0.02±0.03 |
7+0 | 165.23±0.98 | 0.09±0.06 |
7+2 | 176.93±4.55 | 0.15±0.07 |
7+4 | 146.90±0.99 | 0.06±0.02 |
不同比例多肽脂质的荧光脂质体(EPC)脂质体的表征如下表3所示:
表3
F7+PEG | 粒径Diameter(nm) | 多分散系数(PDI) |
0+0 | 139.17±4.35 | 0.05±0.07 |
0+4 | 133.30±1.61 | 0.03±0.03 |
4+0 | 135.00±0.50 | 0.09±0.06 |
7+0 | 122.23±7.35 | 0.09±0.06 |
7+2 | 113.83±1.61 | 0.09±0.02 |
7+4 | 120.77±2.85 | 0.13±0.02 |
3、不同比例多肽脂质的荧光脂质体(EPC/HSPC)脂质体与细胞结合能力考察
1)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,各种待测细胞中加入荧光素标记的不同脂质体20μl,总脂质浓度为0.2mg/ml,37℃下避光静置孵育4小时。
3)孵育结束后,弃去含有荧光脂质体的细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗去游离或非特异性结合的荧光素荧光脂质体。
4)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
图5为不同比例多肽脂质的荧光脂质体(HSPC)与MDSCs、Monocyte结合荧光强度示意图,由图5可知7%F7修饰的脂质体对MDSCs表现出高结合强度,F7+PEG(7+0)组荧光强度平均值明显高于对照细胞,且随PEG含量的增加,MDSCs结合降低。可能是PEG对多肽有一定的遮蔽作用。
图6为不同比例多肽脂质的荧光脂质体(EPC)与MDSCs、Monocyte结合荧光强度示意图;由图6可知7%F7修饰的脂质体对MDSCs表现出高结合强度,F7+PEG(7+2)组荧光强度平均值明显高于对照细胞。
实施例6、MDSCs靶向多肽修饰胶束
本实施例涉及一种荧光胶束,该荧光胶束为MDSCs靶向多肽修饰荧光胶束,其制备方法包括如下步骤:
1).取出EPC、CHOL、DSPE-PEG2000、FITC-DHPE、DSPE-2000-Maleimide、棕榈酸修饰的多肽储备液,室温下平衡半小时。
2)按处方比例量取储备液适量加入25ml茄形瓶中,随后加入2ml氯仿混合均匀,真空泵抽真空使压力达0.1Mpa,水浴温度为30℃,转速为120r·min-1,旋转蒸发60~120min除去有机试剂,在瓶壁形成均匀透明的脂膜,之后放置25℃真空干燥箱过夜除尽氯仿,
3)按照脂质浓度为2mg/ml,在茄型瓶中加入适量5%葡萄糖溶液,40℃水浴水合2hr后得胶束溶液
4).利用挤出仪及100nm聚碳酸酯膜,减小粒径。
5).4℃避光保存备用。
6).激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子激光(λ0=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
效果验证:
不同比例多肽脂质的荧光脂质胶束与细胞结合能力考察
1)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640调整细胞浓度至2×106个/mi。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,各种待测细胞中加入荧光素标记的不同胶束20μl,总脂质浓度为0.2mg/ml,37℃下避光静置孵育4小时。
3)孵育结束后,弃去含有荧光胶束的细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗去游离或非特异性结合的荧光素荧光胶束。
4)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
由图7可知,含MDSCs靶向多肽的胶束与MDSCs结合较强,而与对照细胞结合很弱,此多肽胶束具有靶向MDSCs的作用。
实施例7、MDSCs靶向多肽修饰金纳米粒子
本实施例涉及一种金纳米粒子,该金纳米粒子为MDSCs靶向多肽修饰的金纳米粒子,
其制备方法包括如下步骤:
1)金纳米粒子(GNP)的制备采用Frens-Turkevich方法,利用柠檬酸钠还原氯金酸制备粒径为13nm的金纳米粒子。合成表面荧光素标记的多肽修饰的金纳米粒子(FITC-F7-GNP)。
2)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640调整细胞浓度至1×106个/mi。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
3)避光条件下,各种待测细胞中加入荧光素标记的功能化金纳米粒子10μl,金纳米粒子浓度为0.5nmol/L,37℃下避光静置孵育特定时间。
4)孵育结束后,弃去含有金纳米粒子的细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次。
5)利用流式细胞分析仪,在488nm的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
由图8可知,含MDSCs靶向多肽的金纳米粒子与MDSCs结合较强,而与对照细胞结合很弱,此多肽修饰的金纳米粒子具有靶向MDSCs的作用。
实施例8、MDSCs靶向多肽修饰全反式维甲酸脂质体
本实施例涉及一种全反式维甲酸脂质体,该全反式维甲酸脂质体为MDSCs靶向多肽修饰全反式维甲酸脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1).取出EPC,CHOL,pal-多肽储备液,ATRA(全反式维甲酸)储备液(15mg/ml),室温下平衡半小时。
2).分别按相应摩尔比制备含7%多肽的ATRA载药脂质体、含7%多肽对照脂质体、不含多肽的肽ATRA载药脂质体、不含多肽对照脂质体。如:按照EPC∶CHOL=59∶39(摩尔比)混合于茄型瓶中,加入ATRA,所述全反式维甲酸与所述脂材的质量比为20∶1,加入适量氯仿,充分溶解混匀。另取pal-多肽溶于甲醇中,pal-多肽与膜材料的摩尔比为7%,氯仿和甲醇的体积比为1∶1。
3).常温下,真空旋转蒸发,使氯仿挥干,形成脂质薄膜。旋转蒸发过程中对茄型瓶避光。
4).加入PBS至2mg/ml总脂质浓度,震荡至脂质膜充分水合。
5).短暂超声至脂质体溶液透明,利用挤出仪及100nm聚碳酸酯膜,减小粒径。
6).4℃避光保存备用。
7).激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
效果验证:
(1)全反式维甲酸脂质体的表征如下表4所示:
表4
pF7+PEG | 粒径Diameter(nm) | 多分散系数(PDI) |
0+0 | 113.53±2.38 | 0.10±0.03 |
0+0+ATRA | 131.57±1.80 | 0.04±0.03 |
7+0 | 116.17±2.48 | 0.06±0.07 |
7+0+ATRA | 151.87±3.59 | 0.07±0.05 |
由表4可知:制备的全反式维甲酸脂质体经过100nm聚碳酸脂膜挤出,普通全反式维甲酸脂质体的粒径约为130nm,多分散系数很小。多肽F7修饰的全反式维甲酸脂质体的粒径比非普通全反式维甲酸脂质体略大,约为150nm。这是因为多肽F7修饰的全反式维甲酸脂质体的表面有多肽修饰,多肽片段使得脂质体的水化层比不含多肽的脂质体要大,所以使用激光散射法测到的平均粒径要大一点。说明多肽F7修饰的全反式维甲酸脂质体制备成功,其外表面确实修饰有F7多肽片段。
(2)全反式维甲酸脂质体对MDSCs影响考察
1)分离MDSCs、Monocyte细胞。流式细胞仪测定MDSCs初始含量比例。细胞计数,1640调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,各种待测细胞中加入不同脂质体20μl,总脂质浓度为0.2mg/ml,37℃下避光静置孵育12h。
3)孵育结束后,弃去细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗去游离或非特异性结合的脂质体。
4)流式抗体标记MDSCs,利用流式细胞分析仪,分析细胞数量比例变化。
由图9可知:载药脂质体比对照脂质体,MDSCs含量降低,说明ATRA起到一定的效果,促进MDSCs分化。7%多肽的ATRA载药脂质体MDSCs百分含量最低,而无多肽的ATRA载药脂质体的MDSCs比例降低较少,说明多肽ATRA脂质体由于存在F7靶向肽,使得针对MDSCs细胞的结合变强了,使载药脂质体可以更有针对性的发挥效果。
实施例9、MDSCs靶向多肽修饰阿霉素脂质体
本实施例涉及一种阿霉素脂质体,该脂质体为MDSCs靶向多肽修饰阿霉素脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1)取出EPC,CHOL,pF7室温下平衡半小时。
2)按照EPC∶胆固醇=2∶1(摩尔比)比例混合于茄型瓶中,加入适量氯仿,充分溶解混匀。
3)室温下用旋转蒸发仪旋转蒸发,使氯仿挥干,形成脂质薄膜。
4)加入(NH4)2SO4-HEPES缓冲液(硫酸铵(NH4)2SO4125mM,HEPES20mM,pH4.0)至10mg/ml总脂质浓度,振荡并超声大约3-5min使脂膜分散。
5)水浴超声至脂质体溶液透明,利用挤出仪及100nm孔径聚碳酸酯膜,减小粒径。
6)空白脂质体用3500分子量的透析袋按照1∶150(脂质体∶透析液)体积比在HEPES(20mM,PH7.5)缓冲液中透析2hr,4℃保存。
7)彻底去除脂质体外水相中的硫酸铵及游离多肽成分,制成空白脂质体。
8)将盐酸阿霉素溶解于HBS(氯化钠NaCl150mM,HEPES20mM,pH7.5)中至5mg/ml。
9)将空白脂质体转移至离心管中,按照脂质∶阿霉素=10∶1(w/w)的比例震荡混合均匀,在恒温震荡器中60℃震荡孵育1小时,得到阿霉素脂质体。
10)利用激光粒度仪测量脂质体的粒径及分布,置于4℃备用。
效果验证:
(1)MDSCs靶向多肽修饰阿霉素脂质体的表征如下表5所示:
表5
pF7+PEG | 粒径Diameter(nm) | 多分散系数(PDI) |
0+0 | 142.37±2.57 | 0.18±0.01 |
0+0+阿霉素 | 130.00±3.83 | 0.08±0.05 |
7+0 | 106.53±2.67 | 0.07±0.01 |
7+0+阿霉素 | 160.07±2.31 | 0.18±0.02 |
(2)MDSCs靶向多肽载药脂质体的CCK-8细胞毒性研究
采用CCK-8法检测细胞存活率来表示阿霉素的细胞毒性作用。按照以下步骤进行检测,每个实验至少重复3次。
1)将MDSC细胞悬液以2×105个/孔的密度接种于96孔培养板,培养基量为100μl/孔,37℃、5%CO2培养箱中培养。
2)向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。每次实验设置游离阿霉素药物组,对照脂质体阿霉素药物组(0+0)、多肽脂质体阿霉素药物组(7+0)、对照组(种有细胞,加不含药物的培养基)和空白组(无细胞只加培养基)。
通过计算,每个药物组分别加入阿霉素浓度为50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的相应药物溶液(无血清培养基稀释),共7个浓度梯度,每个样品浓度重复3孔,各孔迅速加入药物混匀,继续培养2hr~4hr。
3)离心去上清,PBS洗涤细胞1次后,加入含10%胎牛血清新鲜培养基,继续培养24hr。
4)向每孔加入10μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O.D值的读数),培养箱内孵育1~4小时(具体培养时间要观察,隔一段时间取出细胞看看颜色)。
5)酶标仪检测各孔光吸收值(OD)值,检测波长为450nm,记录结果。用细胞存活率对药物剂量对数作图绘制药物浓度-细胞存活率曲线。
由图10可以看出,F7修饰的脂质体阿霉素的细胞毒性作用均优于非靶向的对照阿霉素脂质体,而更接近于游离阿霉素。游离阿霉素是极容易透过细胞膜进入细胞的小分子药物,但在体内缺乏靶向性分布在全身各个器官,对正常细胞、组织有很大的毒副作用,这能够通过用脂质体包裹阿霉素引起被动靶向作用而减小毒副作用。但在体外的细胞毒性研究中,正如细胞毒性结果,表明脂质体阿霉素的细胞毒性较之有游离阿霉素减小,这可能是由于游离阿霉素比阿霉素脂质体更容易穿透细胞膜进入细胞内。因此,多肽F7的修饰能增强脂质体阿霉素在体外的细胞毒性,表明配体F7能有效导向载药脂质体特异靶向MDSCs并促进细胞对其的内吞,不仅提高了脂质体的对细胞的选择性给药作用而且还增强了脂质体阿霉素的细胞毒作用。
实施例10、MDSCs靶向多肽修饰Cy-5-siRNA脂质体
本实施例涉及两种siRNA阳离子脂质体,siRNA阳离子脂质体为MDSCs靶向多肽修饰siRNA阳离子脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1)取出L1阳离子脂质,MC3阳离子脂质,胆固醇(CHOL),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),pal-多肽储备液,室温下平衡半小时。
2)分别按相应摩尔比制备多肽含量为7%的脂质体及不含多肽的对照脂质体。如:按照L1∶DPPC∶CHOL∶pal-多肽∶=50∶40∶10∶7(摩尔比,pal-多肽7%)混合于茄型瓶中,充分溶解混匀。
3)取HEPES缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲盐溶,液20mM pH4.0)于5ml离心管中,30℃预热,5-10min。将涡旋仪调至touch II档,在涡旋搅拌下,将加入脂质乙醇混合液缓慢加入20Mm pH4.0HEPES缓冲液中,涡旋搅拌1-2min。制备含30%乙醇的脂质体混悬液。
4)使用挤出仪,对脂质体分别过0.2μm、0.1μm、0.08μm聚碳酸酯膜11次,制备粒径小而分布均匀的空白脂质体。4℃避光保存备用。
5)激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
6)使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子(λ=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
7)按siRNA/脂质总量=1/10,取适量cy5-luciferase-siRNA溶液。将制备好的空白脂质体放置在涡旋仪上,缓慢加入siRNA溶液,37℃孵育2h。
8)将制备好的复合物置于HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于中,4℃下透析4h。然后取出,继续在pH7.0PBS溶液中,4℃下透析12h。透析结束收集于离心管中,即为脂质基因复合物,4℃保存备用。
9)激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
10)使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子激光(λ=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
效果验证:
MDSCs靶向多肽修饰siRNA脂质体的表征如下表6所示:
表6
(2)不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力考察
1)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640培养液调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)避光条件下,各种待测细胞中加入不同脂质体50μl(siRNA每孔0.5ug,终浓度2ug/ml),37℃下避光静置孵育4.5小时。
3)孵育结束后,弃去细胞培养液,加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗。
4)利用流式细胞分析仪,在FL-4的激发光通道下计数10,000个细胞,分析细胞荧光强度分布及平均值。
由图11可知:在与MDSCs结合实验中多肽修饰的MC3脂质体的Cy5-siRNA荧光强度高于无多肽修饰的MC3对照脂质体。并且在对照细胞Monocyte中两者无明显差异。说明F7脂质体可以包载siRNA,并与MDSCs细胞产生特异性结合或者内吞作用。
实施例11、MDSCs靶向多肽修饰STAT(STAT基因)-siRNA脂质体
本实施例涉及一种siRNA阳离子脂质体,siRNA阳离子脂质体为MDSCs靶向多肽修饰siRNA阳离子脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1)取出MC3阳离子脂质,胆固醇(CHOL),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),pal-多肽储备液,室温下平衡半小时。
2)分别按相应摩尔比制备多肽含量为7%的脂质体及不含多肽的对照脂质体。如:按照MC3∶DPPC∶CHOL∶pal-多肽∶=50∶40∶10∶7(摩尔比,pal-多肽7%)混合于茄型瓶中,充分溶解混匀。
3)取HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于5ml离心管中,30℃预热,5-10min。将涡旋仪调至touch II档,在涡旋搅拌下,将加入脂质乙醇混合液缓慢加入20Mm pH4.0HEPES缓冲液中,涡旋搅拌1-2min。制备含30%乙醇的脂质体混悬液。
4)使用挤出仪,对脂质体分别过0.2μm、0.1μm、0.08μm聚碳酸酯膜11次,制备粒径小而分布均匀的空白脂质体。4℃避光保存备用。
5)激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
6)使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子(λ=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
7)按siRNA/脂质总量=1/10,取适量STAT-siRNA溶液。将制备好的空白脂质体放置在涡旋仪上,缓慢加入siRNA溶液,37℃孵育2h。
8)将制备好的复合物置于HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于中,4℃下透析4h。然后取出,继续在pH7.0PBS溶液中,4℃下透析12h。透析结束收集于离心管中,即为脂质基因复合物,4℃保存备用。
效果验证:
1)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640无血清培养液调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)按组别分别加入不同脂质体(siRNA每孔0.5ug,终浓度2ug/ml),摇动培养板,轻轻混匀。37℃下培养48-72h。
3)RT-PCR检测各siRNA沉默STAT的效果。取STAT-siRNA脂质体干扰72h后细胞,按说明书提取总RNA。逆转录条件为:37℃反应15min,85℃反应5s。扩增反应条件为:94℃预变性min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,扩增30个循环;最后72℃延伸5min。PCR扩增产物取5μL,20g/L琼脂糖凝胶电泳,重复6次,以β-actin基因表达产物为内参照,对比各STAT-siRNA脂质体基因沉默效率。
实验结果表明,含MDSCs靶向多肽的STAT-siRNA脂质体基因沉默效率最高约为80.34%,而无多肽的脂质体其基因沉默效率约为1.25%。说明此多肽可靶向MDSCs,使STAT-siRNA更好的进入细胞,发挥基因沉默作用。
实施例12、MDSCs靶向多肽修饰CCL5(T细胞表达和分泌因子)-siRNA脂质体
本实施例涉及一种siRNA阳离子脂质体,siRNA阳离子脂质体为MDSCs靶向多肽修饰siRNA阳离子脂质体,其制备方法包括如下步骤:
1)取出MC3阳离子脂质,胆固醇(CHOL),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),pal-多肽储备液,室温下平衡半小时。
2)分别按相应摩尔比制备多肽含量为7%的脂质体及不含多肽的对照脂质体。如:按照MC3∶DPPC∶CHOL∶pal-多肽∶=50∶40∶10∶7(摩尔比,pal-多肽7%)混合于茄型瓶中,充分溶解混匀。
3)取HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于5ml离心管中,30℃预热,5-10min。将涡旋仪调至touch II档,在涡旋搅拌下,将加入脂质乙醇混合液缓慢加入20Mm pH4.0HEPES缓冲液中,涡旋搅拌1-2min。制备含30%乙醇的脂质体混悬液。
4)使用挤出仪,对脂质体分别过0.2μm、0.1μm、0.08μm聚碳酸酯膜11次,制备粒径小而分布均匀的空白脂质体。4℃避光保存备用。
5)激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布。
6)使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪,使用He-Ne离子(λ=633nm)为入射光,动力学光散射试验在25℃进行,反射角为1.33,角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
7)按siRNA/脂质总量=1/10,取适量CCL5-siRNA溶液。将制备好的空白脂质体放置在涡旋仪上,缓慢加入siRNA溶液,37℃孵育2h。
8)将制备好的复合物置于HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于中,4℃下透析4h。然后取出,继续在pH7.0PBS溶液中,4℃下透析12h。透析结束收集于离心管中,即为脂质基因复合物,4℃保存备用。
效果验证:
1)分离MDSCs、Monocyte细胞,计数,1640无血清培养液调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板,每孔200μl细胞悬液。
2)按组别分别加入不同脂质体(CCL5-siRNA每孔0.5ug,终浓度2ug/ml),摇动培养板,轻轻混匀。37℃下培养48-72h。离心收集上清,使用CCL5特异性ELISA试剂盒检测CCL5表达。
实验结果表明,含MDSCs靶向多肽的CCL5-siRNA脂质体的细胞上清中CCL5表达最少,含MDSCs靶向多肽的CCL5-siRNA的脂质体基因沉默效率最高,说明此多肽可靶向MDSCs,使CCL5-siRNA更好的进入细胞,发挥基因沉默作用。
实施例13、MDSC靶向全反维甲酸脂质体动物体内实验
制备3个处方脂质体进行动物体内实验,证明此靶向脂质体减少荷瘤小鼠肿瘤部位的MDSCs数量和比例。制备浓度15mg/ml的3种脂质体,这3个处方含pF7的比例分别是0%pF7,4%pF7,7%pF7。将Balb/c小鼠随机分成6组,每组3只。每只小鼠接种1x106 4T1乳腺癌肿瘤细胞。待肿瘤长到100mm3开始按每组处方给药,每两天给药一次,每只小鼠200μl。4次给药后,将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死,小心取出肿瘤,在冰上切碎肿瘤组织。转移至含1ml胶原酶(collagense IV)消化液的15ml离心管中,轻轻的涡旋混匀(37摄氏度,200转/分钟),消化2小时后,过40μm膜至50ml离心管。离心弃上清,加入红细胞裂解液5ml,37摄氏度裂解5分钟,PBS洗两次,即制的各个小鼠的肿瘤单个细胞悬液。磁珠分离MDSCs细胞,并进行抗体标记,流式细胞仪检测MDSCs数量变化。
图12表明含在荷瘤小鼠体内,7%pF7多肽的组在减少MDSCs数量上与PBS组相比较有显著性差异,说明pF7多肽可以很好的靶向MDSCs,并且将全反式维甲酸被输送到肿瘤部位MDSCs细胞内发挥作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种与MDSCs特异性结合的配体多肽,其特征在于,包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的与MDSCs特异性结合的配体多肽,其特征在于,所述配体多肽包括SEQ ID NO.1所示序列,以及在其C末端和/或N末端添加连接基团或连接用氨基酸序列。
3.一种如权利要求1所述的与MDSCs特异性结合的配体多肽形成的游离型多肽、融合型多肽、嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物。
4.一种如权利要求1所述的与MDSCs特异性结合的配体多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述与MDSCs特异性结合的配体多肽用于靶向小分子药物、药物载体、高分子、蛋白、寡核苷酸或基因作用于MDSC,杀伤MDSCs,减少肿瘤部位MDSCs聚集,减少MDSCs的肿瘤免疫抑制作用。
6.一种靶向药物输送系统,其特征在于,该系统包括:如权利要求1所述的与MDSCs特异性结合的配体多肽、载药结构和至少一种活性物质或显像物质。
7.根据权利要求6所述的药物输送系统,其特征在于,所述配体多肽被连接于药物输送系统的表面,并与MDSC细胞结合。
8.根据权利要求6所述的药物输送系统,其特征在于,所述载药结构为无机纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体纳米粒、胶束、碳纳米管、细胞器或脂蛋白。
9.根据权利要求6所述的药物输送系统,其特征在于,所述活性物质为抗肿瘤药物,抗代谢药物,细胞毒性药物,光敏剂,激酶抑制剂,抗生素,抗菌素,抗炎药物,免疫抑制剂,抗感染药物,抗病毒药物,目的基因、自杀基因、细胞因子基因、或上述基因的组合,或含有上述基因的真核表达载体DNA;所述显像物质为用于超声造影、放射造影、核医学造影的试剂。
10.根据权利要求6所述的药物输送系统,其特征在于,所述药物输送系统还包载寡核苷酸分子。
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