CN107894412A - 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法 - Google Patents

一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107894412A
CN107894412A CN201711050157.5A CN201711050157A CN107894412A CN 107894412 A CN107894412 A CN 107894412A CN 201711050157 A CN201711050157 A CN 201711050157A CN 107894412 A CN107894412 A CN 107894412A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
medicament carrier
surface modification
biomolecule
carrier surface
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711050157.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107894412B (zh
Inventor
陈勇
余川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN201711050157.5A priority Critical patent/CN107894412B/zh
Publication of CN107894412A publication Critical patent/CN107894412A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107894412B publication Critical patent/CN107894412B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，该方法使用脂类荧光染料对表面修饰待鉴定的纳米药物载体进行荧光着色，然后添加包被有生物分子的微米级颗粒，最后使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测；该方法简单易操作、反应快速、结果简明有效，可直接证明生物分子是否于纳米药物载体表面修饰成功，填补了这一个在纳米药物技术领域上的空白。

Description

一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法
技术领域
本发明属于生物医学的领域，尤其涉及一种可直接鉴定纳米药物载体的表面修饰情况的方法。
背景技术
随着纳米技术的飞速发展，纳米药物或纳米药物载体在生物学和医学等方面的应用获得了广泛的关注和重视，为了达到提高纳米药物或纳米药物载体的水溶性、生物相容性、血液循环系统存留时间、靶向性及治疗效果和降低其毒副作用等目的，通常会使用抗体、受体、配体、脂类分子、糖类分子或是核酸分子等特异性的生物分子对纳米药物或纳米药物载体进行修饰。
血清脂蛋白是人体或动物体血液中天然存在的运送脂类等物质的载体，其包括乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)等。由于血清脂蛋白优良的生物相容性以及内部疏水、外部亲水等特性，重组血清脂蛋白被用作药物载体的研究近年来得到广泛关注和重视，其已成为了纳米药物载体研究的热点之一，重组血清脂蛋白中最主要的是人重组低密度脂蛋白(rLDL)和人重组高密度脂蛋白(rHDL)药物载体。这些重组血清脂蛋白药物载体通常使用磷脂酰胆碱、胆固醇、酯化的胆固醇和脂酰甘油等脂类分子来构建，并在外表面修饰上特异性的载脂蛋白分子或其他分子以提高其在血液内的存留时间、靶向性和药效等。
天然存在的血清脂蛋白通常只有十几或几十纳米，而重组血清脂蛋白药物载体的尺寸一般也小于200nm。由于其纳米级的尺寸，重组血清脂蛋白药物载体很难被光学显微镜检测，其本身可以使用透射电子显微镜或动态光散射仪等设备或方法进行形貌和尺寸等的鉴定，但对于修饰到其表面的特异性生物分子，通常没有简单有效的直接检测的方法，只能通过其是否能被细胞识别或其与修饰前相比是否具有改善的性质和药效来进行间接的证明，以往的相关文献中也没有提供直接证据及结论可证明特异性生物分子是否已成功修饰于纳米药物载体表面上。
发明内容
本发明为解决上述的技术问题，提供一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，这种可以直接鉴定纳米药物载体的表面修饰过程是否成功，并且操作简单，易实现，整个流程耗时短，结果清晰。
本发明的技术方案：
(1)将包被有第一生物分子的微米级颗粒与藕联第二生物分子的纳米药物载体表面修饰分子的抗体或配体的复合物共孵育，使抗体或配体的复合物结合到微米级颗粒表面；
(2)将孵育后的复合物-微米级颗粒体系低速离心，去除未结合的所述抗体或配体的复合物；
(3)将结合有所述抗体或配体的复合物的微米级颗粒与所述纳米药物载体共孵育，通过抗原-抗体或配体-受体的相互作用，使纳米药物载体结合到微米级颗粒表面，制得悬液；
(4)将所述悬液与脂类荧光染料溶液共孵育，使悬液内结合物与脂类荧光染料分子充分结合；
(5)将悬液与脂类荧光染料孵育后的混合液低速离心并清洗，去除多余的脂类荧光染料和未结合的纳米药物载体；
(6)使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。
若微米级颗粒有荧光，表明纳米药物载体表面修饰有需要鉴定的分子；反之，若微米级颗粒没有荧光，表明纳米药物载体表面没有修饰需要鉴定的分子。
实验过程中，还设置了2个对照组，分别是未修饰待鉴定分子的纳米药物载体和单一的包被有第一生物分子的微米级颗粒。
若需要鉴定纳米药物载体表面修饰的两种或更多种的修饰分子，其鉴定方法和步骤相同，可以先后鉴定不同的分子或设置多个样品组同时鉴定不同的分子。
步骤(1)中所述第一生物分子与所述第二生物分子之间可发生生物特异性相互作用。
步骤(1)中所述第一生物分子包括链霉亲和素；所述第二生物分子包括生物素。
步骤(4)中所述微米级颗粒包括硅珠或磁珠。
步骤(4)中所述脂类荧光染料包括尼罗红。
步骤(6)中所述仪器设备包括激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜或流式细胞仪。
以往的相关研究在重组脂蛋白纳米药物修饰上生物分子后很少去直接鉴定该生物分子是否修饰成功，本发明方法提供了一个简单易操作、反应快速、结果简明有效的方法，可直接证明生物分子是否于纳米药物载体表面修饰成功，填补了这一个在纳米药物技术领域上的空白。
附图说明
图1为本发明的原理示意图。
图2为荧光共聚焦显微镜检测和鉴定人重组高密度脂蛋白表面修饰的ApoA1和GM1分子的结果示意图：链霉亲和素包被的5μm的硅珠与生物素化的anti-ApoA1(biotin-anti-ApoA1)或生物素化的霍乱毒素B亚基(biotin-CTB)共孵育后，再分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC和磷酸缓冲液共孵育，最后用尼罗红进行荧光染色。I-III为biotin-anti-ApoA1分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC孵育后的荧光成像结果；i-iii为biotin-CTB分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC孵育后的荧光成像结果；IV或iv为磷酸缓冲液的结果，其为空白对照组(Ctrl)。
图1中1-硅珠，2-生物素化的抗体或配体(biotin-antibody/biotin-ligand)，3-包被在硅珠表面的亲和素(Streptavidin)，4-经脂质荧光染料尼罗红染色的表面修饰有某生物分子的重组脂蛋白药物载体。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步说明。
实施例1：鉴定LT-GM1-rHDL纳米药物载体的表面修饰ApoA1和GM1：
鉴定表面修饰有载脂蛋白ApoA1和神经节苷脂GM1并装载有抗动脉粥样硬化药物洛伐他汀(LT)的人重组高密度脂蛋白(LT-GM1-rHDL)的载脂蛋白ApoA1和神经节苷脂GM1表面修饰是否成功。通过Zeta电位粒度仪检测得到LT-GM1-rHDL纳米药物载体颗粒的平均尺寸约为120nm，透射电镜观察到LT-GM1-rHDL纳米药物载体颗粒为球形，颗粒尺寸与Zeta电位粒度仪测量的尺寸基本相同。
将需要鉴定的样品分成A和B两组，A和B两组又各分为4个组，其分别为LT-GM1-rHDL(实验组)、LT-rHDL(第一对照组：有ApoA1无GM1修饰的纳米药物载体)、LT-NLC(第二对照组：无ApoA1无GM1修饰的纳米药物载体)和磷酸缓冲液(空白对照组)，A和B共8组；本实施例所用的包被有链霉亲和素的硅珠的直径约为5μm。
(1)取包被有链霉亲和素的硅珠原液，用生物素-亲和素结合缓冲液稀释至浓度约为106个/mL，稀释后充分摇匀。
(2)使用1000rpm低速离心硅珠液2min，小心去除上清液后，用100μL磷酸缓冲液重悬硅珠，备用。
(3)取8个EP管，分别标记A组和B组，每组各4管，分别加入1mL LT-GM1-rHDL、LT-rHDL、LT-NLC和磷酸缓冲液。
(4)A组EP管分别加入5μL 200μg/mL生物素化的anti-ApoA1抗体(biotin-anti-ApoA1)；B组EP管分别加入5μL 5mg/mL生物素化的霍乱毒素B亚基(biotin-CTB)；两者均在恒温37℃下，120rpm摇床内孵育1h。
(5)孵育完成后，向8个EP管中加入100μL备用的硅珠液，充分摇匀在恒温37℃下，120rpm摇床内孵育1h。
(6)孵育完成后，继续向8个EP管中分别加入10μg/mL尼罗红荧光染料，在恒温37℃下，120rpm摇床内避光孵育1h，使充分染色。
(7)染色完成后，1000rpm低速离心混合液3min，小心去除上清液，用1mL磷酸缓冲液重悬，重复3次，以去除多余的尼罗红荧光染料分子和未结合的纳米药物载体颗粒。
(8)使用流式细胞仪对样品进行荧光强度定量分析或将样品转移到共聚焦培养皿中，室温下静置5min后，使用LSM710激光共聚焦显微镜进行成像对样品进行形貌和荧光成像。
根据图1所示，一个硅珠可连接若干个经荧光染料染色的纳米药物载体，硅珠可以起到放大作用，将无法使用光学显微镜或荧光显微镜观测的纳米药物载体的荧光信号进行聚集放大，以使用光学显微镜或荧光显微镜进行观测。
重组血清脂蛋白药物载体具有核-壳结构，其表面的壳是磷脂单分子层，内部的核是酯化的胆固醇、脂酰甘油等疏水性的脂类分子，其能被尼罗红等脂类荧光染料着色，而重组血清脂蛋白药物载体的尺寸一般小于200nm，其小于光学显微镜的检测限度，所以重组血清脂蛋白药物载体或是荧光染色的重组血清脂蛋白药物载体不能被光学显微镜或荧光显微镜检测到。微米尺度的硅珠或表面藕联有带荧光标记的重组血清脂蛋白药物载体的硅珠能够轻易被普通光学显微镜或荧光显微镜检测到。
重组血清脂蛋白药物载体或荧光染色的重组血清脂蛋白药物载体与包被有链霉亲和素的硅珠之间的藕联主要是通过链霉亲和素-生物素(streptavidin-biotin)、抗原-抗体(antigen-antibody)、配体-受体(ligand-receptor)等的特异性相互作用来实现；由于这些相互作用都是特异性的，如果最终检测硅珠表面有荧光，则证明重组血清脂蛋白药物载体的表面成功修饰了某生物分子，否则没有成功修饰。
根据图2的荧光成像图所示，在有生物素化的anti-ApoA1(biotin-anti-ApoA1)存在的情况下，只有LT-GM1-rHDL(实验组；图I)和LT-rHDL(第一对照组；图II)2个样品组的硅珠上检测到荧光，证明LT-GM1-rHDL和LT-rHDL表面均修饰上了ApoA1分子；在有生物素化的霍乱毒素B亚基(biotin-CTB)存在的情况下，只有LT-GM1-rHDL(实验组；图i)的硅珠上检测到荧光，证明LT-GM1-rHDL表面修饰上了GM1分子。这些数据证明：LT-GM1-rHDL修饰了ApoA1和GM1两种分子；LT-rHDL只修饰了ApoA1分子；LT-NLC既没修饰ApoA1分子也没修饰GM1分子。本实施例的实验结果清晰的说明了本发明的有效性。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，使用脂类荧光染料对表面修饰待鉴定的纳米药物载体进行荧光着色，然后添加包被有生物分子的微米级颗粒，最后使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将包被有第一生物分子的微米级颗粒与藕联第二生物分子的所述纳米药物载体表面修饰分子的抗体或配体的复合物共孵育；
(2)将孵育后的复合物-微米级颗粒体系低速离心；
(3)将复合物-微米级颗粒体系与所述纳米药物载体共孵育，制得悬液；
(4)将悬液与脂类荧光染料共孵育；
(5)低速离心并清洗悬液与脂类荧光染料孵育后的混合液；
(6)使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一生物分子与所述第二生物分子之间可发生生物特异性相互作用。
4.根据权利要求2所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一生物分子包括链霉亲和素；所述第二生物分子包括生物素。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，所述纳米药物载体包括重组脂蛋白纳米药物载体或其他脂类纳米药物载体。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，所述微米级颗粒包括硅珠或磁珠。
7.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，所述脂类荧光染料包括尼罗红。
8.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，所述仪器设备包括激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜或流式细胞仪。
CN201711050157.5A 2017-10-31 2017-10-31 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法 Active CN107894412B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711050157.5A CN107894412B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711050157.5A CN107894412B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107894412A true CN107894412A (zh) 2018-04-10
CN107894412B CN107894412B (zh) 2020-09-18

Family

ID=61803861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711050157.5A Active CN107894412B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107894412B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080182235A1 (en) * 2007-01-30 2008-07-31 Celsis International Plc Detection of Analytes in Samples Using Liposome-Amplified Luminescence and Magnetic Separation
CN102091037A (zh) * 2011-01-11 2011-06-15 南京大学 紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体的制备方法及应用
CN103626846A (zh) * 2013-11-08 2014-03-12 上海交通大学 与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统
US20160109472A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-21 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Quantitative molar concentration detection of specific apolipoprotein-containing particles present in bodily fluids by using capillary electrophoresis
CN105527418A (zh) * 2014-10-16 2016-04-27 希森美康株式会社 测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法及试剂盒
US20170014511A1 (en) * 2011-04-14 2017-01-19 Franco Vitaliano Cell energy therapeutics
CN106771147A (zh) * 2016-12-22 2017-05-31 广州华弘生物科技有限公司 一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒及其使用方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080182235A1 (en) * 2007-01-30 2008-07-31 Celsis International Plc Detection of Analytes in Samples Using Liposome-Amplified Luminescence and Magnetic Separation
CN102091037A (zh) * 2011-01-11 2011-06-15 南京大学 紫草宁及其衍生物或修饰物的脂质体的制备方法及应用
US20170014511A1 (en) * 2011-04-14 2017-01-19 Franco Vitaliano Cell energy therapeutics
CN103626846A (zh) * 2013-11-08 2014-03-12 上海交通大学 与MDSCs特异性结合的配体多肽及药物输送系统
CN105527418A (zh) * 2014-10-16 2016-04-27 希森美康株式会社 测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法及试剂盒
US20160109472A1 (en) * 2014-10-21 2016-04-21 Health Diagnostic Laboratory, Inc. Quantitative molar concentration detection of specific apolipoprotein-containing particles present in bodily fluids by using capillary electrophoresis
CN106771147A (zh) * 2016-12-22 2017-05-31 广州华弘生物科技有限公司 一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGLIANG HE ET AL.: "Arachidonic Acid-Modified Lovastatin Discoidal Reconstituted High Density Lipoprotein Markedly Decreases the Drug Leakage during the Remodeling Behaviors Induced by Lecithin Cholesterol Acyltransferase", 《PHARM RES》 *
MIN-CHEOL ET AL.: "Microbead-assisted PDA sensor for the detection of genetically modified organisms", 《ANAL BIOANAL CHEM》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107894412B (zh) 2020-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230077406A1 (en) Rapid detection of replicating cells
Lian et al. Ultrasensitive detection of biomolecules with fluorescent dye-doped nanoparticles
CN106574925B (zh) 用于生物测定的底物介导的反应器
CN106053405B (zh) 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法
US20110275092A1 (en) Method for detecting biological markers by an atomic force microscope
CN108192951A (zh) 观察肿瘤细胞外泌体与外泌体内部miRNA在受体细胞内动态分布的方法
Marconi et al. Enhanced extracellular matrix deposition on titanium implant surfaces: cellular and molecular evidences
McNally et al. Comparative three-dimensional imaging of living neurons with confocal and atomic force microscopy
CN107894412A (zh) 一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法
Hassanzadeh et al. Visualization of the solubilization process of the plasma membrane of a living cell by waveguide evanescent field fluorescence microscopy
Rosenhek-Goldian et al. Imaging of extracellular vesicles derived from plasmodium falciparum–infected red blood cells using atomic force microscopy
CN114002195A (zh) 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用
Hsieh et al. Quantification and Imaging of Antigens on Cell Surface with Lipid-Encapsulated Fluorescent Nanodiamonds
Ghorbanzade et al. Multifunctional magnetic nanoparticles-labeled mesenchymal stem cells for hyperthermia and bioimaging applications
Chen et al. Mesoporous silica promotes osteogenesis of human adipose-derived stem cells identified by a high-throughput microfluidic chip assay
Amiri et al. Carcinomas with occult metastasis potential: Diagnosis/prognosis accuracy improvement by means of force spectroscopy
US20240110912A1 (en) Diagnostic testing
Bairamukov et al. Structural Peculiarities of Mechanically Deformed HeLa Nuclei Observed by Atomic-Force Microscopy
Nguyen et al. Limiting Brownian Motion to Enhance Immunogold Phenotyping and Superimpose Optical and Non-Optical Single-EP Analyses
Khalenkow et al. Chlamydia psittaci infected cell studies by 4Pi Raman and atomic force microscopy
Moldovan et al. Use of laser scanning cytometry for analysis of endothelial cells attached to micropatterned silicon surfaces
Pangarkar Discrete transport phenomena in endocytosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant