CN115814092A - 与急性t淋巴细胞白血病治疗相关的靶点cd28及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与急性T淋巴细胞白血病治疗相关的靶点CD28及其应用。本发明一方面发现了肿瘤抑制因子BACH2可转录抑制CD28基因的表达，且肿瘤抑制因子BACH2通过结合CD28基因近端启动子和5’‑UTR中的三段MARE序列参与转录抑制调控，为白血病研究提供了一个新的BACH2下游靶基因；另一方面发现了干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达可促进T‑ALL细胞发生凋亡或坏死，并抑制白血病细胞周期的进程，从而抑制T‑ALL细胞生长，该下游靶基因有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。

Description

与急性T淋巴细胞白血病治疗相关的靶点CD28及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与急性T淋巴细胞白血病治疗相关的靶点CD28及其应用。
背景技术
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。由于分化障碍、增殖失控、凋亡受阻等机制，恶性细胞在骨髓及其他造血组织中大量增殖，从而引发严重的临床症状及并发症。其中，急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一类恶性程度高的白血病亚型，约占儿童与成人急性淋巴细胞白血病病例的15％及25％。由于T-ALL细胞具有高度异质性、易侵犯中枢神经系统、对常规化疗不敏感、复发率高等特点，T-ALL在临床上被划为预后不良亚型。近年来，大剂量多药联合化疗使得儿童T-ALL的治疗得到大幅改善，但治疗效果明显差于急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)，且远期毒副作用大。此外，成人T-ALL中位生存时间短，且近半数患者对化疗不敏感。究其原因，主要是T-ALL缺乏特异性分子靶标与靶向药物，因此难以实施个体化与靶向治疗。既往有研究表明T-ALL具有某些特征性分子遗传学及表观遗传学改变，如NOTCH1基因突变、EZH2表观遗传调控因子突变等。尽管如此，仍有近半数患者不携带这些T-ALL分子标志物，提示T-ALL的发生发展尚受到其他分子调控事件及信号转导通路改变等影响。
BTB与CNC同源蛋白2(BTB and CNC homology 2，BACH2)是淋巴细胞特异性转录抑制因子，由BACH2基因编码。在B细胞定向发育过程中，BACH2通过抑制髓系发育程序推动祖细胞向B细胞分化，并参与调节人类体细胞高度突变与抗体类别转换重组。在T细胞中，BACH2维持初始T细胞及调节性T细胞稳态，并参与调控效应T细胞及记忆T细胞分化等过程。由此可见，BACH2在B细胞与T细胞发育及分化过程中发挥关键调节作用。
BACH2是一类具有碱性亮氨酸拉链(basic region leucine zipper，bZIP)结构域的蛋白。它在体内与小Maf蛋白形成异二聚体，并通过识别DNA序列上的Maf识别元件(Mafrecognition element，MARE，5’-TGCTGA[G/C]TCAGCA-3’)抑制下游靶基因的转录，发挥关键的调控作用。例如，在B细胞发育与分化过程中，BACH2受到许多上游转录因子的调节，如PAX5、E2A等。此外，BACH2通过调控下游靶基因如PRDM1、HMOX1等实现对B细胞发育和分化的调节。同样，在T细胞发育与分化过程中，BACH2通过转录抑制效应记忆T细胞中相关基因如HMOX1、EGLN3等维持T细胞的初始状态。此外，BACH2还通过调控下游相关基因如PRDM1、BATF等实现对T细胞耗竭状态的调节。因此，深入了解BACH2的基因调控网络有助于进一步了解相关疾病，如T-ALL的发生机制与治疗。
CD28是一类T细胞表面共刺激分子。它与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86分子结合，为T细胞活化、增殖与细胞因子产生提供重要的协同刺激信号。
发明内容
本发明的一个目的是提供抑制CD28蛋白活性的物质或降低CD28蛋白含量的物质的新用途。
本发明提供了抑制CD28蛋白活性的物质或降低CD28蛋白含量的物质在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)制备治疗白血病的产品；
A2)制备促进白血病细胞凋亡和/或坏死的产品；
A3)制备抑制白血病细胞周期进程的产品；
A4)制备抑制白血病细胞生长的产品。
本发明的另一个目的是提供一种产品，本发明提供的产品的活性成分为抑制CD28蛋白活性的物质或降低CD28蛋白含量的物质；
所述产品的功能为如下B1)-B4)中的任一种：
B1)治疗白血病；
B2)促进白血病细胞凋亡和/或坏死；
B3)抑制白血病细胞周期进程；
B4)抑制白血病细胞生长。
上述任一所述应用或产品中，所述CD28蛋白具有下述a)和b)至少一种特性：
a)在白血病细胞中受到肿瘤抑制因子BACH2的转录抑制调控；
b)在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合。
进一步的，所述CD28蛋白在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合的序列位于CD28基因近端启动子和5’非翻译区(5’-UTR)。
更进一步的，所述CD28蛋白在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合的序列为序列5所示的DNA分子和/或序列6所示的DNA分子和/或序列7所示的DNA分子。
上述任一所述应用或产品中，所述抑制CD28蛋白活性的物质可为本领域技术人员公知的任一种可抑制CD28蛋白活性的物质，如抑制CD28蛋白功能的蛋白质(如CD28抗体)、多肽或小分子化合物(如CD28抑制剂)。
所述降低CD28蛋白含量的物质可为本领域技术人员公知的任一种可降低CD28蛋白含量的物质，如抑制CD28蛋白合成或促进CD28蛋白降解或敲低或敲除CD28基因的物质。
进一步的，所述敲低CD28基因的物质可为本领域技术人员公知的任一种可使CD28基因表达量降低的物质，如干扰或抑制CD28基因表达的核酸分子(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)。
所述敲除CD28基因的物质可为本领域技术人员公知的任一种可使CD28基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的物质，如用于CD28基因编辑的CRISPR/Cas9系统等。
更进一步的，所述抑制CD28基因表达的物质为靶向人T细胞表面共刺激分子CD28的shRNA或表达所述shRNA的慢病毒质粒或表达所述shRNA的慢病毒。所述慢病毒质粒为将所述shRNA的编码基因插入慢病毒表达载体后得到的。所述慢病毒为将所述慢病毒质粒转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的。所述慢病毒质粒和所述慢病毒均可按照本领域技术人员公知的常规方法自行制备获得，也可以委托公司制备获得。
在本发明的具体实施例中，所述shRNA的核苷酸序列如序列8或序列9所示。
上述任一所述应用或产品中，所述白血病为急性T淋巴细胞白血病。
所述白血病细胞为急性T淋巴细胞白血病细胞，具体可为细胞系来源的人急性T淋巴细胞白血病细胞或病人来源的急性T淋巴细胞白血病骨髓细胞。
CD28蛋白或CD28基因作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗白血病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
CD28蛋白或CD28基因作为肿瘤抑制因子BACH2的下游靶基因在参与BACH2基因网络调控中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述应用或产品中，所述肿瘤抑制因子BACH2的氨基酸序列如序列1所示，所述BACH2基因的核苷酸序列如序列2所示。
所述CD28蛋白的氨基酸序列如序列3所示，所述CD28基因的核苷酸序列如序列4所示。
本发明首先利用过表达慢病毒产品Lenti-BACH2建立了稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE及MOLT-4/BACH2OE。Western Blot检测稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE、MOLT-4/BACH2OE和对照组细胞中的BACH2表达水平结果表明：Jurkat/BACH2OE及MOLT-4/BACH2OE中的肿瘤抑制因子BACH2表达水平明显高于对照组。
本发明其次探究了肿瘤抑制因子BACH2对T细胞表面共刺激分子CD28的调控机制。第一步采用稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE与对照组细胞进行RNA高通量测序，分析结果显示：相较对照组，CD28基因的转录水平显著降低。第二步采用人T淋巴细胞白血病的细胞系Jurkat进行CUT&Tag高通量测序，分析结果显示：相较对照组，CD28基因近端启动子和5’非翻译区(5’-UTR)存在明显的BACH2蛋白富集峰。第三步在人肾上皮细胞系293T细胞中，将BACH2重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2分别与携带3个MARE预测位点的CD28基因荧光素酶重组质粒(pGL3-CD28p)、海肾荧光素酶表达载体质粒pRL-SV40共转染293T细胞，结果显示携带3个不同MARE预测位点的pGL3-CD28p的转录活性相较对照组降低约3.5倍，呈现明显的转录抑制作用。第四步采用流式细胞仪分别检测稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE、MOLT-4/BACH2OE和对照组细胞中的CD28蛋白水平，结果显示稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE及MOLT-4/BACH2OE中的CD28蛋白水平显著低于对照组，二者间呈现负相关，与RNA高通量测序结果一致。
本发明最后探究了干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达对白血病细胞凋亡与生长的影响。第一步利用shRNA慢病毒产品Lenti-CD28-RNAi-1或Lenti-CD28-RNAi-2分别建立了稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1及Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-1及MOLT-4/CD28KD-2。流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2和对照组细胞中的CD28表达水平结果表明：Jurkat/CD28KD-1及Jurkat/CD28KD-2中的CD28表达水平明显低于对照组。流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞MOLT-4/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-2和对照组细胞中的CD28表达水平结果表明：MOLT-4/CD28KD-1及MOLT-4CD28KD-2中的CD28表达水平明显低于对照组。第二步采用流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2和对照组细胞的凋亡及坏死水平结果表明：Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2和对照组细胞的早期凋亡比例分别为6.18％、0.06％和0.18％；晚期凋亡比例分别为2.19％、0.02％和0％；坏死比例分别为38.5％、91.8％和4.18％，总体凋亡与坏死比例分别为46.87％、91.88％和4.36％；MOLT-4/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-2和对照组细胞的早期凋亡比例分别为3.2％、16.4％和4.32％；晚期凋亡比例分别为19.4％、77.9％和2.66％；坏死比例分别为1.02％、0.67％和0.09％，总体凋亡与坏死比例分别为23.62％、94.97％和7.07％。第三步采用流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1和对照组细胞的细胞周期分布结果表明：Jurkat/CD28KD-1和对照组细胞的G0-G1期细胞比例分别为53.0％和49.2％；S期细胞比例分别为24.6％和35.4％；G2-M期细胞比例分别为22.4％和15.4％；MOLT-4/CD28KD-1和对照组细胞的G0-G1期细胞比例分别为56.1％和49.2％；S期细胞比例分别为33.7％和40.6％，G2-M期细胞比例分别为10.2％和10.2％。第四步采用细胞计数法分别检测Jurkat/CD28KD-1和对照组细胞、以及MOLT-4/CD28KD-1和对照组细胞的生长趋势，结果表明：相较对照组，稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1的生长速率显著降低。
本发明实验结果一方面表明肿瘤抑制因子BACH2可转录抑制CD28基因的表达，且肿瘤抑制因子BACH2通过结合CD28基因近端启动子和5’-UTR中的三段MARE序列参与转录抑制调控，为白血病研究提供了一个新的BACH2下游靶基因；另一方面表明干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达可促进T-ALL细胞发生凋亡或坏死，并抑制白血病细胞周期的进程，从而抑制T-ALL细胞生长，该下游靶基因有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为过表达稳转重组白血病细胞中肿瘤抑制因子BACH2的Western Blot检测结果。其中，第一排为以BACH2单克隆抗体为一抗检测肿瘤抑制因子BACH2，第二排为以β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体为一抗检测内参β-actin。其中，左右两列BACH2OE分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE；左右两列BACH2Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2Con及MOLT-4/BACH2Con。
图2为采用重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE与对照重组白血病细胞Jurkat/BACH2Con进行RNA高通量测序，以及采用人T淋巴细胞白血病的细胞系Jurkat进行CUT&Tag高通量测序的结果。以人的GRCh38基因组作为参考，采用可视化分析软件IGV v2.8.3显示人CD28基因的相对转录水平与CD28基因区域的BACH2蛋白富集峰。
图3为双荧光素酶报告基因检测的统计结果。其中，将携带3个MARE预测位点(第-128～-117位的5’-TGCTGCAGTCAG-3’；第-19～-8位的5’-GCGTCTTTCAGT-3’；第2～13位的5’-TGCTCAGGCTGC-3’)的CD28片段(第-500～210位)插入pGL3-basic载体中，命名为pGL3-CD28p；空载荧光素酶报告质粒pGL3-basic作为空白对照。BACH2重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2是将编码人BACH2蛋白的开放阅读框序列由Lenti-ORF-BACH2质粒中亚克隆构建至表达载体pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1-BACH2；空载表达载体质粒pcDNA3.1(+)作为阴性对照，命名为pcDNA3.1。
图4为流式细胞仪检测稳定过表达肿瘤抑制因子BACH2的重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的CD28蛋白水平。其中，上方直方图显示以CD28单克隆流式抗体检测CD28的蛋白水平：左右两列BACH2OE分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE；左右两列BACH2Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2Con及MOLT-4/BACH2Con。下方柱状图左右两列分别为CD28阳性(CD28+)细胞在Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的相对荧光强度统计结果。
图5为RNA干扰稳转重组白血病细胞中T细胞表面共刺激分子CD28的流式细胞仪检测结果。其中，上方直方图显示以CD28单克隆流式抗体检测CD28的蛋白水平：左右两列CD28KD-1分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1；左右两列CD28KD-2分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2；左右两列CD28Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con。下方柱状图左右两列分别为CD28+细胞在Jurkat/CD28KD-1与Jurkat/CD28KD-2、及MOLT-4/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-2中的相对荧光强度统计结果。
图6为流式细胞仪检测稳定干扰T细胞表面共刺激分子CD28的重组白血病细胞系的早期凋亡[7-AAD(-)/Annexin V(+)]、晚期凋亡[7-AAD(+)/Annexin V(+)]及坏死[7-AAD(+)/Annexin V(-)]细胞的比例。其中，上下两排CD28KD-1分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1；上下两排CD28KD-2分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2；上下两排CD28Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con。
图7为流式细胞仪检测稳定干扰T细胞表面共刺激分子CD28的重组白血病细胞系的细胞周期进程包括G0-G1期、S期及G2-M期细胞的比例。其中，左右两列CD28KD-1分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1；左右两列CD28Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28Con与MOLT-4/CD28Con。
图8为细胞计数法检测稳定干扰T细胞表面共刺激分子CD28的重组白血病细胞系的生长曲线结果。其中，左右两列CD28KD-1分别代表稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1；左右两列CD28Con分别代表对照稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值±标准差。统计分析采用t检验。*表示p值小于0.05；**表示p值小于0.01。
下述实施例中的表达载体质粒pcDNA3.1(+)是美国Invitrogen公司的产品；Lenti-ORF-BACH2质粒是美国GE Dharmacon公司的产品(克隆号为PLOHS_100066339)；荧光素酶表达载体质粒pGL3-basic、海肾荧光素酶表达载体质粒pRL-SV40与双荧光素酶报告基因检测试剂盒均是美国Promega公司的产品。
下述实施例中的人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat与MOLT-4是美国模式培养物保藏所(ATCC)的产品。人肾上皮细胞系293T是中国科学院昆明动物研究所的产品。上述细胞系均通过细胞STR鉴定确认。
下述实施例中的过表达慢病毒产品Lenti-BACH2与对照慢病毒产品Lenti-Con、shRNA慢病毒产品Lenti-CD28-RNAi-1、Lenti-CD28-RNAi-2与对照慢病毒产品Lenti-NS均是上海吉凯基因公司的产品。其中，shRNA慢病毒产品Lenti-CD28-RNAi-1表达的shRNA1的核苷酸序列如序列8所示，shRNA慢病毒产品Lenti-CD28-RNAi-2表达的shRNA2的核苷酸序列如序列9所示。
下述实施例中的RPMI-1640培养基是Thermo Fisher Scientific公司的产品，货号为C11875500BT。
下述实施例中的DMEM培养基是Biological Industries公司的产品，货号为06-1055-57-1ACS。
下述实施例中的肿瘤抑制因子BACH2的氨基酸序列如序列1所示，编码基因序列如序列2所示。
下述实施例中的T细胞表面共刺激分子CD28的氨基酸序列如序列3所示，编码基因序列如序列4所示。
实施例1、肿瘤抑制因子BACH2的过表达稳定转染(稳转)细胞系的制备
一、肿瘤抑制因子BACH2的过表达稳转细胞系的筛选与建立
将病毒液(过表达慢病毒产品Lenti-BACH2或对照慢病毒产品Lenti-Con)分别感染人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat与MOLT-4，建立过表达稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE、MOLT-4/BACH2OE，及对照细胞系Jurkat/BACH2Con、MOLT-4/BACH2Con。
具体步骤如下：
1、感染用细胞的培养
用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基在T-25透气细胞培养瓶、37℃和5％CO2条件下培养T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat与MOLT-4。
2、慢病毒感染
计数步骤1培养的Jurkat与MOLT-4细胞，取含5×105个细胞的培养液，1000rpm离心5分钟，去除培养基。采用1ml含有10％ FBS的RPMI-1640培养基在6孔板中重悬细胞。在细胞悬液中加入40μl感染试剂P液，并根据细胞感染复数(MOI)及病毒滴度加入相应病毒量，计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。2500rpm离心60min；37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养16小时。
3、稳转重组白血病细胞系的筛选与建立
取出步骤2中培养的细胞系，去除培养基，加入4ml新鲜的含有10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，继续放置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。48小时后，将6孔板中的细胞转移至T-25透气细胞培养瓶中，补充至10ml新鲜的含有10％ FBS的RPMI-1640培养基继续培养。24小时后，加入2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)对细胞株进行筛选，每隔2-3天更换培养基，筛选7-10天。
二、Western Blot检测稳转重组白血病细胞系中肿瘤抑制因子BACH2的表达
取步骤一建立的稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE、MOLT-4/BACH2OE，及对照细胞系Jurkat/BACH2Con、MOLT-4/BACH2Con，分别提取总蛋白，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，进行Western blot检测。检测肿瘤抑制因子BACH2的一抗为BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，检测内参β-actin的一抗为β-actin(分子量42KDa)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，结果如图1所示。
结果表明：采用过表达慢病毒Lenti-BACH2建立的稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的BACH2蛋白表达水平均明显高于对照慢病毒Lenti-Con建立的稳转白血病细胞系Jurkat/BACH2Con与MOLT-4/BACH2Con。
上述提取总蛋白的具体方法如下：1000rpm离心5分钟收集稳定表达的白血病细胞，用预冷1×PBS缓冲液洗两遍，加150～300μl RIPA缓冲液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm离心30min；吸取上清，利用Bradford法进行蛋白定量；各取20μg总蛋白进行Western blot检测。
上述Western blot检测的具体方法如下：
1、电泳及转膜
对待测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120V继续电泳约1-1.5小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，400mA，2小时。
2、封闭膜
用PBS-T溶液(1×PBS缓冲液中加入2ml Tween-20，定容至1L)洗NC膜10-15分钟。将NC膜放入含5％BSA的PBS-T溶液中，室温封闭1小时。
3、免疫杂交
1)一抗孵育：将BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(或β-actin单克隆抗体)按1:1000稀释于PBS-T溶液中，4℃冷室中与NC膜在脱色摇床上孵育过夜，用5ml PBS-T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。
2)二抗孵育：将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体按1:5000稀释在PBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约45分钟，用5ml PBS-T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。
3)ECL试剂显色：使用ECL蛋白杂交检测试剂盒(美国BioRad公司)，参照操作说明进行NC膜显色反应。
实施例2、稳转重组白血病细胞的RNA高通量检测及人T淋巴细胞白血病细胞的CUT&Tag高通量检测
一、稳转重组白血病细胞的RNA高通量检测
取实施例1步骤一中建立的过表达稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE与对照细胞系Jurkat/BACH2Con，分别提取总RNA。
上述总RNA提取采用美国Zymo Research公司的Direct-zol RNA MiniPrep Plus试剂盒。
具体操作方法如下：
1、1000rpm离心5分钟收集白血病细胞，加入200μl Trizol试剂，充分震荡混匀，室温裂解5min。
2、加入200μl 100％乙醇溶液，充分震荡混匀。
3、取一个滤液管(Zymo-Spin IIICG Column)套入一个收集管(Collection Tube)中，将混合液转移至滤液管中，室温12000rpm离心1min。
4、弃含有滤液的收集管，将滤液管套入另一个干净的收集管中。
5、向滤液管中加入400μl的RNA预洗液(Direct-zol RNAPreWash)，室温12000rpm离心1min；弃滤液，重复清洗一次。
6、向滤液管中加入700μl的RNA清洗缓冲液(RNA Wash Buffer)，室温12000rpm离心2min。
7、将滤液管转移至一个不含RNA酶的1.5ml EP管中，向滤液管中心加入50μl不含DNA/RNA酶的纯净水，室温12000rpm离心1min。
8、各取1μg总RNA进行RNA文库的建立与高通量测序，用于检测BACH2参与转录调控的差异表达基因。
上述RNA文库的建立与高通量测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。测序完成后，对稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE和对照组细胞Jurkat/BACH2Con的测序原始数据进行差异表达基因的分析。以人的GRCh38基因组作为参考，锁定人CD28基因区域，观察BACH2蛋白对CD28基因转录水平的调控，结果如图2(第三排)所示。
结果表明：相较对照组细胞Jurkat/BACH2Con，CD28基因在过表达稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE中的转录水平显著下调；其中绿色向下的峰图表示转录水平下调，红色向上的峰图表示转录水平上调。
二、人T淋巴细胞白血病细胞的CUT&Tag高通量检测
采用人T淋巴细胞白血病的细胞系Jurkat，加入肿瘤抑制因子BACH2的单克隆抗体(一抗，美国Cell Signaling Technology公司)进行CUT&Tag文库的建立与高通量测序，用于检测与BACH2蛋白互作的DNA片段。
上述CUT&Tag文库的建立与高通量测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。测序完成后，将测序原始数据导入可视化分析软件IGV v2.8.3中，以人的GRCh38基因组作为参考，锁定人CD28基因区域，观察BACH2蛋白的富集峰，结果如图2(前两排)所示。
结果显示：与第一排IgG对照组相比，第二排BACH2蛋白在CD28基因近端启动子和5’-UTR区域显示明显的富集峰(红色箭头指示)。
实施例3、双荧光素酶报告基因的检测
一、荧光素酶报告重组质粒与BACH2重组表达质粒的构建
1、重组质粒pGL3-CD28p的构建
委托广州易锦生物技术有限公司合成pGL3-CD28p质粒，该质粒为将携带3个MARE预测位点(第-128～-117位的5’-TGCTGCAGTCAG-3’；第-19～-8位的5’-GCGTCTTTCAGT-3’；第2～13位的5’-TGCTCAGGCTGC-3’)的CD28片段(第-500～210位)插入pGL3-basic载体后得到的质粒。
2、重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2的构建
以人BACH2蛋白的开放阅读框(ORF)表达质粒Lenti-ORF-BACH2为模板，分别采用限制性内切酶BamHI与XhoI将Lenti-ORF-BACH2质粒中的BACH2蛋白开放阅读框序列亚克隆至表达载体pcDNA3.1(+)中，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2。
上述引物合成和重组质粒测序均由擎科生物公司完成。
二、双荧光素酶报告基因的检测
1、转染用细胞的培养
转染前24小时，用含有10％ FBS的DMEM培养基在96孔细胞培养板、37℃和5％ CO2条件下培养人肾上皮细胞系293T达到60％～70％时进行转染。
2、重组质粒的瞬时转染
将步骤一中获得的荧光素酶报告重组质粒pGL3-CD28p与重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2、海肾荧光素酶表达载体质粒pRL-SV40共转染293T细胞。空载荧光素酶报告质粒pGL3-basic与空载表达载体质粒pcDNA3.1(+)分别作为空白对照与阴性对照。
上述转染的具体方法如下：取两个无菌1.5ml EP管，其中一个EP管中加入100μl无血清DMEM培养基稀释100ng重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2或pcDNA3.1(+)、100ng荧光素酶报告重组质粒pGL3-CD28p、20ng海肾荧光素酶表达载体质粒pRL-SV40；另一个EP管中加入100μl无血清DMEM培养基和0.66μl的Lipofectamine 2000试剂。将两管充分混匀，室温静置5分钟。将200μl的混合液逐滴加入96孔细胞培养板的2个平行孔中，每孔加入100μl。轻轻摇动平皿混匀后转移至37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
3、双荧光素酶报告基因的检测
转染48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒对样品分别进行萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)及海肾荧光素酶(Renillaluciferase，RL)活性的测定，并计算得出荧光素酶相对活性(FL/RL)。
采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性的具体操作方法如下：
1)小心去除细胞孔中的上清液。
2)加入100μl/孔1×PBS缓冲液润洗细胞，去除润洗液。
3)加入20μl/孔1×裂解液(Passive Lysis Buffe，PLB)，室温置于摇床上，轻轻震荡15min。
4)加入100μl/孔荧光底物试剂(LARII)，仪器测定10秒的光输出值，得出FL活性，记录测量值。
5)加入100μl/孔终止试剂(Stop&Glo Reagent)，仪器测定10秒的光输出值，得出RL活性，记录测量值。
6)各孔细胞的转染效率误差通过内对照RL活性进行校正，即将所测得的FL活性值除以内对照RL活性值，获得校正转染效率后的相对活性(FL/RL)；计算得出荧光素酶相对活性后，再通过对照组荧光素酶相对活性进一步计算活性变化倍数，即将实验组荧光素酶相对活性除以对照组荧光素酶相对活性，获得活性倍数。结果如图3所示。
结果表明：与空载表达载体质粒pcDNA3.1(+)(对照组)相比，共转染BACH2重组表达质粒pcDNA3.1(+)-BACH2与pGL3-CD28p的转录活性降低约4.5倍，呈现明显的转录抑制作用。
实施例4、稳转重组白血病细胞中的CD28蛋白水平检测
取实施例1步骤一中建立的过表达稳转重组白血病细胞系Jurkat/BACH2OE、MOLT-4/BACH2OE及对照细胞系Jurkat/BACH2Con、MOLT-4/BACH2Con，分别加入T细胞表面共刺激分子CD28的APC单克隆流式抗体(美国BD Pharmingen公司)，用于流式细胞仪检测CD28的蛋白表达水平。结果如图4所示。
结果显示：在上方的直方图中，与蓝色显示的Jurkat/BACH2Con与MOLT-4/BACH2Con对照组相比，红色显示的过表达稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的CD28+细胞的峰图左移，表明CD28表达的荧光强度降低；下方柱状图针对上方直方图的统计结果显示CD28+细胞在Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的荧光强度显著低于Jurkat/BACH2Con与MOLT-4/BACH2Con对照组，表明CD28在过表达稳转重组白血病细胞Jurkat/BACH2OE与MOLT-4/BACH2OE中的表达水平显著下调，二者间呈现负相关，与RNA高通量测序结果一致。
实施例5、T细胞表面共刺激分子CD28的RNA干扰稳转细胞系的制备
一、T细胞表面共刺激分子CD28的RNA干扰稳转细胞系的筛选与建立
将RNA干扰病毒液(shRNA慢病毒产品Lenti-CD28-RNAi-1、Lenti-CD28-RNAi-2或对照慢病毒产品Lenti-NS)分别感染人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat与MOLT-4，建立RNA干扰稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-2，以及对照细胞系Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con。具体步骤如下：
1、感染用细胞的培养
用含有10％ FBS的RPMI-1640培养基在T-25透气细胞培养瓶、37℃和5％CO2条件下培养T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat与MOLT-4。
2、慢病毒感染
计数步骤1培养的Jurkat与MOLT-4细胞，取含5×105个细胞的培养液，1000rpm离心5分钟，去除培养基。采用1ml含有10％ FBS的RPMI-1640培养基在6孔板中重悬细胞。在细胞悬液中加入40μl感染试剂P液，并根据细胞感染复数(MOI)及病毒滴度加入相应病毒量，计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。2500rpm离心60min；37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养16小时。
3、稳转重组白血病细胞系的筛选与建立
取出步骤2中培养的细胞系，去除培养基，加入4ml新鲜的含有10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，继续放置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。48小时后，将6孔板中的细胞转移至T-25透气细胞培养瓶中，补充至10ml新鲜的含有10％ FBS的RPMI-1640培养基继续培养。24小时后，加入2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)对细胞株进行筛选，每隔2-3天更换培养基，筛选7-10天。
二、流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞系中T细胞表面共刺激分子CD28的表达
取步骤一中建立的RNA干扰稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-2及对照细胞系Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con，分别加入T细胞表面共刺激分子CD28的APC单克隆流式抗体(美国BD Pharmingen公司)，用于流式细胞仪检测CD28的蛋白表达水平。结果如图5所示。
结果显示：在上方的直方图中，与红色显示的Jurkat/CD28Con与MOLT-4/CD28Con对照组相比，橘黄色显示的RNA干扰稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1，及绿色显示的RNA干扰稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2中的CD28+细胞的峰图左移，表明CD28表达的荧光强度降低；下方柱状图针对上方直方图的统计结果显示CD28+细胞在Jurkat/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-1与Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2中的荧光强度显著低于Jurkat/CD28Con与MOLT-4/CD28Con对照组，表明CD28在RNA干扰稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-1与Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2中的表达水平显著下调；其中，RNA干扰效果以稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2最为显著。
实施例6、稳转重组白血病细胞系的凋亡及坏死水平检测
取实施例5步骤一中建立的RNA干扰稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-1与Jurkat/CD28KD-2与MOLT-4/CD28KD-2及对照细胞系Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con，分别采用流式细胞仪对细胞进行凋亡及坏死检测。细胞凋亡检测试剂盒为美国BD Pharmingen公司的7-AAD/Annexin V细胞凋亡试剂盒。结果如图6所示。
结果表明：在第一排中，稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1、Jurkat/CD28KD-2和Jurkat/CD28Con的早期凋亡比例分别为6.18％、0.06％和0.18％；晚期凋亡比例分别为2.19％、0.02％和0％；坏死比例分别为38.5％、91.8％和4.18％％，总体凋亡与坏死比例分别为46.87％、91.88％和4.36％。在第二排中，MOLT-4/CD28KD-1、MOLT-4/CD28KD-2和MOLT-4/CD28Con细胞的早期凋亡比例分别为3.2％、16.4％和4.32％；晚期凋亡比例分别为19.4％、77.9％和2.66％；坏死比例分别为1.02％、0.67％和0.09％％，总体凋亡比例分别为23.62％、94.97％和7.07％，表明干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达可促进T-ALL细胞发生凋亡或坏死。
实施例7、稳转重组白血病细胞系的细胞周期检测
取实施例5步骤一中建立的RNA干扰稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1，及对照细胞系Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con，分别采用流式细胞仪对细胞进行细胞周期检测。细胞周期检测试剂为美国BD Pharmingen公司的PI/RNaseStaining Buffer。结果如图7所示。
结果表明：稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与Jurkat/CD28Con的G0-G1期细胞比例分别为53.0％和49.2％；S期细胞比例分别为24.6％和35.4％；G2-M期细胞比例分别为22.4％和15.4％；MOLT-4/CD28KD-1和MOLT-4/CD28Con的G0-G1期细胞比例分别为56.1％和49.2％；S期细胞比例分别为33.7％和40.6％，G2-M期细胞比例分别为10.2％和10.2％，表明干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达可抑制白血病细胞周期的进程。
实施例8、稳转重组白血病细胞系的细胞生长检测
取实施例5步骤一中建立的RNA干扰稳转重组白血病细胞系Jurkat/CD28KD-1与MOLT-4/CD28KD-1，及对照细胞系Jurkat/CD28Con及MOLT-4/CD28Con，分别采用细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果如图8所示。
结果表明：稳转重组白血病细胞Jurkat/CD28KD-1与Jurkat/CD28Con在第2天的相对生长倍数分别为4.6和1.5；在第4天的相对生长倍数分别为10.3与3.4；在第6天的相对生长倍数分别为25与8.2；在第8天的相对生长倍数分别为40.5与10。稳转重组白血病细胞MOLT-4/CD28KD-1与MOLT-4/CD28Con在第2天的相对生长倍数分别为5.7和4.1；在第4天的相对生长倍数分别为13.8与7.1；在第6天的相对生长倍数分别为32与20.5；在第8天的相对生长倍数分别为51.3与38.5，表明干扰T细胞表面共刺激分子CD28的表达可抑制T-ALL细胞生长。
上述细胞计数的具体方法如下：取含4×105个细胞的培养液，1000rpm离心5分钟，去除培养基；采用4ml含有10％ FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，分别加至24孔板中的4个孔中(1ml/孔)，保证每孔中含1×105个细胞，并将其命名为第0天；将细胞放置37℃，5％CO2细胞培养箱中连续培养8天，分别于指定日期进行细胞计数；将所测得的细胞数分别除以第0天的细胞数(1×105)，获得相对生长倍数。
以上实施例2-4证明肿瘤抑制因子BACH2可转录抑制CD28基因的表达，且BACH2蛋白通过结合CD28基因近端启动子和5’-UTR中的三段MARE序列参与转录抑制调控，最终抑制CD28的蛋白水平。实施例6-8进一步证明干扰CD28的表达可促进白血病细胞发生凋亡或坏死，并抑制白血病细胞周期的进程，从而抑制T-ALL细胞生长。本发明为白血病研究提供了一个新的BACH2下游靶基因，该下游靶基因有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抑制CD28蛋白活性的物质或降低CD28蛋白含量的物质在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)制备治疗白血病的产品；
A2)制备促进白血病细胞凋亡和/或坏死的产品；
A3)制备抑制白血病细胞周期进程的产品；
A4)制备抑制白血病细胞生长的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CD28蛋白具有下述a)和b)至少一种特性：
a)在白血病细胞中受到肿瘤抑制因子BACH2的转录抑制调控；
b)在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述b)中，所述CD28蛋白在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合的序列为序列5所示的DNA分子和/或序列6所示的DNA分子和/或序列7所示的DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述抑制CD28蛋白活性的物质为抑制CD28蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述降低CD28蛋白含量的物质为抑制CD28蛋白合成或促进CD28蛋白降解或敲低或敲除CD28基因的物质；
或，所述敲低CD28基因的物质为抑制CD28基因表达的shRNA。
5.一种产品，其活性成分为抑制CD28蛋白活性的物质或降低CD28蛋白含量的物质；
所述产品的功能为如下B1)-B4)中的任一种：
B1)治疗白血病；
B2)促进白血病细胞凋亡和/或坏死；
B3)抑制白血病细胞周期进程；
B4)抑制白血病细胞生长。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述CD28蛋白具有下述a)和b)至少一种特性：
a)在白血病细胞中受到肿瘤抑制因子BACH2的转录抑制调控；
b)在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：所述b)中，所述CD28蛋白在白血病细胞中与肿瘤抑制因子BACH2相结合的序列为序列5所示的DNA分子和/或序列6所示的DNA分子和/或序列7所示的DNA分子。
8.根据权利要求5-7任一所述的产品，其特征在于：所述抑制CD28蛋白活性的物质为抑制CD28蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；
或，所述降低CD28蛋白含量的物质为抑制CD28蛋白合成或促进CD28蛋白降解或敲低或敲除CD28基因的物质；
或，所述敲低CD28基因的物质为抑制CD28基因表达的shRNA。
9.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-8任一所述的产品，其特征在于：所述白血病为急性T淋巴细胞白血病。
10.CD28蛋白或CD28基因作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗白血病的产品中的应用；
或，CD28蛋白或CD28基因作为肿瘤抑制因子BACH2的下游靶基因在参与BACH2基因网络调控中的应用。
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