KR101662062B1

KR101662062B1 - 코플린-1을 이용한 갈색 지방세포 분화 조절 방법

Info

Publication number: KR101662062B1
Application number: KR1020140136570A
Authority: KR
Inventors: 김원곤; 이상철; 배광희; 한백수; 오경진; 최혜령; 박안나
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2016-10-04
Also published as: KR20160042543A

Abstract

본 발명은 갈색 지방세포 분화 조절에 있어서 코플린-1(cofilin-1; CFL1)의 역할에 관한 것으로, 코플린-1은 갈색 지방(brown fat)의 축적을 감소시키고 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색 지방 분화 마커인 UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 감소시키므로, 상기 코플린-1의 발현 또는 활성 억제제를 갈색 지방세포 분화 유도 또는 항 비만용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

코플린-1을 이용한 갈색 지방세포 분화 조절 방법{Method for regulation of brown adipocyte differentiation using cofilin-1}

본 발명은 액틴(actin) 결합 단백질인 코플린-1(cofilin-1; CFL1)을 이용한 갈색 지방 세포의 분화 조절 방법에 관한 것이다.

세계보건기구(World Health Organization (WHO))에 따르면, 비만은 2011년에만 전 세계적으로 4천만 명의 5세 미만 아동이 과체중임이 보고되었다. 비만은 평균 수명 기대치를 감소시키고 인슐린 저항, 당뇨병, 고혈압(hypertension), 지질파괴(지질 disturbances), 암, 골관절염(osteoarthritis), 일 장애(work disability) 및 수면성 무호흡(sleep apnea) 등과 같은 질환을 증가시킨다. 비만은 치사율(mortality)보다 병적상태(morbidity)에 더욱 큰 영향을 가지나(Visscher TL et al., Annu Rev Public Health 2001;22:355-375), 이러한 관련성에 대한 분자적 기반은 아직 알려진 바 없다.

지방세포는 에너지 항상성에 중요한 기능을 하고 비만과 당뇨병과 같은 대사성 질환과 밀접하게 연관된다. 포유류에서 두 가지 형태의 지방세포가 존재하는데 백색 지방세포와 갈색 지방세포이다(Gesta S et al ., Cell 2007;131:242-256). 백색 지방세포는 지방구(lipid droplets) 형태로 중성지방(triglycerides)과 같은 초과된 에너지를 저장하는데 반해(Spiegelman BM et al., Cell 2001;104:531-543), 갈색 지방세포는 비결합 단백질 UCP1의 높은 발현에 기인한 ATP 생성 지출에서 열 에너지를 생성하고 그래서 비만에 대응한다(Cannon B, et al ., Physiol Rev 2004;84:277-359). 갈색 지방이 갈색을 띠는 이유는 다량의 미토콘드리아를 보유함으로써 다량의 사이토크롬을 보유하기 때문이다(사이토크롬의 헴그룹은 가시광선을 강력하게 흡수한다). 갈색 지방의 미토콘드리아의 내막에는 서모제닌(thermogenin)(uncoupling protein)이라는 독특한 단백질이 존재하는데, 이 단백질은 수소를 F0F1복합체를 경유하지 않고 미토콘드리아의 기질로 통과시킨다. 따라서, 산화에너지는 ATP의 생성에 이용되지 않고 열로 방출되어 체온을 유지하는 데 사용된다. 동면동물도 갈색 지방의 미토콘드리아를 이용하여 동면기간 동안 체온을 유지한다(Lehninger: Principles of Biochemistry Ch. 19). 백색 지방세포 및 갈색 지방세포 둘 다 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)로부터 유래되지만, 발달의 형태에 있어서 두 가지 지방세포는 분명한 차이가 있다.

간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells)는 뚜렸한 백색 및 갈색 지방세포 전구체를 생성한다(Park KW et al ., Cell Metab 2008;8:454-457). 또한, 유도 갈색-같은 지방세포(베이지 또는 밝은 세포)는 비-Myf5 세포 일족(lineage)으로부터 생성되고 다수 소실(locular) 지질 입자(droplets)를 포함한 일반 갈색 지방세포의 분자 및 형태학적 특성을 함유한다. 갈색 지방조직(갈색지방조직)이 어깨사이부위(interscapular), 콩팥주의(perirenal) 및 겨드랑이 부위(axillary depots)에 존재하는 반면, 밝은 지방세포는 피하 백색 지방세포의 UCP1-양성 지방세포의 포켓으로서 존재한다(Wu J et al ., Cell 2012;150:366-376).

최근 연구에 따르면, PRDM16 발현의 증가는 근육(myogenic) 및 백색 지방 전구체가 갈색 지방세포로 분화를 유도할 수 있다(Seale P et al ., J Clin Invest 2011;121:96-105). 지금까지, 몇 가지 프로테옴 연구는 백색 지방세포, 지방조직, 마른 비만 래트, 비만-수용가능한 및 -저항 래트, 및 소(bovine)의 피하(subcutaneous) 모델의 단백질 발현 패턴에서 구별되는 프로테옴을 발견하였다. 어깨사이부위(interscapular) 조직으로부터 갈색 지방전구세포의 분화의 비교 분석이 행하여 지지 않았다. 특히, 갈색 지방세포의 분자적 기전에 대해서는 백색 지방세포에 비해서 정확히 연구되지 않고 있다.

코플린-1(CFL1)은 액틴 역학(actin dynamics) 조절에 있어서 액틴(actin)과 결합하는 단백질이다(Bernstein BW et al ., Trends Cell Biol 2010;20:187-195). CFL1은 농도 의존적으로 액틴(actin) 절단(severing), 안정 및 핵형성(nucleation)을 조절한다. CFL1-매개된 액틴(actin) 필라멘트의 절단은 T-세포이동 및 암 세포 전이에 필수적인 라멜리포디아(lamellipodia) 형성을 조절한다(Wang W et al ., Nat Rev Cancer 2007;7:429-440). CFL1 활성은 Ser3의 인산화에 의해 비활성화되는 LIM 카이네이즈(LIMK)를 포함하는 카이네이즈의 활성을 통하여 세포 내에 조절되고, 액틴(actin) 필라멘트의 안정을 초래한다.

이에, 본 발명자들은 갈색 지방세포를 분화를 조절할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 코플린-1(cofilin-1; CFL1)은 갈색 지방(brown fat)의 축적을 감소시키고 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색 지방 분화 마커인 UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 감소시키므로, 상기 코플린-1의 발현 또는 활성 억제제를 갈색 지방세포 분화 유도 또는 항 비만용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 코플린-1(cofilin-1: CFL1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 갈색지방세포 분화 유도용 약학적 조성물 및 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

1) 코플린-1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포주의 코플린-1 단백질의 발현정도를 측정하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 발현정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항 비만 또는 갈색지방세포 분화 유도 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 분리된 갈색지방세포에 처리하는 단계를 포함하는 갈색지방세포 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 코플린-1(cofilin-1: CFL1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 갈색지방세포 분화 유도용 약학적 조성물 및 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은

3) 상기 단계 2)의 발현정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항 비만 또는 갈색지방세포 분화 유도 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 분리된 갈색지방세포에 처리하는 단계를 포함하는 갈색지방세포 분화 유도 방법을 제공한다.

도 1은 0, 2 및 6 일째에 갈색지방전구체(brown preadipocytes)의 분화 과정 중의 대표하는 2-DE 젤 이미지를 나타낸 도이다.
도 2는 갈색지방분화 과정 중의 입증된 후보 단백질을 나타낸 도이다.
(A): 바 그래프(bar graph)와 같이 발현차이를 나타내는, 2-DE 젤의 선별된 단백질 스팟을 확대한 도이다.
(B): 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 입증된 단백질 발현차이를 나타낸 도이다. 데이타는 평균 ± SEM(각각의 군에서 n = 3이다)을 나타낸다.
도 3은 Cfl1의 과발현은 갈색지방분화를 억제함을 나타낸 도이다.
(A): 웨스턴 블랏 및 실시간 PCR에 의한 갈색지방 전구체의 분화 동안에 CFL1의 발현 분석을 나타낸 도이다.
(B): 129SVE 마우스에서 냉각노출 동안에 어깨사이부위(interscapular)에 있는 CFL1의 발현 및 농도 분석을 나타낸 도이다.
(C): 웨스턴 블랏 및 실시간 PCR에 의한 6일째에 과발현된 Cfl1 세포에서 CFL1의 발현 분석을 나타낸 도이다.
(D): 갈색지방분화 마커 유전자의 정량적 RT-PCR 분석 및 갈색 지방 전구체 분화 동안에 Cfl1 과발현의 효과를 나타낸 도이다.
(E): 6일째에 대조군 및 Cfl1 과발현 세포의 오일-레드-오(Oil-Red-O staining) 염색을 나타낸 도이다.
(F): 염색추출버퍼를 사용하여 염색된 세포의 정량화를 나타낸 도이다. 모든 데이타는 평균 ± SEM(n = 3, **P < 0.05, ***P < 0.01)으로 나타냈다.
도 4는 갈색지방세포에서 Cfl1의 과발현이 액틴 중합반응(actin polymerization)을 증가를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 코플린-1(cofilin-1: CFL1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 하는 갈색지방세포 분화 유도용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 코플린-1은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 코플린-1의 발현 억제제는 코플린-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 코플린-1 단백질의 활성 억제제는 코플린-1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질 유사체, 앱티머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 코플린-1은 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색지방세포 분화를 억제한다.

또한, 본 발명은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 코플린-1은 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 마우스 일차 갈색 지방전구세포를 이용하여 2-DE 젤에서 스팟을 분리한 후 대조군과 비교한 결과, 분화 동안에 일반적 2-DE 프로테옴 스팟 패턴을 나타냈다(도 1 참조). 상기로부터 얻은 단백질을 식별하기 위하여 10개의 단백질 스팟(2.0-배 보다 큰)을 MS 분석으로 확인한 결과, 10 kDa과 170 kDa 사이의 세 개의 상향-조절되는 단백질, 다섯 개의 하향-조절되는 단백질 및 두 개의 명백히 발현되는 단백질을 확인하였다(도 2 및 표 1 참조). 또한, 상기 단백질의 발현 변화를 2-DE 결과와 비교하기 위하여 웨스턴 블랏 분석 실험을 수행한 결과, 웨스턴 블랏 결과는 2-DE의 단백질 발현과 상관관계가 있음을 확인하였다(도 2 참조). 상기로부터 확인된 코플린-1(CFL1)이 갈색 지방생성 동안에 유의적으로 발현변화가 나타나는지 확인하기 위하여 CFL1의 단백질 및 mRNA 수준을 측정한 결과, CFL1은 단백질 및 RNA 수준에서 유도된 후 분화 후기 단계에서 감소됨을 확인하였고(도 3A 참조), 냉각 노출 과정에서, CFL1 단백질은 감소됨을 확인하였다(도 3B 참조). 또한, CFL1에 의한 갈색지방 마커의 패턴을 조사한 결과, Cfl1의 과발현은 UCP-1, PRDM16, PGC-1α 및 PPARγ 유전자 억제시킴을 확인하였다(도 3D 참조). 또한, 코플린-1(CFL1)은 액틴 중합반응(polymerization)을 증가시킴을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 코플린-1은 갈색 지방(brown fat)의 축적을 감소시키고 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색 지방 분화 마커인 UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 감소시키므로, 상기 코플린-1의 발현 또는 활성 억제제를 갈색 지방세포 분화 유도 또는 항 비만용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 발현정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC), RT-PCR, 웨스턴 블랏 및 유세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코팅된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

코플린-1 단백질의 발현을 억제하는 방법은 크게 넉아웃(knock-out)과 넉다운(knock-down)이 있다. 이중 넉다운 방법은 RNA 간섭(RNA interference, 이하 RNAi)을 이용하는 방법으로서, 염기서열의 특이성과 기존의 유전자 넉아웃 방법보다 간단하고 신속한 유전자 발현 억제 유도 기능으로 인하여 활발히 사용되고 있다. RNAi는 특정한RNA 분자를 분해하거나 특정 유전자의 전사를 방해하여 유전자 발현을 억제하는 기작으로서, miRNA(micro RNA) 또는 siRNA(small interfering RNA)에 의해 유도된다. 상기 siRNA는 20 내지 25개의 뉴클레오티드를 가진 이중 사슬 RNA(double stranded RNA, 이하 dsRNA) 분자로서, RISC(RNA-induced silencing complex)를 형성한 후 표적 mRNA와 상보적으로 결합하여 표적 mRNA의 분해를 유도한다. 생체 내에서는 다이서(dicer)라는 효소가 긴 dsRNA 또는 shRNA(small hairpin RNA)를 siRNA로 전환시킨다. 또한, siRNA는 생체 외에서 siRNA를 직접 합성한 후, 세포 안으로 도입시키는 방법, siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터를 세포 안으로 도입시키는 방법 등 다양한 트렌스펙션(transfection) 방법에 의해 세포 안으로 도입될 수 있다.

상기 항체는 당해 분야에 공지된 용어이며 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 의미한다. 공지된 항원에 결합하는 활성 단편의 예는 Fab 및 F(ab)2 단편을 포함한다. 상기 활성 단편은 수많은 기술에 의해서 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 정제된 단일 클론 항체는 펩신 같은 효소에 의해 절단되어 HPLC 겔 여과시킬 수 있다. Fab 단편을 함유하는 적합한 분획을 수집하여 막 여과 등에 의해 농축시킬 수 있다. 항체의 활성 단편 분리에 대한 일반적인 기술들에 대한 설명은 문헌[예를 들면, Khaw, B.A. et al., J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982)]을 참조한다. 또한, 상기 항체는 이특이적(bispecific) 및 키메라(chimeric) 항체를 포함한다.

본 발명의 항체는 검출 가능한 물질, 즉 검출 표지제와 커플링시켜 검출을 용이하게 할 수 있다. 검출 표지제의 예는 다양한 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질 등을 포함한다. 검출 표지제는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 레지스틴 단일클론 항체에 직접적으로 커플링 또는 결합되거나 중간체(예를 들면, 당해 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링되거나 결합될 수 있거나, 레지스틴 단백질을 인식하는 또 다른 다클론항체인 또는 레지스틴 항체를 인식하는 항체인 2차 항체에 커플링 또는 결합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제, 인버타제 등을 포함하고 적합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고 발광 물질의 예는 루미놀, 이소루시놀, 루시제닌을 포함하고 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며 적합한 방사선 물질의 예는 125 I, 131 I, 111 In, 99 Tc, 14 C 또는 3 H 등을 포함한다.

또한, 본 발명에서 코플린-1 단백질의 발현을 유도하거나 억제하는 성분은 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물 등이 될 수 있고, 특히 코플린-1 단백질의 발현을 억제하는 성분은 바람직하게는 코플린-1 mRNA와 상보적인 서열을 갖고 있는 siRNA(small interfering RNA)를 포함한다.

본 발명에서 코플린-1 단백질은 갈색 지방세포에서 그 발현량이 증가하는 경우 지방세포로의 분화를 억제시키고, 그 발현량이 감소하는 경우 지방세포로의 분화를 촉진시키는 작용을 하므로, 전지방세포, 지방전구세포 또는 줄기세포로부터 지방세포로의 분화단계에서 갈색 지방세포로의 분화 정도를 측정하고, 측정된 지방세포로의 분화 정도가 미리 설정된 기준치 이상 또는 이하인 경우 지방세포 분화 촉진제나 지방세포 분화 억제제를 투입하여 세포 내에서의 지방세포 분화 촉진제나 지방세포 분화 억제제의 농도를 원하는 수준으로 조절함으로써 갈색 지방세포로의 분화를 조절할 수 있다.

지방세포 분화 촉진제나 지방세포 분화 억제제를 세포에 주입하는 방법으로는 지방세포 분화 촉진제나 지방세포 분화 억제제를 약제의 제제 형태로 제조하여 통상적인 방식으로 인체에 투여하는 방법이 사용될 수 있고, 바람직하게는 유전공학적 기술인 벡터 시스템을 이용하는 방법 등 다양한 형태로 구현될 수 있다.

따라서, 본 발명의 코플린-1은 갈색 지방(brown fat)의 축적을 감소시키고 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색 지방 분화 마커인 UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 감소시키므로, 상기 코플린-1의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 갈색 지방세포 분화 유도 후보물질 스크리닝 방법 및 갈색지방세포 분화 유도 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 코플린-1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 코플린-1 억제제가 상기와 같은 비만 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.

본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 비만 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 비만 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 코플린-1은 갈색 지방(brown fat)의 축적을 감소시키고 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색 지방 분화 마커인 UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 감소시키므로, 상기 코플린-1의 발현 또는 활성 억제제를 갈색 지방세포 분화 유도 또는 항 비만용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 2- DE ( two - dimensional electrophoresis )를 이용한 신규 단백질 확인

<1-1> 세포 배양 및 갈색 지방세포 분화

갈색 지방전구세포를 콜라게나제(collagenase) 확산 방법으로 마우스(태아 후반부터 생후 2-3일)의 어깨사이부위(interscapular)의 갈색지방조직(Brown adipose tissue; BAT)으로부터 분리하였다(Kim WK, et al ., Int J Biochem Cell Biol 2012;44:327-334). 분리되 세포는 5% CO₂, 37℃에서 20% 태아 소(bovine) 혈청(FBS) 및 1% 항생제 용액을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM)에서 배양되었다. 분화를 위하여, 2일째의 100% 농도의 갈색 지방전구세포(0 일)에 10% FBS 및 1% 항생제 및 분화칵테일[0.5 mM 이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine(IBMX)), 0.5 mM 덱사메타존(dexamethasone), 0.12 mM 인도메타신(indomethacin)]을 포함하는 DMEM의 분화 배지로 변경하였다. 4일째(2 일)에 10% FBS 및 1% 항생제, 1 nM T3 및 20 nM 인슐린을 갖는 DMEM으로 된 유지배지(maintenance medium)로 변경하였다. 세포를 8 일(6 일)동안 배양한 후 2일에 한 번씩 변경시켰다. 또한, 냉각노출(cold exposure) 치료를 위해, 마우스를 7일 동안 25℃(RT) 및 8℃(cold)의 기후챔버(climate chamber)에서 길렀다. 이후, 갈색지방조직을 마우스의 어깨사이부위(interscapular) 영역으로부터 얻었다.

<1-2> 2- DE 분석 비교

상기 실시예 <1-1>의 배양한 갈섹지방세포로부터 단백질을 효과적으로 분리하기 위하여, 2-DE를 second dimension에서 12% 분리 젤로 수행하였다.

구체적으로, 2-DE는 IPG 스트립(pH 3-10, 7 cm)(GE Healthcare, Boston, MA)을 150 ㎕의 재수화 버퍼(rehydration buffer)에 있는 65 ㎍의 단백질로 12 시간 동안 상온에서 재수화하였다. 1차 등전초점조절(One-dimensional isoelectric focusing)을 1 Vhr을 위해서 20 ℃, 200 V, 2800 Vhr을 위해서 3500 V, 및 12,000 Vhr을 위해서 3500 V에서 Multiphor II IEF 시스템(GE Healthcare, Boston, MA)으로 수행하였다. 초점된 스트립을 50 mM Tris-Cl(pH 8.8), 6 M 우레아, 30% (v/v) 글리세롤l, 2% (w/v) SDS 및 브로모페놀 블루(BPB)의 잔여량으로 구성된 평형버퍼(equilibration buffer)로 평형화시켰다. 평형화 전에, 0.1% (w/v) DTT 및 0.25% (w/v) 아이도아세타미드(iodoacetamide(IAA))의 신선한 화학물질을 첨가하였고 15 분 동안 상온에서 배양하였다. 스트립 젤 상의 등전초점조절된 단백질을 Mini-PROTEAN 3 (Bio-RAD) 상에서 12% (w/v) SDS-PAGE 젤에서 분리하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 얻어진 이미지는 Progenesis SameSpot 소프트웨어를 사용하여 분석되었고, 마우스 일차 갈색 지방전구세포(0, 2, 및 6일)의 분화 동안에 일반적 2-DE 프로테옴 스팟 패턴을 나타냈다(도 1).

<1-3> 2- DE 로 얻은 스팟 확인

상기 실시예 <1-2>로부터 얻은 단백질을 식별하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 전기영동 후에 2-DE 분석 젤(n = 9)을 PlusOne Silver 염색 키트 (GE Healthcare, Boston, MA)로 염색하였다. 염색된 젤을 엡손 스캐너(Epson scanner) (ver.2.20E, Epson America, Inc.)를 사용하여 이미지화하였다. 스캔을 2-D 젤 분석 소프트웨어 Progenesis SameSpots version 3.0 (Nonlineardynamics Ltd.)로 진행하였다. 자동화된 스팟 검출 및 매칭 과정을 입증하기 위하여, 이미지를 수동으로 편집하고 스트리크(streak)하고 인공적인 것을 제거하였다. 각각의 스팟을 정량화하기 위하여 모든 젤의 스팟 패턴을 각각의 다른 것에 매치하였다. 스팟의 평균 강도를 Progenesis SameSpot 소프트웨어 내의 정량적, 질적 및 통계적 기능을 사용하여 비교하였다. 633개의 스팟 중에 10개의 단백질 스팟(2.0-배 보다 큰)을 MS 분석을 위하여 선별하였고 스팟상이의 현저한 변화를 Student's t-test를 사용하여 결정하였다. P 값이 <0.05이면 통계적으로 유효함으로 고려되었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 동일한 실험 조건하에서 9개의 젤, 각각의 시료의 3개의 젤을 젤에서 식별되는 633 단백질 스팟과 함께 분석하였다. 단백질 스팟은 10 kDa과 170 kDa 사이의 분명한 분자량으로 3부터 10까지의 pI 값으로 넓게 분포되었다. 젤 매칭 및 분석을 통해, 갈색 지방전구세포의 분화 과정 중에 프로테옴 프로파일은 매우 유사함을 확인하였다. 분화과정 중의 2-DE 맵(maps)에서, 10개의 단백질 스팟은 세 개의 상향-조절되는 단백질, 다섯 개의 하향-조절되는 단백질 및 두 개의 명백히 발현되는 단백질을 포함하여(P < 0.05), 2배 이상의 염색 농도의 변화로서 확인하였다. 확대된 이미지 및 선별된 스팟이 정량적 평가를 나타냈다(도 2).

< 실시예 2> 스팟으로부터 얻은 단백질 식별 확인

<2-1> 질량 분석으로부터 단백질 확인

상기 실시예 <1-3>에서 얻은 스팟에 해당되는 단백질을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 2-D 분석 젤(0 일, 2 일, 및 6 일)에 존재하는 알려지지 않은 10개의 스팟을 선별하였고 스팟 픽커(spot picker)를 사용하여 수동으로 절단한 후 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 각각의 젤 스팟을 인-젤 분해(in-gel digestion)를 수행하였고 분해된 단백질을 nanoACQUITY Ultra Performance LC 시스템 (Waters, Milford, MA)이 장착된 Synapt high-definition mass spectrometer (Waters, Manchester, UK)으로 분석하였다. 펩타이드 용액의 2 ㎕를 75 m × 100 mm Atlantis dC18 컬럼(Waters, Milford, MA) 상으로 주입하였다. 용매 A 는 물에 0.1% 포름산(formic acid)으로 구성되었고 용매 B 는 아세토니트릴(acetonitrile (ACN))의 0.1% 포름산으로 구성되었다. 펩타이드를 100 분 경도(gradients)를 사용하여 초기 분리하였고 유속량 300 nl/분을 갖는 질량분석기로 전기분무(electrospray)하였다. 질량 스펙트럼은 1초 동안 m/z 300-1600로부터 수득되었고, 각각의 1초 동안 m/z 50-1900으로부터 4 개의 데이타-의존적 MS/MS 스캔하였다. MS/MS 절차를 수행하는데 사용되는 충돌 에너지는 펩타이드를 용출하는데 질량 및 전하 상태에 따라 달랐다. (Glu1)-피브리노펩타이드 (Fibrinopeptide)B를 350 nl/min의 속도로 주입하였고 MS 스캔 매 30초마다 1초 동안 수득하였다. 데이타베이스 조사는 파라미터로서 NCBInr. 2012.01.30 데이타베이스, Musmusculus(하우스마우스) 및 트립신에 의해 빗나간 절단 최대 수(maximum number of missed cleavages by trypsin)는 1을 사용하여 MASCOT (매트릭스 Science, London, UK)로 수행되었다. 펩타이드 및 단편(fragment) 질량 내성은 각각 50 ppm 및 0.2 Da으로 맞추었다. 허용된 펩타이드 변형은 고정된 변형 모드의 카바미도메틸레이션(carbamidomethylation)이었다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 단백질의 물리적 특성을 갖고, 상향 또는 하향 조절되며 단백질 기능을 가지는 발현이 상이한 단백질을 확인하였다. 10개의 구별적으로 발현되는 단백질 10개 중, 세 개[프로히비틴(prohibitin(PHB)), 히포작신-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(HPRT)) 및 에놀-CoA 하이드라타제(enoyl-CoA hydratase(ECHS1))]는 갈색 지방전구세포 분화중에 상향-조절되었다(표 1).

또한, 10개의 별도로 발현되는 단백질 중에 다섯 개[트리오세포스페이트(triosephosphate isomerase(TPI)), 연장인자(elongation factor 2(EEF-2)), 알파-트로포마이오신 슬로우(alpha-tropomyosin slow(TPM3)), 엔도필린-B1(endophilin-B1(EndoB1)), 및 코플린-1(cofilin-1; CFL1)]는 하향조절 되었다(표 1).

<2-2> 웨스턴 블랏을 이용한 단백질의 확인

갈색 지방전구세포 분화 과장 동안에 유의적인 차이를 나타내는 몇 가지 단백질의 발현 변화를 2-DE 결과와 비교하기 위하여 웨스턴 블랏 분석 실험을 수행하였다.

구체적으로, 꽉 찬 100 mm 디쉬의 세포를 DPBS로 2회 세척하였다. 세포를 플레이트로부터 분리하고 Pro-Prep 단백질 추출용액(Intron Biotechnology, Daejeon, Korea)에서 -20 ℃에서 20분 동안 배양하였다. 용해되지 않은 세포 펠렛을 제거하기 위해 시료를 13,000 rpm(4 ℃)에서 원심분리하였고 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 분석을 수행하여 단백질 양을 측정하였다. 단백질 시료의 동량을 SDS-시료 버퍼로 준비하였고 95 ℃에서 5 분 동안 끓였다. 단백질을 12% 폴리아크릴아미드 젤에 로딩한 후 100 V에서 1.5 시간 동안 PVDF 멤브린으로 트랜스퍼하였다. 상기 멤브린을 상온에서 1 시간 동안 5% 탈지분유 또는 TBST 버퍼의 BSA로 차단하고 CFL1(ab29038; Abcam), HPRT1 (AV48471; Sigma), EEF-2(ab33523; Abcam), PRX-1(ab15571; Abcam), PHB (ab55618; Abcam) 및 Endo-B1(AB10555; Millipore)에 대하여 4 ℃에서 밤사이 5% BSA의 일차 항체로 배양하였다. 상기 멤브린을 TBST 버퍼로 3회 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체(Amersham)로 프루브(probed)하였다. TBST 버퍼로 세척한 후 단백질 밴드를 (ECL) 시스템(GE Healthcare)으로 시각화하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 대부분의 단백질에 대하여, 웨스턴 블랏 결과는 2-DE의 단백질 발현과 상관관계가 있음을 확인하였다(도 2).

< 실시예 3> 갈색지방생성과정 중의 코플린 -1( CFL1 ) 단백질의 발현 확인

<3-1> 코플린 -1( CFL1 )의 단백질 및 RNA 수준 확인

CFL1이 갈색 지방생성 동안에 유의적으로 발현변화가 나타나는지 확인하기 위하여 일차 갈색 지방전구세포 분화 과정 동안의 CFL1의 단백질 및 mRNA 수준을 평가하였다.

구체적으로, CFL1은 단백질은 상기 실시예 <2-2>의 웨스턴 블랏 방법과 동일하게 수행하였고 RNA는 하기와 같은 방법으로 분리하였다. 총 RNA는 TRIzol® (Invitrogen)으로 배양된 세포로부터 분리되었다. 첫째-가닥 cDNA 합성은 올리고 dT 프라이머 (Invitrogen)을 사용하여 수행되었다. 실시간 PCR은 EvaGreen™ 시약 키트 (SolGent S& C, Seoul, Korea)를 사용하여 CFX96 실시간 시스템 (Bio-Rad)에서 수행되었다. 각각의 분석(세 개씩)은 대조군 cDNA(100 ng부터 100 pg까지의 범위), 템플레이트가 없는 대조군, 및 25-50 ng의 각각의 시료 cDNA를 4 개의 연속적 희석의 표준 곡선을 포함한다. 각각의 평균 값은 유전자 및 하우스키핑 참조 유전자(18S rRNA)의 mRNA 발현을 계산하였다. 각각의 시료의 유전자의 양은 비교(2^-Δ ^CT) 방법을 사용하여 참조 대조군의 유전자의 양으로 표준화하였다. 유전자 명칭과 실시간 PCR 분석에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 표 2에 나타냈다(표 2).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 CFL1은 단백질 및 RNA 수준에서 유도되었고 이들의 수준은 분화의 후기 단계에서 빠르게 감소되었다(도 3A). 또한 냉각 노출 과정에서, 갈색 지방조직의 CFL1 단백질은 감소되었다(도 3B). 따라서, 상기 발현 패턴은 지방생성 및 열발생의 후기 단계에서 CFL1의 잠재적 역할을 가짐을 확인하였다.

<3-2> 코플린 -1( CFL1 )의 과발현에 의한 갈색지방세포 마커 유전자 발현 확인

코플린-1(CFL1)이 과발현되었을 때 갈색지방세포 마커 유전자 발현(UCP-1, PRDM16, PGC-1α 및 PPARγ)을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 전기형질감염 시스템 (Neon™ 형질감염 시스템, Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 FLAG-태그된 마우스 Cfl1(Clone_BU001008, Frontiers Human 유전자 Bank로부터 구입, KRIBB, Daejeon, Korea)가 발현되는 일차 갈색 지방전구세포 세포를 만들었다. FLAG 태그된 Cfl1을 암호화하는 DNA를 pRetroX-IRESZsGreen1 벡터 (Clontech,Mountain View, CA)의 MCS 부위로 도입시키고 분화되지 않은 일차 갈색 지방전구세포(1.5 × 10⁶ 세포)를 100 ㎕의 네온 재현탁 버퍼 R에 재현탁하였다. 각각의 전기천공(electroporation)을 위하여, 세포와 12 ㎍의 DNA를 멸균된 마이크로원심분리 튜브로 엘리쿼트하였다. 네온 팁(Neon tip)을 네온 파이펫에 끼우고 세포-DNA 혼합물을 공기 버블을 피하면서 팁으로 빨아드린 후, 3 ㎖의 네온 일렉트릭 버퍼 E(Neon electrolytic buffer E)로 넣었다. 세포를 전압 1700 및 폭 20으로 한번 펄스하였다. 세포를 20% FBS가 있는 DMEM 배지가 포함된 마트리겔(Matrigel)-코팅된 배양 플레이트로 트랜스퍼하였다.

그 결과, 도 3C에 나타낸 바와 같이 일차 갈색 지방전구세포에서 전기-형질감염에 의한 Cfl1의 단백질 및 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 3C). 상기 Cfl1의 과발현된 세포에서 갈색지방 마커 유전자인 UCP-1, PRDM16, PGC-1α 및 PPARγ의 RNA 발현을 관찰한 결과, 상기 갈색지방 마커 유전자들은 6일 째의 대조군과 비교하여 억제됨을 확인하였다(도 3D). 이는 내인성 Cfl1이 갈색 지방전구세포 분화를 억제함을 나타낸다. 또한, Cfl1이 과발현되는 일차 갈색 지방전구세포 세포에서 지질 축적의 측정을 나타내는 Oil-Red-O 염색 정도가 대조군 벡터가 발현되는 세포와 비교하여 낮음을 확인하였다(도 3E 및 3F). 따라서 이는 Cfl1이 지질 축적을 감소시킴을 나타낸다.

<3-3> 코플린 -1( CFL1 )의 과발현에 의한 액틴 ( actin ) 중합반응( polymerization ) 확인

갈색 지방세포 분화에서 CFL1에 의한 갈색 지방전구세포의 분화를 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CFL1이 액틴(actin) 필라멘트 비 평형 조립(asswmbly) 또는 분해(disasswmbly)의 조절자로서 가장 잘 알려져 있기 때문에 CFL1에 의한 액틴(actin) 중합반응(polymerization)을 측정하였다. 세포를 0.1% 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드 상에서 자라게 하였다. 포스페이트 살린 버퍼(phosphate buffer saline(PBS)에 있는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 10 분 동안 고정시키고 PBS의 1% 트리톤 X-100으로 5 분 동안 투과하였다. 세포를 상온에서 30 분 동안 PBS의 1% 소(bovine) 혈청 알부민으로 차단시키고, 45 분 동안 상온의 어두운 조건에서 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin) (1:40; Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 세포 핵은 10 분 동안 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 표지시키고 염색된 세포를 동일초점현미경(Zeiss LSM 510 Meta)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 코플린-1(CFL1)은 액틴 중합반응(polymerization)을 증가시킴을 확인하였다(도 4). 이는 코플린-1이 갈색 지방세포 분화 과정 중에 갈색 지방의 액틴 중합반응(polymerization)을 통하여 분화 억제 효과를 가짐을 나타낸다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for regulation of brown adipocyte differentiation using cofilin-1 <130> 14P-07-014 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn 1 5 10 15 Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg 20 25 30 Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ile Ile 35 40 45 Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val 50 55 60 Asp Asp Pro Tyr Thr Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys 85 90 95 Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Asn Ala Pro Leu Lys 100 105 110 Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu 115 120 125 Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys 130 135 140 Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser 145 150 155 160 Leu Glu Gly Lys Pro Leu 165 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFL1 Forward <400> 2 caaggatgcc atcaagaa 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFL1 Reverse <400> 3 gtccttgacc tcctcgta 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 Forward <400> 4 ctttgcctca ctcaggattg g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 Reverse <400> 5 actgccacac ctccagtcat t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRDM16 Forward <400> 6 gaagccagtg gagagcaaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRDM16 Reverse <400> 7 gactttggct cagccttgac 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC-1 alpha Forward <400> 8 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC-1 alpha Reverse <400> 9 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Forward <400> 10 caagaatacc aaagtgcgat caa 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma Reverse <400> 11 gagctgggtc ttttcagaat aata 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA Forward <400> 12 cgcggttcta ttttgttggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA Reverse <400> 13 tcgtcttcga aactccgact 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 코플린-1(cofilin-1: CFL1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 코플린-1 단백질을 암호화하는 코플린-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 함유하는, 생체 외(ex vivo)에서 갈색 지방세포 분화 유도용 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 코플린-1은 액틴 중합반응(actin polymerization)을 통해 갈색지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 생체 외(ex vivo)에서 갈색 지방세포 분화 유도용 조성물.
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1) 코플린-1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포주의 코플린-1 단백질의 발현정도를 측정하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 발현정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 생체 외(ex vivo)에서 갈색 지방세포 분화 유도 후보물질의 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 상기 발현정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC), RT-PCR, 웨스턴 블랏 및 유세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 생체 외(ex vivo)에서 갈색 지방세포 분화 유도 후보물질의 스크리닝 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 코플린-1(cofilin-1: CFL1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 코플린-1 단백질을 암호화하는 코플린-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 분리된 갈색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생체 외(ex vivo)에서 갈색 지방세포 분화 유도 방법.